Специальные электрофоретические методы

Оборудование для свободного электрофореза и ультрацентрифугирования достаточно дорого и сложно по своему устройству, что ограничивает широкое применение этих методов. Поэтому возникла идея замены свободного электрофореза (электрофоретического разделения белков в растворе) электрофорезом в специальной поддерживающей среде, который основан на том же принципе, но намного проще в осуществлении. [c.10]

Выше были описаны только основные электрофоретические методы. Кроме них, существует огромное множество их модификаций, приспособленных для специальных целей препаративного разделения в растворе, разделения микроколичеств вещества на ацетат-целлюлозных волокнах, непрерывный электрофорез, электрофорез в сочетании с хроматографией и т. д. Электрофорез является очень щадящим методом на его результаты сравнительно слабо влияют неконтролируемые изменения условий разделения pH, температуры, ионной силы раствора растворы разделяемых веществ практически не разбавляются. Несомненно, что метод находится еще в стадии развития. Особенно это относится к электрофорезу в градиенте плотности и в гелях. [c.106]

Но наиболее предпочтительной схемой электрофоретического разделения является стабилизация слоя электролита в капилляре. Капиллярный вариант электрофоретического разделения известен сравнительно давно, но интерес к нему особенно усилился в последние годы по мере совершенствования техники микро детектирования. Объединение электрофоретического разделения в капилляре с проточными детекторами привело к появлению нового гибридного метода анализа — капиллярного электрофореза. Этому методу посвящен специальный раздел настоящего справочника. [c.244]

Специальные электрофоретические методы [c.127]

Электрофоретический анализ используют для исследования сыворотки крови, смесей белков, нуклеиновых кислот и т, д. Широкое применение получил для изучения биохимически важных объектов вариант электро ретического исследования — метод электрофореза на бумаге. Каплю исследуемого раствора наносят в определенную точку на полоску специальной фильтровальной бумаги, увлажненную буферным раствором (бумага играет роль своеобразного сосуда) концы полоски находятся в контакте с электродами. Подвергнутые электрофорезу составные части, обладающие различной электрофоретической подвижностью, переносятся на различные расстояния. После опыта бумагу высушивают и прокрашивают красителем, проявляя компоненты смеси. [c.207]

Оценка чистоты. — Шведские химики Сведберг и Тизелиус внесли большой вклад в развитие химии белка разработкой аналитических методов, чрезвычайно удобных для характеристики этих, высокомолекулярных соединений. Метод ультрацентрифугирования Сведберга служит для определения молекулярного веса. При вращении с очень большой скоростью ячейки, содержащей раствор белка, молекулы белка под действием центробежных сил движутся от центра со-скоростью, зависящей от величины молекулярного веса. Специальная оптическая система дает возможность наблюдать и фотографировать ячейку во время центрифугирования. Молекулярный вес может быть, найден либо из определения седиментационного равновесия, либо по-скорости седиментации- Хотя теоретически первый метод точнее, для достижения равновесия требуется длительное время, и поэтому более точные значения получают, исходя из определения скорости седиментации. При применении ультрацентрифуги можно установить также гомогенность молекул (по величине и форме). Тизелиус предложил (1937) электрофоретический метод разделения молекул белка в электрическом поле молекула белка движется со скоростью, определяющейся величиной молекулы, ее формой, количеством и типом ионизированных групп. Материал, кажущийся гомогенным по растворимости, может содержать компоненты, отличающиеся по электрофоретической подвижности. Жестким критерием чистоты является профиль кривой распределения, получаемой при противоточном распределении молекул (Крейг, см. 31.29). [c.674]

Метод Гитторфа. Этот метод аналогичен методу, применяемому для определения чисел переноса ионов. Через коллоидный раствор, помещенный в специальный сосуд, пропускают в течение некоторого времени электрический ток и затем в пробах раствора, отобранных из разных мест, аналитически определяют количество дисперсной фазы, переместившейся к одному из электродов. Очевидно, это количество т прямо пропорционально скорости электрофоретического переноса и, концентрации дисперсной фазы с, силе тока / и времени пропускания тока X и обратно пропорционально электропроводности жидкости т. е. [c.207]

Электрофоретическим способом можно нанести на изделие только один слой — грунтовочный. В настоящее время этим способом окрашивают в основном изделия машиностроения, автомобилестроения кузова автомашин, рамы, колеса и т. п.) и отдельные элементы строительных металлоконструкций. Метод требует специальных материалов (грунтовок для электрофореза) и оборудования. [c.89]

Для наблюдения за движением границы применяются два метода, которые основаны на изменении показателя преломления раствора. Применяемый метод чаще всего представляет собой разновидность теневого способа Теплера. С помощью специальной диафрагмы добиваются того, чтобы границы можно было наблюдать в виде теневых полос, изображение которых можно получить на стеклянном экране или на фотографической пластинке. Делая эти наблюдения через различные промежутки времени, можно вычислить скорость движения границы, а следовательно, и электрофоретическую подвижность. Второй способ представляет собой так называемый метод шкалы, при котором фотографируется градуированная шкала, расположенная позади движущейся границы. По смещению линий, соответствующих местам, в которых изменяется показатель преломления, можно судить о положении движущейся границы в любой [c.715]

Электрофоретическая окраска требует применения специальных лакокрасочных материалов, высыхающих при температуре 160—180 °С. Этим методом удается нанести на металл только один слой покрытия толщиной 20—40 мкм. Дальнейшей увеличение толщины покрытия невозможно из-за его большого электрического сопротивления. [c.161]

Органодисперсии требуют меньшего времени сушки, чем водные дисперсии, и легко восстанавливаются даже в отсутствие специальных эмульгаторов благодаря тому, что выбранные органические растворители по плотности близки к полиэтилену. Вязкость органодисперсий выше, чем водных, так как частицы полиэтилена слегка набухают в дисперсионной среде. Содержание полимера в органических дисперсиях колеблется от 3 до 55%. Органодисперсии наносят на черные и цветные металлы методом окунания, распыления, электрофоретического осаждения или вручную — кистью, валками. [c.303]

Обычно в эксперименте измеряют скорость движения макромолекул в электрическом поле. Поскольку отдельные макромолекулы увидеть нельзя, измеряют скорость перемещения фронта белка в растворителе. Положение этого фронта, называемого границей, регистрируется оптическими методами. Позднее мы дадим границе более точное определение. В наши цели не входит изложение вопросов, связанных с техникой проведения электрофоретических экспериментов. Такого рода подробности можно найти во многих специальных руководствах [7]. На рис. 7.8 схематически показана граница (полоса) чистого [c.399]

В 1937 г. Тизелиус [12] предложил новую модель электрофоретического аппарата. Усовершенствование способа создания четких границ раздела с помощью особой кюветы со шлифами, термостатирование ее при 0° С для уменьшения разрушающих границу раздела конвекционных потоков и, наконец, применение специальных оптических систем для регистрации границы раздела по существу означало создание нового метода [13]. [c.21]

Метод струйно-электрофоретического напыления. Метод основан на использовании электрического поля низкого напряжения, при котором возникает коронный разряд между заземленной деталью и специальной электродной сеткой. Частицы полимера, находящиеся во взвешенном состоянии от воздушной или газовой струи, заряжаются на электродной сетке и преодолевают сопро- [c.170]

Эмалирование методом электрофореза. Принципиальная схема процесса электрофоретического эмалирования показана на рис. 11.10. Проволока поступает через устройство для ее предварительной очистки в узел нанесения 7. Обычно проволока служит анодом. При выходе проволоки из узла нанесения с нее удаляется скупочный слой специальным устройством (на рисунке не показано), затем она поступает в печь 10 на термообработку. На этой стадии покрытие состоит приблизительно на 70—90% из полимера, остальное — вода. На качество получаемого покрытия в значительной степени оказывают влияние побочные процессы, проходящие в узле нанесения параллельно с осаждением полимера. Прежде [c.139]

Титр ингибирования определен как фактор разведения, при котором 0,25 мл исследуемого раствора предотвращают агрегирование тремя из четырех гемагглютинирующих доз специального индикаторного вируса равного объема 0,5%-ной суспензии эритроцитов курицы. Всякий раз, когда ингибиторы проверялись измененным методом, их титры приводились к равному масштабу пересчетом. Во всех случаях под действием активного вируса гриппа или РРФ титр уменьшался более чем на 98%. Электрофоретическая подвижность определена в пределах рН7 —8. [c.249]

Гель-хроматография — простой, но чрезвычайно эффективный метод, позволяющий определять размеры молекул, а также фракционировать молекулы на основе различий в размерах. Молекула, которая не может проникать в поры молекулярного сита, движется быстрее вдоль колонки, чем молекула меньших размеров. Еще одним чрезвычайно полезным инструментом, применяемым для очистки и качественного анализа смесей макромолекул, служит электрофорез. Довольно трудно получить аналитическое выражение, связывающее наблюдаемую в опыте электрофоретическую подвижность с зарядом и формой молекулы. Однако в некоторых специальных случаях электрофорез лает количественную информацию. Пользуясь методом изоэлектрического фокусирования, находят pH изоэлектрических точек белков. А воспользовавшись электрофорезом в носителе, представляющем собой молекулярное сито, можно крайне просто определять молекулярную массу белков (в присутствии ДСН) или нуклеиновых кислот. [c.306]

Оборудование, необходимое для электрофореза, состоит в основном из двух частей источника питания и собственно электрофоретического блока. Описываемое здесь оборудование применяется для работы с низким напряжением. Высоковольтный электрофорез — более специальный метод он рассмотрен в разд. 4.4.1. [c.119]

ДНК, подвергают одновременному электрофорезу на параллельных дорожках одной пластины геля. Сканируя каждую дорожку, расщифэовывают всю последовательность. Используя специальные электрофоретические методы, можно разделить цепи размером от 1 до 300 или более нуютеотидных остатков. Молекулы, длина которых превыщает несколько сотен нуклеотидов, фрагментируют (обычно с помощью рестиктирующих эндонуклеаз или путем субклонирования) и затем определяют нуклеотидную последовательность каждого фрагмента. [c.321]

Наряду с электрофоретическим методом нанесения антикоррозионных, лакокрасочных, декоративных, антифрикционных покрытий на. поверхности электропроводящего тела предложен диффузиофоретический метод. Его преимущество состоит в том, что он не связан с расходом электроэнергии и пригоден не только для проводящих тел. В основе метода лежит диффузиофоретический транспорт на поверхность, инициируемый протекающей на поверхности химической реакцией. Например, таким образом получены диффузиофоретические покрытия на поверхности медной подложки при добавке в бутадиенстирольный латекс электролита специального состава. [c.256]

В статьях настоящего сборника представлены основные современные методы анализа белков и аминокислот. Сводные обзоры этих методов даны в статьях П. Кирка Химическое определение белков и особенно А. Мартина и Р. Синджа Аналитическая химия белков . Последующие три статьи Э. Снелла Микробиологические методы анализа аминокислот , А. Тизелиуса Адсорбционный анализ смесей аминокислот и Г. Свенссона Препаративньи электрофорез и ионофорез , специально посвящены трем группам методов, получившим за последние годы особенно большое значение. Необходимо, однако, отметить, что теория хроматографических и электрофоретических методов анализа разобрана в этих статьях недостаточно. Кроме того, в статьях сборника неполно представлены изотопный и спектрофотометрические методы анализа. В статье С. Фокса Конечные аминокислоты в пептидах и белках рассматривается весьма важный для изучения структуры белков, но, как видно из материала статьи, еще очень слабо изученный вопрос о конечных группировках полипептидных цепей. Две заключительные статьи сбор- [c.10]

НО И ДЛЯ препаративного применения электрофоретического метода. Схема нового прибора показана на рис. 39. Следующие его особенности должны быть специально отмечены как ценные с препаративной точки зрения [c.277]

В процессе работы над книгой мы вскоре поняли, что критическая оценка преимуществ и недостатков отдельных методов принесет читателю больше пользы, чем простое перечисление лабораторных прописей. Тем не менее некоторые наиболее важные процедуры описаны весьма детально, что позволит легко воспроизвести их в экспериментальной работе. Для специальных же методик указаны лишь самые существенные моменты, а подробности читатель сможет найти в соответствующих оригинальных работах. В главах, посвященных методам выделения различных групп белков, нуклеиновых кислот и глпкоз-аминогликанов, мы стремились показать, что применение того или иного приема фракционирования обусловлено свойствами разделяемых макромолекул данного типа. Во многих случаях выбор электрофоретического метода зависит от способов выделения и очистки анализируемого образца а стадиях, предшествующих электрофорезу, так как именно эти стадии сущест- [c.8]

В некоторых случаях, например когда в результате длительной очистки удается получить лишь очень малые количества материала ИЛИ при необходимости исследовать компоненты отдельных клеток, приходится прибегать к микроварианту электрофоретического разделения белков и нуклеиновых кислот. В то же время микроанализ в полиакриламидном геле сам по себе обладает рядом преимуществ. Так, более короткое время, затрачиваемое на проведение электрофореза, а также на окрашивание и обесцвечивание гелей, делает применение микроанализа целесообразньгм даже тогда, когда материала вполне достаточно для макроварианта. Микрометодика при наличии определенного опыта едва ли намного сложнее обычного диск-электрофореза, хотя требует такого специального оборудования, как микропипетки, микроманипулятор, лупа и микроденситометр. Читатели, интересующиеся деталями этого метода, могут обратиться к монографии Нейхоффа [915], в которой поми мо электрофореза освещены и другие виды работ с микроколичествами материала (гомогенизация, диализ, фотометрия, центрифугирование в капиллярах и т. д.). [c.107]

А. Тизелиус разработал метод изучения электрофоретической подвижности белков. От прибора, предназначенного для изучения лиозолей (см. рис. 34, а), прибор Тизелиуса отличается некоторыми конструктивными особенностями. Наиболее существенное из них — применение разъемных кювет прямоугольного сечения. Этим достигается возможность наблюдения за движением неокрашенных в видимой области белков с помощью специальных оптических систем. Концентрация белков на различных участках прямоугольной ячейки регистрируется по изменению показателя преломления. Изучение градиента показателя преломления при электрофорезе дает возможность проводить качественный анализ смеси белков и их препаративное разделение по различию электрофоретической подвижности. Этот метод назван свободным электрофорезом. [c.216]

После электрофоретического разделения белковые фракции можно фиксировать в поддерживающей среде и выявить с помощью специфического окрашивания. Среди многочисленных методов окрашивания особое значение в клинических исследованиях приобрели способы выявления связанных с белками липидных и углеводных компонентов. Благодаря простоте этих методов анализ липо-протеидов и гликопротеидов стал обычным в повседневной клинической практике. Он приобрел большое значение в диагностике некоторых заболеваний, а это позволило значительно продвинуться в выяснении их патогенеза. Специальные методы окрашивания помогают также обнаружить трансферрин, гаптоглобин, церуло-плазмин и другие компоненты сыворотки. [c.11]

При зональном электрофорезе необходимо принимать специальные меры для предотвращения конвекционного перемешивания зон. Это достигается применением поддерживающих пористых сред различных гелей, порошков, бумаги и т. д. В последнее время начал распространяться метод зонального электрофореза, в котором роль поддерживающей среды играет так называемый градиент плотности. Поддерживающая среда влияет на скорость электрофоретического перемещения, притом часто неконтролируе- [c.41]

Метод струйно-электрофоретического напыления. Метод ос нован на использовании электрического поля низкого напряжения, при котором возникает коронный разряд между зазем.лен-ной деталью и специальной электродной сеткой. Частицы полимера, находящиеся во взвешенном состоянии от воздушной или газовой струи, заряжаются на электродной сетке и преодолевают сопротивление мелкоячеистого фильтра лишь при возникновении электрического поля между электродной сеткой и деталью. Заряженные частички порошка осаждаются на холодной поверхности детали и удерживаются на ней продолжите.чь-ное время, что позволяет их оплавить любыми средства.ми. [c.257]

Радиоактивные метки применяют также и в электрофоретических разделениях, причем методы регистрации активности в основном не отличаются от используемых в БХ и ТСХ. Электрофорез в полиакриламидном геле является единственным исключением. В этом случае требуется применение специальных методов. В связи с этим в гл. 5 рассматриваются отличия радиоэлектрофореза от радиохроматографии. [c.10]

Сущность первого метода заключается в непосредственном измерении скорости передвижения коллоидных частиц под действием пбЬтоянного электрического поля в специальном приОоре — электрофоретической трубке. На рис. 176 показан один из наиболее простых электрофоретических приборов. Стеклянная трубка аппарата на всем протяжении и в кранах А и Ai имеет совершенно одинаковый просвет. Фигурно изогнутые концы трубки служат для погружения агаровых сифонов, присоединяемых к источнику электричества через промея ул очные сосуды. [c.409]

Наиболее распространено разделение белков электрофорезом, основанным на различиях зарядов макроионов. Скорость движения макроионов зависит от из заряда, градиента напряжения электрического поля и вязкости среды. А. Тизелиус разработал метод изучения электрофоретической подвижности белков с помощью прибора, схема которого изображена на рис. 95. От прибора, предназначенного для изучения лиозолей (см. рис. 47), он отличается некоторыми конструктивными особенностями. Наиболее существенное из них — применение разъемных кювет прямоугольного сечения. Этим достигается возможность наблюдения за движением неокрашенных в видимой области белков с помощью специальных оптических систем. Концентраиля [c.208]

Принципы и техника электрофореза не требуют специального описания [14—16]. Обнаружение одиночного пика при двух или трех достаточно далеких значениях pH является признаком гомогенности. Применение для этой цели интерференционной онтики менее удовлетворительно, несмотря на ее высокую чувствительность, поскольку полученная кривая требует дифференцирования. Электрофоретическая подвижность зависит как от заряда молекулы, так и от гидродинамического сопротивления, причем оба эти фактора независимы. Они могут компенсироваться, давая в результате одинаковую подвижность для двух физически совершенно различных молекул, по это не может происходить при различных значениях pH. Поэтому важно проверить устойчивость гликопротеина в изучаемом интервале pH многие гликонротеины неустойчивы, особенно при высоких pH [17—19]. Полезная дополнительная информация может быть получена, если гликопротеин содержит заметные количества концевой сиаловой кислоты. В таких случаях заряд молекулы онределяется главным образом этим компонентом, и в большинстве случаев сиаловую кислоту можно почти полностью удалить с помош ью нейраминидазы. Если используемое количество фермента таково, что его можно обнаружить при последуюш,ем электрофоретическом анализе, фермент лучше сначала удалить, если это можно сделать удобным способом. Часто для этого пригодна гель-фильтрация. Молекулярный вес нейраминидазы холерного вибриона составляет около 9 -10 (Лэйвер [20]). Если после обработки нейраминидазой наблюдается два или более электрофоретически различных компонента вместо одного, наблюдавшегося перед обработкой, это значит, что материал, несмотря на его электрофоретическую гомогенность, содержит молекулы, различающиеся по химической природе остатков, от которых зависит заряд молекулы. Эта процедура может повысить степень полидисперсности, если реакция пе доведена до конца, но она не будет превращать гомогенные препараты в гетерогенные. Очевидно, важно убедиться, что используемая нейраминидаза не обладает никакой иной ферментативной активностью, особенно протеолитической. Описаны методы получения нейраминидазы необходимой чистоты [21, 22]. Проверке по этому способу был подвергнут а1-кислый гликопротеин человека [23], после обработки нейраминидазой наблюдалось два электрофоретических ника, несмотря на кажущуюся гомогенность необработанного материала в широком интервале рЬ1. [c.45]

Электрофоретическое разделение исследуемых веществ можно также осуществлять на пластинах полиакриламидного геля размерами ЮОХЮО мм при толщине слоя геля от 1 до 3,5 мм. Пластины с углублениями для внесения образцов приготавливают на особых подставках. Для проведения электрофореза требуется специальное оборудование. Конструкция прибора позволяет устанавливать пластины в вертикальное положение при этом канавки для образцов должны быть расположены у верхнего края пластины и контактировать с верхним буфером, тогда как противоположный край пластины должен находиться в контакте с нижним буфером. Необходимо обеспечить циркуляцию охлаждающей жидкости по поверхности пластины с обеих ее сторон. Основное достоинство этой системы заключается в том, что она позволяет проводить одновременное разделение нескольких образцов в одинаковых условиях, благодаря чему их легко можно сравнивать между собой. Считается, что пластины легче анализировать с помощью денситометра, однако для этого необходимо иметь специальный прибор. Кроме того, пластинки можно без особого труда разрезать на полоски и проанализировать их на наличие различных компонентов путем окрашивания или определения радиоактивности. Полоски можно также высушивать и хранить. Однако для приготовления пластин требуется больше акриламида, особенно если анализируется немного образцов. Как и в случае электрофореза в трубках, для данного метода разработан целый ряд однородных и неоднородных ( прерывистых ) буферных систем. Здесь применяются те же способы приготовления гелей, методики разделения и анализа, что и при электрофорезе в трубках. [c.265]

Для получения препаратов высокоочищенного кининогена применяют метод элюции белка с геля после электрофоретического разделения препарата. Используют либо упомянутую стандартную систему Дэвиса, либо разделяют белки по методу Шапиро (Shapiro е. а., 1967) в специально подобранной системе. В последнем случае 3 мг препарата кининогена, полученного из фракции 46 (15 Е/мг), растворяют в 1,5 мл 0,1% раствора додецилсульфата натрия (SDS), выдерживают 12 ч при 37°С, наносят на 12 колонок (6ХЮ0 мм) с 8,5% гелем, приготовленным на 0,1 М трис-НС1 буфере (pH 8,0), содержащем 0,1 % SDS, и подвергают электрофорезу в аппарате фирмы Reanal Модель 69 при силе тока [c.178]

Желание экспериментаторов хоть как-то оградить себя от вредного воздействия радиоактивности повлекло за собой выявление полос ДНК как колориметрическими, так и хемилюминесцентными методами. Однако эффективное проведение таких реакций возможно только с фрагментами ДНК, сорбированными на поверхности какого-нибудь твердого носителя, а не находящимися внутри полиакриламидного геля. Чисто технические трудности переноса фрагментов ДНК из секвенирующего полиакриламидного геля на нейлоновые, нитроцеллюлозные или какие-то другие мембранные фильтры заметно сдерживали развитие этого подхода. Разработка специальных приборов для секвенирующего электрофореза с одновременным переносом выходящих фрагментов ДНК из нижнего среза геля на находящийся в соприкосновении с ним движущийся мембранный фильтр заметно упростила процедуру переноса (более подробно такие приборы вместе с особенностями переноса фрагментов ДНК, а также другие способы переноса рассмотрены в главе, посвященной электрофоретическому разделению секвенируемых фрагментов ДНК). [c.105]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология