Спин-метки

Так как молекулы фосфолипидов диамагнитны, для ЭПР-исследований биомембран используются спин-зонды и спин-метки - молекулы или молекулярные группы с неспаренными электронами. Формула одного из таких соединений, часто используемого при ЭПР-спектроскопии мембран, дана на рис. 1.7. [c.19]

Было найдено, что скорость этой реакции зависит от молекулярного окружения спин-метки, что открывает возможности развития кинетического аспекта метода спин-меток. [c.12]

Поскольку влиянием теплового движения молекул белка в растворе на спектры ЭПР парамагнитной метки можно пренебречь, целесообразно учитывать лишь вклад колебаний свободных радикалов вокруг ковалентной связи и подвижность звена макромолекулы, к которому прикреплена спин-метка. [c.168]

Метки уже в течение многих лет применялись при исследовании биологических систем. Природа меток весьма разнообразна от радиоактивных изотопов до флуоресцирующих или окрашенных молекул. Обычно метки стараются поместить вблизи или непосредственно в активном центре белка. В экспериментах по ЭПР используют свободнорадикальные заместители (спин-метки). Преимущества их таковы 1) эти метки чувствительны к локальному окружению, 2) с их помощью можно исследовать очень быстрое молекулярное двил<ение, 3) диамагнитное окружение не создает помех при регистрации спектров ЭПР и 4) в настоящее время в продаже имеется большой выбор соединений, которые можно использовать в этом качестве [445]. [c.420]

Здесь Н1 н Кг — боковые группы, которые придают спин-метке способность вступать в специфические реакции с определенными группами аминокислот. Таким образом, выбор спин-метки диктуется типом центра, который надо пометить. [c.420]

Со времени первых экспериментов по спин-меткам в 1965 г. [446 эта область вызывала постоянно растущий интерес и усиленно развивалась. Подробности этих работ изложены в обзорах [447—449]. [c.421]

Мы уже видели на рис. 9-18, как меняется спектр ЭПР имин-оксильного радикала по мере уменьшения скорости вращения. Исходя из параметров спектра ЭПР, можно грубо оценить скорость вращения. Движение спин-метки, связанной с активным центром фермента или находящейся вблизи него, затруднено. Снижение скорости вращения отражается в спектре ЭПР (разд. 9-7). Нанограммовые количества опиума (или продуктов его обмена) в капле мочи смещают равновесие между свободной и связанной спин-метками в такой мере, что это смещение уже можно обнаружить методом ЭПР. [c.421]

Как константа сверхтонкого расщепления на азоте, так и -фактор зависят от растворителя. В углеводородных средах обычно расщепление на 1—2 Гс меньше, чем в полярных растворителях. В полярной среде --фактор примерно на 0,0005 больше, чем в неполярной. Таким образом, измерение этих параметров позволяет установить природу окружения спин-метки в биологической системе. [c.421]

Следует сказать, что вышеупомянутые методы измерения относятся к случаю радикала, вращающегося в изотропной среде, т. е. к случаю изотропной диффузии. Однако, в реальных ситуациях спектры ЭПР спиновых меток следует анализировать, исходя из того, что подвижность метки слагается из двух составляющих движения метки относительно молекулы биополимера и движения самой молекулы биополимера, несущего на себе метку. В случае, если метка жестко иммобилизована на поверхности биополимера, спектр ЭПР отражает подвижность только молекулы биополимера, поскольку движение метки будет определяться относительно медленным вращением белковой глобулы. Эффективное время корреляции можно определять, измеряя, например, расстояние между крайними широкими пиками и ширину линий в спектре (Кузнецов, 1976). Однако, случай, когда спиновая метка жестко связывается с молекулой биополимера, практически не реализуется. Па самом деле, спин-метка, связанная с белком, принимает участие в двух типах движения. Во-пер-вых, это быстрое вращение оси радикала и ее колебания относительно системы координат, связанной с глобулой. Это движение носит локальный характер. Во-вто-рых, это движение самой белковой глобулы, которое может носить изотропный характер (сферическая глобула) и замедляется с ростом вязкости окружающей среды. [c.279]

В дополнение к данным о полярности вязкости среды, окружающей спин-метки, их вращательной подвижности у экспериментаторов имеется также возможность измерять скорость исчезновения сигнала вследствие присоединения атома водорода к нитроксильной группе спин-метки. Клетки различных организмов, в том числе и млеко-пит ающих могут вызывать исчезновение сигнала на протяжении [c.303]

В действительности спектр сигналов спин-метки отражает поглощение ею микроволновой энергии. Резонансные условия, в которых происходит это поглощение, достигаются путем размещения образца, содержащего спин-метки в резонаторе ЭПР-спектрометра, где через образец под прямым углом друг к другу проходят магнитное поле и микроволновое облучение. Когда частота микроволновой энергии и магнитное поле Н достигают значений собственной энергии, наступает поглощение и сигнал может быть зарегистрирован. При обработке спектров учитываются амплитуда сигнала, ширина линии, расстояние между линиями. С помощью точного измерения амплитуды и ширины линии может быть вычислен показатель Tq. Показатели, связанные с трансляционной диффузией, могут быть вычислены по данным ширины линии спектра. Все эти параметры описаны более полно в представленных подразделах. [c.304]

Оно указывает, что объем (молекулярной формой пренебрегаем, так как в представленных спин-метках она близка к сферической) вращающейся молекулы, которая преодолевает вязкость г при температуре Г, выраженной в К, определяет значение Тс-Это должно указывать на то, что значения Тс снижаются благодаря молекулярным силам, которые действуют на относительно коротких расстояниях от поверхности вращающейся молекулы. [c.307]

Так как цитоплазма представляет собой совокупность органелл и молекул различных размеров, представлялось целесообразным смоделировать некоторые отдельные компоненты цитоплазмы путем приготовления различных водных растворов. Необходимо было продемонстрировать наглядность анализа параметров растворенного вещества (с помощью исследования подвижности спин-метки в растворах), таких, как размер молекул, их форма, концентрация и поверхностные свойства. В соответствии с поставленными задачами мы обсудим только некоторые из них. Такого рода параметры могли быть продемонстрированы путем исследования поведения спин-меток в концентрированных растворах сахарозы и в полиакриламидном геле. Одни молекулы (сахароза) — небольшие, хорошо растворимые в воде молекулы, другие, например полиакриламида,— линейные полимеры, образующие гель при комнатной температуре. Анализ молекулярной подвижности в этих двух средах оказался не таким простым , как казался на первый взгляд. В растворах сахарозы до 70 %-ной концентрации это можно было сделать легко. Приготовить растворы более высокой концентрации и тотчас же измерять в них молекуляр- [c.309]

Препараты сахарозы были сделаны путем растворения определенной массы вещества в определенном объеме воды. Например, 10 г сахарозы смешивали с 90 мл воды и получали препарат 10 %-ной сахарозы. В этот раствор добавляли спин-метки, конечная концентрация которых показана на рис. 3. По представленным здесь результатам Dh изменялось в сторону уменьшения по сравнению с расчетными данными для изотропной среды, в которой происходило аналогичное увеличение вязкости. Причины таких расхождений очевидны. 70 % препарата сахарозы состоит из 70 г сахарозы и 30 мл воды. Конечная концентрация спин-метки, добавленная к препарату, собирается в водной фазе (мы исключаем объем, занимаемый сахарозой) и она в 2,5 раза превышает равную концентрацию спин-метки, растворенной в воде. [c.310]

Спин-метка чувствительна к своему окружению, ее спектр ЭПР зависит от конформационного состояния биополимера. Подвижность метки связана с локальной подвижностью биополимера и подвижностью его молекулы как целого. С помощью спин-л1еток установлены важные особенности строения и динамики белковых молекул. Эти методы весьма эффективны и при изучении биологических мембран. [c.172]

С использованием метансульфохпорида спирт-радикал 36 превращен в ацилирующую спин-метку 37 [c.33]

Поскольку беспорядочного движения молекул белка в растворе недостаточно для эффективного усреднения анизотропного вза-идюдействия, полученные результаты свидетельствуют о том, что небольшая часть свободных радикалов фиксирована относительно жесткой третичной структуры сывороточного альбумина. Это явление получило название сильной иммобилизации спин-метки , в отличие от слабой иммобилизации , когда компоненты СТС спектра ЭПР лишь слегка уширяются. [c.167]

Исходя из того, что одна молекула белка связывала от одного до двух свободных радикалов, авторы предположили, что в сывороточном альбумине имеется две различные аминогруппы, реагирующие с иминоксильными свободными радикалами. В случае присоединения парамагнитной метки к аминогруппе, расположенной на поверхности молекулы белка, получается спектр ЭПР со слабой иммобилизацией спин-метки. Другая аминогруппа, расположенная в глубине белковой глобулы, при связывании со спин-меткой дает спектр ЭПР сильно иммобилизованных свободных радикалов. В последнем случае свободный радикал, связанный ковалентной связью с молекулой белка, гидрофобно взаимодействует с близлежащим участком полипептидиой цепи. При кислотно-щелочной денатурации сывороточного альбумина, а также при переваривании спин-меченого белка пепсином широкие компоненты спектра ЭПР сильно иммобилизованных свободных радикалов исчезали, и сигнал ЭПР исследуемой системы приближался по своим параметрам к спектру ЭПР описанного (стр. 166) спин-меченого поли- -лизина. [c.167]

В другой работе [43] в качестве свободнорадикальной метки сывороточного альбулшна был использован 2,2,5,5-тетраметил-З-малеимидопирролидин-1-оксил. После проведения реакции, в результате которой спин-метка соединилась с сывороточным альбумином (рис. 37, а), наблюдалось наложение двух сигналов ЭПР, относившихся к сильно и слабо иммобилизованным свободным радикалам. Если метку вводили после предварительного блокирования 5Н-групп белка специфическим реагентом, то в спектре ЭПР отсутствовали широкие компоненты сильно иммобилизованных свободных радикалов (рис. 37,6). При pH 2,1 компоненты широкого сигнала ЭПР отсутствовали, а амплитуда узкого сигнала ЭПР увеличилась примерно вдвое. [c.167]

Удобной специфической спин-меткой является 2,2,6,б-тетрал е-тил-4-малеимидопиперидип-1-оксил [44,451 около 90этого радикала при взаимодействии с сывороточным альбумином переходит в сильно связанное состояние. [c.168]

Огава и Мак-Коннелл [481 с помощью иминоксильного радикала 2,2,5,5-тетраметил-3-иодацетамидопирролидии-1-оксила исследовали конформационные изменения гемоглобина при его превращении в оксигемоглобин. При этом превращении происходил переход между двумя состояниями спин-метки. На отсутствие промежуточных состояний указывало наличие изобестических точек при наложении спектров ЭПР. Авторы полагают, что конфор-мационное изменение в результате присоединения кислорода происходит одновременно во всех четырех субъединицах гемоглобина и носит кооперативный характер. [c.169]

Из анализа ширины компонент СТС спектра ЭПР время корреляции определить не удалось из-за сильного связывания спин-метки. Однако аналогичную величину удалось определить методом поляризации люминесценции. Для этого был подобран водноглицериновый раствор, в котором спектры ЭПР динитрофенилимн-ноксильного гаптена были аналогичны спектру ЭПР комплекса гаптена с антигеном (90"о глицерина, 5% воды, 5°о спирта). [c.172]

Характер спектра ЭПР спин-метки определяется двумя факторами 1) относительной легкостью, с которой спип-меченый конец молекулы может вращаться или изменять свою ориентацию, и 2) степенью гидрофобности или гидрофильпости окружения. [c.421]

Измерение времен корреляции показало, что для молекул гемоглобина, альбумина, фосфорилазы, липазы, протеинкиназы движения соответствуют жесткой глобуле с различной степенью эллипсоидальности. Спектр молекулы лезоцима не содержит крайне широкие пики при нормальных условиях. Малая величина времени (тс = 2 не) определяется здесь не мономерной формой всей макромолекулы, а подвижностью фрагмента, содержаш его гис-15, к которому присоединена спин-метка. Для молекул иммуноглобинов, гликопротеидов, аспартатаминотрансферазы также установлено суш ествование их внутренней гибкости. [c.281]

N — эффективность фотоиндуцированного переноса электрона от Qa на Qs (кривые i) т — эффективный параметр времени корреляции вращательной диффузии гидрофобного зонда (2) и и спинной метки на SH-группы (3) [c.374]

Сначала нейтрализовались неспаренные электроны молекул, расположенных на внешних поверхностях липосом, что приводило к уменьшению числа неспаренных электронов в два раза. ЭПР затем определялся спин-метками на внутренних, не доступных действию аскорбиновой кислоты поверхностях липосом. Однако плоп1 адь под спектрами ЭПР продолжала понижаться, что свидетельствовало об уменьшении числа неспаренных электронов. Это объяснялось перескоками меченных спин-метками молекул с внутренней поверхности бислойной мембраны липосомы на внешнюю - флип-флопом. По скорости уменьшения интенсивности сигнала ЭПР установлено, что половина меченых молекул претерпевает флип-флоп примерно за 6,5 часов, поскольку примерно через это время плош 8Дь под кривой спектра ЭПР (а следовательно, число неспаренных электронов) уменьшалась в два раза. [c.23]

Полученные методами, измеряющ ими обычную диффузию, результаты захватывают широкий диапазон значений, например, они покажут, что агаровый гель твердый. С помощью метода, основанного на использовании спин-меток, мы установили, что водная фаза в агаровом геле такая же текучая, как в равном объеме воды. Этот метод позволяет измерять диффузию в диапазоне от 20 ангстрем до нескольких сотен ангстрем и не зависит от текучести общей массы. С помощью ЯМР, в принципе, также можно измерять диффузию в сверхмикродиапазонах, но этот метод значительно менее чувствителен по сравнению с методом спин-меток. Описанные здесь исследования, проведенные с помощью спин-метки, дают косвенную информацию о клеточной воде. Так как спин-метки располагаются в водной фазе цитоплазмы, регистрируемое движение спин-меток ограничивается в связи с физическим состоянием воды. Спин-метки растворяются, а движение их молекул ограничивается вследствие следующих взаимодействий раствор — раствор, раствор — клеточные структуры. [c.302]

ЭПР — чувствительный метод, позволяющий измерять парамагнитные молекулы, называемые спин-метками, причем такие их низкие концентрации, как 10- М. Аналогичных сигналов, накладывающихся на сигнал спин-меток, в естественных биологических образцах не существует. С помощью относительно простых химических методик был синтезирован широкий набор различных спин-меток (Berlinerj [c.302]

На рис. 1 показаны две спин-метки, используемые в настоящем исследовании, которые представлены в качестве примера структуры спин-меток. Основная характеристика структуры спин-меток — высокоэкранированный окисленный атом азота (группы N0). Эта структурная конфигурация стабильного свободного радикала парамагнитна. [c.303]

Природа сигнала ЭПР позволяет измерять несколько параметров, которые дают информацию о физических свойствах и микроокружении спин-меток. Спин-метки могут быть размещены на различных органических молекулах в пределах от небольших молекул до белков, углеводов, полинуклеотидов. Различия спектров ЭПР спин-меток зависят от влияния на них микроокружения. Одним из наиболее распространенных параметров ЭПР является постоянная сверхтонкого взаимодействия, позволяющая регистрировать изменения полярности среды выше на несколько десятых нанометра от поверхности спин-метки. Этот параметр определяется измерением магнитного поля между низкими и средними резонансными его линиями, выраженного в Гс. Типичные значения 16,3 Гс для TEMPONE в воде и 14,5 Гс для TEMPONE в гексане. Спин-метки, растворимые в углеводородах, будут давать значения Ам, типичные для углеводородных растворителей в водно-масляных эмульсиях. [c.303]

Время вращательной корреляции (Тс) используется в качестве параметра, одределяющего свободу вращательной подвижности спин-метки. Определяемый параметр Тс дает незначительные отличия в числовых значениях для различных спин-меток, обусловленных свойственными им факторами. Эти отличия не представляют серьезной проблемы и в практике одни и те же спин-метки используются в сравнительных экспериментах. Величина Тс определяется по формуле [c.307]

Рис, H, Влияние сахарозы подвижность спин-меток. Сплошной линией обозначен уширение линии спин-метки в зависимости от ее концентрации в воде при комнатной температуре ( ) — те же самые параметры в 10%-н м растворе сахарвзы, (о) — 40%-ном, ( ) — 70 %-ном. Процентами выражено отнотенпе массы сахарозы к объему воды, ЛЯ (Гс) прямо пропорционально к диффузии в любой данной молярной концентрации спин-метки (см. уравнение (6)). [c.310]

Полиакриламидный гель также может служить моделью для изучения влияния концентрации спин-меток в воде. Такого рода препараты готовили следующим образом. Сначала делали водные растворы спин-меток, а затем к ним добавляли обезвоженные гранулы геля. Водные препараты гранул центрифугировали в капиллярах с целью удаления межгранулярного водного пространства для измерения на ЭПР-спектрометре. Пространство, которое занимают молекулы полимера полиакриламида, не определяется как концентрационное или кубическое. В связи с этим полиакриламидные препараты не нуждаются в поправках на концентрацию спин-метки в воде. Данные этих экспериментов пригодны для прямой интерпретации (рис. 4). [c.311]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология