Химотрипсин зависимость скоростей реакций

Зависимость начальной скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата для гидролиза метилового эфира К -ацетил-Ь-валина, катализируемого а-химотрипсином. Условия опыта pH 7,8 25° С ионная сила 0,Ш (КС1), [Е о = 3,8-10- М [c.87]

В таблице 13 приведена зависимость начальной скорости гидролиза и-нитроанилида Ы-ацетил-Ь-тирозина, катализируемого а-химотрипсином, от концентрации фермента [16]. Определить значения кинетических параметров ферментативной реакции, если концентрация субстрата во всех случаях равна 1 10 М. [c.123]

В таблице 7 приведена температурная зависимость констант скоростей прямой и обратной реакций конформационного изменения молекулы а-химотрипсина [7]. Вычислить значения стандартных энтальпии и энтропии активации прямого (й/) и обратного (кг) процесса. [c.255]

Это позволяет предположить, что при гидролизе амида вторая стадия — ацилирование фермента —также должна являться стадией, которая определяет скорость процесса, так как третья стадия, по-видимому, идентична для эфиров и для амидов одних и тех же производных аминокислот. Зависимость гидролиза этилового эфира ацетил-Ь-тирозина и этилового эфира ацетил-Ь-фенилаланина. катализируемого химотрипсином, от рП среды указывает на то, что для этих реакций величины 2 и кз имеют один порядок и обе они характеризуют общую скорость, как показано в уравнении (4). [c.332]

Рис. 4.8. График, показывающий невозможность дифференциации механизмов (4.69) и (4.72) с помощью уравнений (4.71) и (4.74). Приведена зависимость константы скорости для связывания профлавина а-химотрипсином при pH 6,84 и 25 °С от концентрации профлавина. Реакция протекает согласно следующему уравнению

Зависимость скоростей реакций, катализируемых химотрипсином, от pH обнаруживает оптимум при pH 8. [42]. Механизм зависимости химотрипсино-. вого катализа от pH заключается в следующем [6—9, 13, 43, 44]. Эффективные константы скоростей химических стадий ферментативной реакции 2 и сохраняют постоянное значение при щелочных и нейтральных значениях pH, но при дальнейшем понижении pH они уменьшаются. Сигмоидальный характер этих зависимостей указывает на участие в катализе ионогенной группы фермента с рЛГа7. Многие годы полагали, что этой группой является имидазольный фрагмент His-57, однако позднее она была идентифицирована как карбоксил Asp-102 [45]. Ее протонизация разрушает водородные связи в составном нуклеофиле (рис. 32), что приводит к потере ферментом каталитической способности. [c.132]

Из косвенных методов чаще других используется метод, основанный на изучении рН-зависимости некоторых параметров реакции, таких, например, как максимальная скорость или константа Михаэлиса. Изменение этих параметров в зависимости от pH часто напоминает по своему характеру титрование одной ионизируемой группы (см. гл. VI). Можно поэтому определить соответствующее значение pi a этой группы и попытаться идентифицировать ее путем сравнения полученного значения рЛТ с известным значением p7i для боковых цепей различных аминокислот. Все это сопряжено с известными трудностями. В результате взаимодействия с соседними группами в белке, а также с субстратом или буфером величина pZ для ионизируемой группы в белке может заметно отличаться от соответствующей величины для той же группы, присутствующей в свободном виде в растворе. Кроме того, величины pifa для различных титруемых групп белков в значительной степени перекрываются. Например, группа с pif 10 может быть либо аминогруппой, либо фенольной гидроксильной группой, либо сульфгидрильной группой. В некоторых случаях определение величины A/i ионизации помогает приписать данное значение рЛТ той или иной группе, однако нередко однозначное отнесение полученного значения рЖ к определенной функциональной группе оказывается все же невозможным. Известно также, что рН-зависимость может отражать титрование нескольких остатков, а не какой-либо одной индивидуальной группы. Наконец, крутые перегибы кривых, описывающих зависимость скорости реакции от pH, могут вызываться ие только титрованием, но также и другими факторами, например изменением стадии, лимитирующей скорость реакции. К счастью, все эти ослол<иения возникают не всегда. Часто заключения, сделанные на основании рН-зависимости, удается подкрепить другими методами. Исходя из данных по зависимости максимальной скорости реакции от pH, следует, например, считать, что у всех ферментов, перечисленных в табл. 29, в каталитическом акте участвует остаток гистидина. Для химотрипсина это заключение подтвернодается тем, что соответствующий хлоркетон, являющийся аналогом субстрата химотрипсина, избирательно реагирует с одним остатком гистидина и вызывает таким путем инактивацию фермента. На основании [c.199]

З-образный характер зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в катализе химотрипсином. Изменение среды в результате добавки органических соединений также оказывает заметное влияние на эффективность сорбции на активном центре химотрипсина гидрофобных компонентов реакции. Причина этого заключается, как правило, в том, что органическая добавка, повышая растворимость субстрата (или субстратоподобного ингибитора) в воде, удерживает его в водном растворе и затрудняет тем самым [c.145]

Рис. 40. Зависимость начальной стационарной скорости реакции гидролиза этилацетурата (ЭА) под действием химотрипсина [99] от начальной концентрации субстрата при различных концентрациях К-ацетил-О-триптофана, мМ

Величина называется временем релаксации. При анализе зависимости времени релаксации от равновесных концентраций Е и А могут быть найдены элементарные константы скорости реакции (5.197). В качестве примера на рис. 69 приведены кинетические данные реакции комплексообразования активного центра а-химотрипсина с красителем ак-рифлавином [41]. Представленные экспериментальные данные хорошо описываются уравнением (5.206). По тангенсу угла наклона и отрезку, отсекаемому на оси ординат, найдены, соответственно, константы скорости процесса комплексообразования 12 = 2,4-10 М" -с , = = 2,7-10 с-1. [c.208]

Зависимость начальной скорости реакции от концентрации субстрата для гидролиза метилового эфира -ацетнл-С-норвалина, катализируемого а-химотрипсином. [c.88]

В таблице 14 приведена рН-зависимость константы скорости реакции второго порядка ацилирования а-химотрипсина п-цитрофенилацетатом [5]. [c.232]

Определены зависимости биомолекулярных констант скоростей реакций оС-химотрипсина с 0-н-гексил-д -(-этилмеркаптоэтил) метилтиофосфонатом, [c.837]

Предложенная Свейном и Брауном [286] модель согласованного каталитического процесса весьма эффективна вследствие совместного участия нуклеофильного и электрофильного катализаторов и является популярной моделью ферментативного катализа. В разделе V дано несколько интересных примеров согласованных реакций производных карбоновых кислот, например гидролиз фталаминовой кислоты и гидролиз салицилового эфира янтарной кислоты. Сравнение зависимости скорости этих реакций от pH и реакционной способности субстратов с подобными данными, найденными для ферментатив-И01Г0 катализа, указывает, что аналогия между согласованной модельной системой и ферментативной системой не является очень близкой, по крайней мере в случае химотрипсина. Однако для некоторых ферментативных систем согласованная модель применима. [c.157]

В предыдущем разделе мы потратили очень много усилий на то, чтобы предостеречь читателя от поверхностного изучения температурной зависимости скоростей ферментативных реакций. Было бы ошибочным считать, однако, что такие исследования бесполезны напротив, при соблюдении необходимых мер предосторожности они могут дать весьма ценную информацию о механизме ферментативной реакции. Подобный подход является особенно плодотворным при изучении специфичности фермента. Если достоверно известно, что сопоставляемые величины подобны (например, сравнение констант /Скат. т. ёГУ/со, для двух субстратов будет корректным только в том случае, когда для каждого из субстратов Акат относится К ОДНОЙ И ТОЙ же стадии реакции), то сопоставление параметров ди часто оказывается гораздо более информативным, чем сопоставление простых констант скорости. Классическим исследованием подобного тина может служить работа, проведенная Бендером, Кезди и Гантером [10] по изучению катализируемого а-химотрипсином гидролиза многочисленных субстратов. Считается, что для этой реакции выполняется механизм с образованием ацилфермента, т. е. механизм с замещением фермента, в котором сначала субстрат КСО—X ацилирует фермент НЕ [c.159]

Трипсин и химотрипсин, очевидно, имеют второй активный центр, содержап ий гистидин. Второй участок удален от первого, но на спиральной цепочке они сближены. Установление активной роли гистидина основывалось частично на изменении скорости ферментативной реакции в зависимости от pH, что соответствовало предположению о стратегическом расположении слабоосновного остатка, имеющего характер гистидина. Даже сам имидазол также катализирует гидролиз простейших сложных эфиров (БрюИ С" и Шм Ир 1965—.19i57 Бендер, 1957). 7 о, что фермент в 10 раз эффективнее, чем имидазол, имеет аналогию в модельных опытах по мутаротации глюкозы — реакции, катализируемой кислотами и основаниями. о -Оксипиридин, содержащий кислотный и основной центры (оба относительно слабые), более эффективен как катализатор, чем смесь пиридина и фенола (Свайн, 1952). И в а-окси-пиридине, и в протеолитическнх ферментах бифункциональность повышает каталитическую активность, поскольку протоны могут быть одновременно поданы и отщеплены в сопряженной реакции. Механизм действия, предложенный, Нейратом (1957) для химотрипсина, сводится к следующему. При взаимодействии гидроксильной группы серина с имидазольным кольцом гистидина отщепляется протон и образуется активированный комплекс П, имеющий электрофильный и нуклеофильный центры. [c.714]

При высоких значениях pH скорость действия химотрипсина падает, и характер рН-зависимости указывает на существование в активном центре группы с рЛ[а от 8 до 9. Это значение рКа может относиться к N-кoнцeвoй аминогруппе Ие-16. Аминогруппа Пе-16 участвует в образовании одной из связей, расщепляемых при превращении зимогена в активный фермент. Эта аминогруппа образует ионную связь (ионную пару) с остатком Азр-194 (рис. 7-2), который находится рядом с сери-ном активного центра. Возможно, ионная связь способствует поддержанию фермента в нужной для реакции конформации. Депротонирование при pH выше 8—9 должно вызывать инактивацию [39]. [c.112]

На основании изучения кинетики гидролиза п-нитрофенил-ацетата [6] и 2,4-динитрофенилацетата [8] по методу остановленного потока мы можем различить три стадии в этих реакциях первая — начальная быстрая адсорбция субстрата, вторая — освобождение одного моля нитрофенола на моль химотрипсина и сопутствующее ацилирование группы у фермента и третья — гидролиз соединения фермент-ацил. Стадия начальной адсорбции протекает слишком быстро и не поддается измерению имеющимися в настоящее время методами. Вследствие сравнительно больших значений скорости последующие две стадии определяются величинами 2 = 3 сек- я кз = 0,025 сек- . Эти величины характеризуют химическую реакцию между группами на каталитическом центре и субстратом и могут быть использованы в отдельности. Как освобождение ионов нитрофенилата, так и освобождение или связывание ионов водорода протекает во время обеих последовательных реакций. Найдено, что во время первой из них освобождается только нитрофенол, тогда как ацетат реагирует с ОН-группой фермента. Полученное соединение ацил-фермент во время конечной стадии гидролизуется с освобождением ацетата. Как ацилирование, так и гидролиз ацил-фермента ингибируется путем присоединения протона к соседней основной группе, вероятно имидазольной. Мы сделали интересное наблюдение [8], что эта основная группа изменяет значение рД во время реакции ацилирования, обусловливая таким образом две стадии различной зависимости от pH. В литературе приведено большое число доказательств [6, 8] в пользу того, что ацилируется именно гидроксильная группа в остатке серина в химотрипсине. [c.331]

Для некоторых хорошо изученных ферментных реакций определена зависимость от pH для констант скоростей отдельных элементарных процессов. Такие данные, например, для реакций с участием а-химотрипсина можно найти в [13]. Для данных, полученных до 1965 г., этот вопрос хорошо разобран в фундаментальной монографии Диксона и Уэбба [2]. Здесь важен лишь общий вывод, что главная причина появления оптимума pH для ферментативных реакций обычно связана с прохождением через максимум эффективной скорости распада фермент-субстратного комплекса. [c.76]

Прж реакции химотрипсина (ХТ) с фосфорорганичесними ингибиторами (ФОИ), имеющими ионизованные уходящие группы -З(сн2)д3(сн2)с2н , бимолекулярные константы скорости фосфорилирования оказались в более чем на порядок величины меньшими, чем можно было ожидать, исходя из данных по электрофильной реакционной способности этих соединений . Чтобы выяснить, не является ли отмеченный "эффект заряда" результатом электростатического отталкивания заряженного радикала ФОИ от некой положительно заряженной группировки на активной поверхности ХТ , в настоящей работе были определены рН-зависимости бимолекуляр-ных констант скоростей фосфорилирования для ФОИ настоящее место работы сектор биохимии Института кибернетики АН ЭССР, г Таллин, [c.837]

На основании последующих исследований был сделай вывод, что кз катализируемого химотрипсином гидролиза этилового эфира ацетил-/,-тирозина, этилового эфира ацетил-1.-трш1тс>фана и амида aцeтил-L-тиpoзинa зависит от ионизации группы с кажущейся р/Са, равной 6,7 (388, 389]. Эти данные можно объяснить участием имидазольной группы гистидина о каталитическом процессе. Применение метода, заключающегося в изучении влияния pH в стадии катализа, является само по себе важным достижением в деле изучения активной области гидролитических ферментов, так как ранее обычно рассматривалась только графическая зависимость общей скорости ферментативных реакций от pH, имеющая колоколообразную форму. [c.143]

Влияние pH на скорость ферментативных реакций может быть обусловлено различными факторами. Ферменты, подобно другим белкам, являются амфолитами и имеют большое число ионоген-ных групп. Если функционирование фермента зависит от наличия некоторых специфических группировок, то каждая из них в дан-ных условиях должна находиться в определенном состоянии (не-ионизированном или ионизированном). Нередко оказывается возможным идентифицировать участвующие в катализе ионогенные группы активного центра путем анализа зависимости активности фермента от pH и сопоставления полученных данных с известными величинами р/С ионогенных групп белков (табл. 5.2). В качестве примеров можно указать на идентификацию каталитически активных остатков гистидина в активных центрах трипсина, химотрипсина и субтилпзина и тиоловой группы в активном центре папаина (гл. 9). На участие ионогенных групп в функционировании ферментов указывает также влияние ионной силы на скорость ряда ферментативных реакций (это влияние сильно выражено при действии карбоксипептидазы и уреазы). Такого рода эффект обычно наблюдается при неферментативном катализе, осуществляемом ионогенными соединениями. [c.260]

Лучшие субстраты и ингибиторы химотрипсина содержат ароматические или объемистые алифатические R-группы (табл. 6.3) это указывает на участие гидрофобных сил в образовании фер-мент-субстратного комплекса. Например, a-N-ацетилпроизводные L-тнрозинамида и ь-фенплаланинамида являются значительно лучшими субстратами, чем соответствующий амид ь-аланина. Кинетические исследования (разд. 9.2.6) указывают также на образование ковалентного промежуточного соединения. Зависимость от pH константы скорости кг (разд. 9.2.6) позволяет предполагать, что в реакции ацилирования участвует группа с р/С, близким к рЛ" имидазольной группы боковой цепи гистидина. [c.298]

Трансспецифичностъ активного центра а-химотрипсина. Реакционная способность ацилферментных производных а-химотрипсина в реакции гидролиза [стадия деацилирования, схема (2.73)] является функцией структуры ацильной части субстрата. В зависимости от строения ацильной части скорость гидролиза ацилферментов различается более чем в Ю раз, в то время как в реакции щелочного гидролиза эти различия весьма невелики. Структура активного центра фермента задает необходимые пространственные соотношения, определяющие реакционную способность ацилфермента. [c.150]

Пример 2.9. В 2-4, в пункте, посвященном изучению свойств ацилферментных интермедиатов а-химотрипсина, исследовали температурные зависимости констант скорости деацитилирования а-химотрипсина. На основании данных рис. 2.34 определить ДЯ и Д5 для реакций [c.188]