Метка флуоресцирующая

К 5 -концу каждого праймера. В качестве красителей часто используют флуоресцеин и родамин, которые испускают зеленый и красный свет соответственно. После ПЦР-амплификации ДНК-мишени проводят разделение флуоресцеин-ме-ченного праймера и продуктов амплификации, после чего регистрируют включение метки (рис. 9.5). Если ДНК-мишень в образце отсутствует, то не будет образовываться и флуоресцирующий продукт. [c.191]

Необходимы тонкие (несколько мкм) пробы, желательны флуоресцирующие метки для увеличения контрастности [c.82]

Необходимо уточнить методы, используемые в экспериментах подобного типа. В большинстве работ с меткой С выделяются только специфические метаболиты, в то время как общая картина превращения отдельных соединений остается неясной. В исследованиях без метки можно испытать много метаболитов, однако трудно индентифицировать некоторые фенольные производные. В то время как эфиры глюкозы и я-кумаровой или феруловой кислот имеют свободные фенольные гидроксильные группы и легко идентифицируются на хроматограммах (флуоресценция в ультрафиолетовом свете), гликозиды этих фенолокислот определить сложнее, так как большинство из них не флуоресцирует [99]. [c.209]

Метки уже в течение многих лет применялись при исследовании биологических систем. Природа меток весьма разнообразна от радиоактивных изотопов до флуоресцирующих или окрашенных молекул. Обычно метки стараются поместить вблизи или непосредственно в активном центре белка. В экспериментах по ЭПР используют свободнорадикальные заместители (спин-метки). Преимущества их таковы 1) эти метки чувствительны к локальному окружению, 2) с их помощью можно исследовать очень быстрое молекулярное двил<ение, 3) диамагнитное окружение не создает помех при регистрации спектров ЭПР и 4) в настоящее время в продаже имеется большой выбор соединений, которые можно использовать в этом качестве [445]. [c.420]

Молекулы, обладающие высокой флуоресцирующей способностью, могут быть обнаружены в растворах таких низких концентраций, как 10 М. Рассеянный свет с длиной волны, равной длине волны начального пучка, не мешает определению, так как может быть отфильтрован. Молекулы многих флуоресцирующих веществ содержат ионогенные или химически реакционноспособные группы, благодаря чему они способны образовывать комплексы с определенными макромолекулами, и в особенности с биополимерами. Метод флуоресценции широко используется для обнаружения структур при цитологических исследованиях [1]. В последнее время комплексы флуоресцирующих молекул и белков были успешно использованы в иммунологии в качестве метки [2]. В этом отношении несколько отстает применение флуоресцентной техники для физической характеристики макромолекулярных систем, хотя с помощью флуоресценции можно обнаружить микроскопические релаксационные процессы в полимерах как в растворе, так и в конденсированном состоянии. [c.169]

Принцип использования флуоресцирующих антител был приспособлен и для электронной микроскопии антитела или гаптены соединяются с электроноплотными веществами (например, с железосодержащим белком ферритином) или такими, которые могут быть сделаны электроноплотными уже после реакции антиген — антитело (например, с антителом связывается пероксидаза из хрена, которой после связывания дают возможность реагировать с диаминобензидином). На практике используется множество комбинаций, включающих антисыворотки с различными специфичностями, фрагменты антител, гаптены, а также такие маркеры для визуализации, как небольшие вирусы и т. п. Эти методы, применимые к целым бактериям, позволяют локализовать поверхностные антигены точнее, чем это делают с помощью оптического микроскопа. Преимущества электронной микроскопии становятся еще более очевидными, когда меченые антитела применяют еще до фиксации, заливки и приготовления срезов, так что метка видна в тонких срезах. В некоторых случаях аналогичным образом метят не антитела, а другие вещества с известной специфичностью чаще всего применяются лектины растений, такие, как конканавалин А, которые специфично связываются с сахарными остатками [88]. [c.125]

Существуют три основных методических подхода для решения этой задачи. Первый способ — избирательное окрашивание нейронов, выделяющих определенный нейромедиатор, может осуществляться с помощью преобразования естественного медиатора в его флуоресцирующее производное. В этом случае флуоресценция определенных групп клеток поможет выявить специфические связи в структурах мозга. Второй экспериментальный подход связан с введением молекул медиатора, предварительно меченного радиоактивным изотопом. Нейронные окончания, содержащие исследуемый медиатор, способны избирательно захватывать метку. Затем их легко выявить методом авторадиографии. Третий способ обнаружения специфических связей в нервной системе состоит в использовании высоко специфичной способности узнавать либо антигенные детерминанты медиатора, либо определенные ферментные белки, участвующие в метаболизме нейромедиаторов, либо нейрорецептор-ные компоненты на мембране клетки. Последние считаются наиболее убедительным свидетельством в пользу существования конкретных нейрохимических взаимодействий межцу клетками и зонами мозга. Обычно для иммунохимической идентификации используют флуоресцентный краситель или изотоп, который маркирует антитела. В последние годы широко распространились методы, использующие антитела, меченные частицами тяжелых металлов, например коллоидного золота, железа и др. [c.224]

В качестве метки используются различные вещества радиоактивные изотопы или Н, ферменты или их субстраты, флуоресцирующие красители. Очевидно, что от чувствительности детекции маркера зависит чувствительность метода анализа. [c.107]

Значительно более прецизионный подход основан на титровании активных центров иммобилизованных антител меченым антигеном. В качестве метки целесообразно использовать низкомолекулярные соединения (изотоп, флуоресцирующий краситель, кофактор и т. д.), чтобы в максимальной степени снизить вероятность экранирования меткой антигенных детерминант. Суть метода заключается в насыщении микроколичеств иммуносорбента меченым антигеном. Получаемая в результате опыта изотерма адсорбции позволяет вычислять концентрацию и константы связывания иммобилизованных молекул антител. Так как в подобном эксперименте определяется не абсолютная концентрация активных центров антител, а концентрация центров, доступных для взаимодействия с антигеном, следует ожидать, что эта величина будет различной для антигенов с разными размерами и молекулярной массой. Например, при иммобилизации антител разной специфичности часть центров может экранироваться носителем от контакта с макромолекулярным антигеном, но быть доступной для низкомолекулярного. [c.218]

Интенсивность флуоресценции обычных оснований нуклеиновых кислот очень мала, хотя некоторые минорные основания (например, основание V) флуоресцируют достаточно сильно, что позволяет проводить рутинные измерения. Слабость собственной флуоресценции оснований поначалу обескураживала, но во многих случаях она обернулась благом. Один из подходов к решению подобной проблемы состоит в присоединении к системе флуоресцентной метки — интенсивно флуоресцирующего хромофора, который специфически связывается с исследуемым объектом или ковалентно присоединяется к нему. [c.93]

В настоящее время существует множество вариантов как метода Максама — Гилберта, так и метода Сэнгера. Главное, эти методы удалось полностью автоматизировать. Так, например, при секвенировании ДНК по Сэнгеру на 5 -конец праймера вводят флуоресцентные метки, причем для каждого из четырех анализируемых нуклеотидов используются флуоресцирующие агенты с различными спектральными характеристиками. После электрофоретического разделения гель сканируется при четырех различных длинах волн и полученная информация сразу обрабатывается на ЭВМ. При этом все биохимические операции также проводятся роботом. [c.19]

Непрерывно разрабатываются новые флуоресцентньш зонды, чтобы покрыть все более широкий спектр и приспособиться к потребностям специфических длин волн. В табл. 7.9-3 суммированы некоторые из них. Весьма чувствительными флуорофорами ивляются гидроксильные производные кум фи-на (умбеллифероны), которые открывают широкие возможности для получения различных флуоресцентных свойств. Многие из производных этого ароматического фенола, такие, как фосфаты, гликозиды и др., не флуоресцируют, ио флуоресцирующие частицы могут быть получены при их гцлролизе это свойство также можно испольэовать в иммунном анализе с меткой, как уже обсуждалось ранее. [c.588]

К флуоресцентным измерениям имеет очевидное преих щесгво более сильного сигнала в сравнении с обычной флуорофорной меткой, поскольку каждая ферментная метка создает много флуоресцирующих молекул. [c.598]

Флуоресцеин (Fluores ein) Флуоресцирующий краситель, часто использующийся в качестве метки для антител. Позволяет визуализировать антитела после их связывания с антигеном. [c.563]

Если радикал R содержит спектроскопическую, поглощающую вне области поглощения РНК (т.е. при Л > 300 нм), флуоресцирующую или радиактивную метку, то процедура позволяет определить молярную концентрацию концевых групп, т.е. общее число молекул РНК, а следовательно, и молекулярную массу. [c.267]

Другой метод, не связанный с присутствием в белке остатков триптофана, тирозина и фенилаланина, состоит во введении в белок флуоресцирующей метки, например, с помощью флуо-ресцеинизотиоцианата или 5-диметиламинонафталинсульфохло-рида (ДНС-хлорида). Метод применялся для введения флуоресцентной метки в антитела [81, 82], которые затем использовали для обнаружения антигенов. [c.459]

Небезынтересно применение в криминалистике метода метки вещей и хранилищ порошками с целью выявления хищений. Значительное разнообразие веществ, способных флуоресцировать ярким светом, позволяет иодбирать порошки, которые, будучи нанесены на предметы, остаются незаметными. Между тем под ультрафиолетовыми лучами они легко определяются и на вещах, и на руках человека, с ними соприкасавшегося. [c.330]

Флуоресцируюш ий метчик должен специфически связываться с изучаемым веш,еством и не должен связываться с другими сопутствующими веществами. Это требование особенно существенно в медицинской диагностике, иммунофлуоресценции и люминесцентной цитохимии, где специфичность связывания метчика с изучаемым веществом, тканью или клеткой целиком определяет пригодность его для целей специфического обнаружения. Во всех подобных случаях необходимо проводить тщательный контроль, позволяющий убедиться в том, что весь метчик действительно специфически связался, а не связанный удален из среды. Особую ценность при этом имеют метчики, которые не флуоресцируют в растворенном состоянии и начинают флуоресцировать только после связывания с изучаемым веществом. Таким свойством обладает 1-диметиламинонафталин-5-сульфо-хлорид (дансилхлорид), применяемый для метки белков. Еще лучшим метчиком оказался флуорескамин (I), флуоресцирующий только после связывания с аминокислотами и б елками [13] [c.291]

Другим реагентом, используемым в качестве метки, позволяющей идентифицировать М-концевой остаток, служит дансилхлорид (рис. 6-7), который реагирует со свободной а-аминогруппой и дает дансильное проюводное. Последнее интенсивно флуоресцирует, вследствие чего его можно обнаружить и измерить при значительно более низких концентрациях, чем динитрофенильные производные. [c.148]

Образцы нитрофлуоресцеинов, полученные из диацетатов с т. пл. 224—225° (I изомер) и 219—220° (II изомер), обычно являются хроматографически чистыми и не содержат примеси изомера либо других красителей. Примесями, наиболее часто сопутствующими аминофлуоресцеину I, являются вещества, дающие розовые пятна с / у О и 0,05, флуоресцирующие зеленым в ультрафиолете, и вещество, дающее пятно с Rf 0,22—0,25, флуоресцирующее в ультрафиолете голубовато-зеленым светом. Образцы аминофлуоресцеина I, полученные восстановлением нитрофлуоресцеина гидразингидратом в присутствии никеля Ренея, часто содержат большое количество вещества, дающего оранжево-красное пятно около старта (не флуоресцирующее в ультрафиолетовом свете). В препаратах флуоресцеинизотиоцианата обычно содержатся примеси аминофлуоресцеина и веществ, пятна которых на хроматограмме располагаются около старта (чаще всего три пятна с зеленой флуоресценцией в ультрафиолете). Однако целый ряд образцов, оказавшихся непригодными для метки белков, содержит большое количество примесей, иногда дающих на хроматограмме полосы, тянущиеся от старта к фронту. [c.169]

Ход определения. К навеске 10 г экстракционной фo фopнoi кислоты или отфильтрованной пульпы, взятой с точностью до 0,001 г, добавляют 100 мл воды и пропускают через колонку (высота 200— 220 мм, диаметр 20—24 мм), наполненную 40 г катионита КУ-2 со скоростью 8—10 мл/мин. Колонку промывают 250 мл воды. Кальций элюируют, пропуская последовательно с той же скоростью 150 мл соляной кислоты (1 3) п 150 мл воды. Элюат собирают в стакан емкостью 500 мл, подогревая до 70—80 °С, и при тщательном перемешивании прибавляют к нему по каплям раствор аммиака до слабого запаха. Стакан оставляют на несколько минут в теплом месте для коагуляции осадка. Раствор быстро пропускают через фильтр белая лента и осадок промывают 5—6 раз горячей водой. Фильтрат и промывные воды собирают в мерную колбу емкостью 500 мл, доводят до метки водой и перемешивают. В коническую колбу емкостью 250 мл помещают 50 мл раствора, добавляют 25 мл 20%-ного раствора едкого кали, на кончике шпателя флуорексон и титруют (на черном фоне) 0,05 н. раствором ЭДТА из микробюретки до перехода от флуоресцирующего салатно-зеленоватого до оранжевого оттенка. После добавления каждой капли титранта раствор тщательно перемешивают. [c.118]

При перегонке дифенил и цитрусовые масла собирают в небольшом объеме гептана, который осторожно переводят в мерную колбу и доводят до стандартного объема. В качестве подложки для тонких слоев были выбраны стеклянные полосы размером 13X136 мм, равномерность толщины которых проверялась микрометром. Слои кремневой кислоты, содержащие связующее (крахмал) и флуоресцирующие добавки (сульфид цинка-кадмия и силикат цинка), наносят вручную шпателем, используя направляющие для регулирования толщины слоя. Имеющееся в продаже устройство для нанесения слоя не обеспечивает удовлетворительного качества последнего, поскольку даже небольшие колебания в толщине слоя вызывают колебания фонового поглощения. Содержание фоновых примесей, поглощающих в УФ-области, уменьшают, проводя предварительное элюирование активированных полос 95 %-ным этанолом, который смещает эти примеси к верхнему краю полоски. После обработки этанолом полоски сушат 4 мин при 85 °С в печи с принудительной циркуляцией воздуха и охлаждают в эксикаторе. Пробы наносят на хроматографическую полосу с помощью дозирующего микрошприца [37], позволяющего наносить 0,1 мкл раствора. (Это устройство поставляется отделом снабжения главной лаборатории.) Чтобы избежать потерь, обусловленных испарением, стеклянные соединения колпачка иглы и поршня шприца покрывают водорастворимой смазкой [38]. Полосы элюируют на расстоянии 10 см очищенным петролейным эфиром (т. кип. 30—60°С), в котором Rf дифенила равно 0,45, что обеспечивает хорошее отделение дифенила от углеводородов цитрусового масла, движущихся вблизи фронта растворителя. Дифенил, проявляющийся в УФ-свете в виде темного пятна на флуоресцирующей полосе, маркируют, соскребают шпателем площадку адсорбента длиной 22 мм и шириной, равной ширине полосы, с пятном дифенила в центре и помещают в воронку с пористым стеклянным фильтром. Дифенил элюируют непосредственно в 3-миллилитровые мерные колбы 95 %-ным спиртом, доводят объем раствора до метки и измеряют поглощение на спектрофотометре в области 248 нм. В показания вносят поправку, учитывая средние данные нескольких холостых опытов количество дифенила определяют по исправленным значениям плотности и по стандартной кривой, показанной на рис. 11.1. Эту стандартную кривую строят по данным, полученным для различных проб плодов, в которые предварительно добавляют [c.332]

Неожиданная возможность изучать белки кинетохора у млекопитающих появилась, когда стало известно, что у больных некоторыми формами склерооермы (болезни неизвестной природы, связанной с прогрессирующим фиброзом соединительной ткани кожи и других органов), образуются антитела, специфически реагирующие с кинетохорами. Если такие антитела с флуоресцентной меткой использовать для окрашивания делящихся клеток, получается определенный рисунок флуоресцирующих пятен, каждое из которых отмечает положение кинетохора. Такой же пятнистый рисунок создается и в неделящихся клетках при этом число пятен в клетке соответствует числу ее хромосом (рис. 13-53), и можно думать, что какой-то предшественник кинетохора связан с каждой центромерой даже в интерфазном ядре. Антитела склеродермы сделали также возможным клонирование генов, кодирующих некоторые из [c.446]

Целый ряд флуоресцирующих молекул обладает очень интересным свойством в водных растворах наблюдается практически полное тущение их флуоресценции, зато в неполярном или жестком окружении интенсивность флуоресценции существенно возрастает (в 20 и более раз). Если флуоресцентная метка связывается с жестким или неполярным участком молекулы белка или нуклеиновой кислоты, то спектр флуоресценции определяется в основном меткой, находящейся в связанном состоянии. На рис. 8.17 приведен типичный пример такого рода. В случае белков среди меток, чувствительных к окружению, чаще всего используется краситель 8-анилинонафтилсульфонат, для нуклеиновых кислот такой меткой является этидий. В водных растворах этот краситель флуоресцирует очень слабо, но при встраивании в двухцепочечные участки нуклеиновых кислот интенсивность его флуоресценции резко возрастает. При фиксированной суммарной концентрации флуоресцентной метки изменение числа центров связывания или прочности связи приводит к существенным изменениям в наблюдаемой флуоресценции, что позволяет проводить прецизионные исследования разнообразных интересных явлений. [c.96]

Показано, что из известных в настоящее время неизотопных меток некоторые ферменты, флуоресцирующие и хемилюминесци-рующие соединения способны обеспечивать большую удельную активность, чем 1, а следовательно, и более высокую чувствительность анализа. К тому же нерадиоактивные метки выгодно отличаются большей устойчивостью и безопасностью. Уже сейчас ясно, что какие бы аргументы ни приводились ранее в пользу изотопных меток, в будущем предпочтение будст отдано именно неизотопным меткам в силу свойственных им преимуществ. [c.179]

Меньшие значения рК а-аминогрупп в белках по сравнению с 8-аминогруппами остатков Lys позволяют осуществлять специфическое аминоацилирование N-концов полипептидов при умеренно кислых значениях pH реакционной смеси [49]. С использованием другого химико-ферментативного подхода также удается вводить в белки сайт-специфическую метку [50]. В этом случае на первом этапе с помощью протеинкиназы и аналога [АТР]-у-8 осуществляют специфическое присоединение к полипептидной цепи тиофосфатной группы, которую далее S-алкилируют флуоресцирующим зондом. Таким способом была получена, в частности, меченая протеинкиназа А [51]. [c.307]

Первый подход заключается в том, что вместо Р-нуклеотида в ДНК-зонд внедряется химически модифицированный нуклеотид, например, биотинированная duTP, аналог dTTP. Модифицированные нуклеотиды внедряются стандартным способом, например ник-трансляцией, но с меньщей скоростью. Гибридизованный ДНК-зонд с биотиновой меткой детектируют по его взаимодействию с биотин-связы-вающими белками, такими как авидин или стрептавидин, в комплексе с ферментами, например пероксидазой хрена, кислой и щелочной фосфатазой, дающими окращенные продукты, или же с помощью системы двойных антител, используя сначала антибио-тиновые антитела и затем флуоресцирующее вторичное тело. [c.75]

Авторы [20] предложили способ определения биологически активных веществ на основе конкурентного связывания этих веществ и их аналогов с флуоресцирующей меткой со специфическими рецепторами. В миниатюризованном варианте этой системы пробиркой является полое диализное волокно, в которое вставлено оптическое волокно, служащее для контроля спектроскопических изменений. Важная особенность метода заключается в том, что он является безреагентным. Используемые в системе реакции обратимы, а реагенты представляют собой высокомолекулярные соединения, удерживаемые в реакционной зоне диализной мембраной. Таким образом, система является замкнутой и не требует регенерации. [c.505]

Сейчас, однако, рассматриваемый рынок входит в период медленного упадка вследствие появления аналитических методов, главным образом связанных с использованием ферментных и флуоресцирующих меток для антител. Достоинствами этих новых методов являются удобство в обращении, простота хранения и транспортировки веществ, более низкая стоимость оборудования. Тем не менее отказ от радиоиммуноаналитических методов будет происходить медленно из-за больших капиталовложений в гамма-счетчики и подготовку персонала. Действительно, методики радиоиммуноанализа все еще составляют не меньше 40% рынка иммуноаналитических методов в США, несмотря на то что ферментные метки были созданы почти десять лет назад. [c.582]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология