Ферменты в кинетическом расщеплении

В основе изящного метода двойного расщепления , предложенного Оро [17], лежит принцип кинетического расщепления. В противоположность методам с использованием ферментов, при применении которых достигается почти полное расщепление, в методе Оро происходит только частичное кинетическое расщепление стереоспецифичность реакции неизвестна, и необходимые дополнительные данные получают в результате повторного частичного расщепления. [c.291]

Исходя из детального кинетического анализа деградации полимеров при определенных механизмах реакции значения констант скоростей могут достигать предела при длине субстрата, значительно превышающей протяженность активного центра. Таким образом, в зависимости от характера взаимодействия полимерного субстрата с ферментом и способа расщепления субстрата, излом на кривой зависимости log/г [c.49]

В литературе имеется всего несколько работ, в которых рассмотрены возможные кинетические схемы реакций, катализируемых лизоцимом [129—133]. При этом авторы работ пошли по заведомо усложненному пути, пытаясь включить в схему наряду с продуктивным также и непродуктивное связывание субстрата с ферментом. В последнем случае рассматриваются, как правило, различные способы ассоциации исходного субстрата п продуктов его частичного и полного расщепления с различными сайтами (от А до Р) активного центра. Более того, реакции трансгликозилирования, вводимые в подобные схемы, включают также различные варианты ассоциации молекул акцептора с соответствующими сайтами (Е и Е) активного центра, а также различные комбинации размеров молекул акцептора с размерами гликозильной части, удерживаемой в активном центре. Пример (не самый усложненный) подобного подхода рассмотрен в недавней работе [132] и соответствующая кинетическая схема выглядит следующим об- [c.183]

Митохондриальный фермент выделен в виде димера, гексамера и октамера. Изоферменты креатинкиназы различаются по электрофоретической подвижности, по кинетическим свойствам, по термостабильности, по аминокислотному составу, по количеству и реактивности 5Н-групп, аргининовых остатков и другим свойствам. Мышечный изофермент (ММ) более стабилен, чем мозговой (ВВ) и митохондриальный при изменении pH и температуры. Они устойчивы в диапазоне pH 6,0—9,5, но при этом к раствору мозгового и митохондриального изоферментов необходимо добавлять 5Н-восстанавливающие реагенты (2-меркаптоэтанол и др.). Оптимальные значения pH активности для изоферментов практически одинаковы и равны 9 — для прямой реакции (синтеза креатинфосфата) и 7 — для обратной реакции (расщепления креатинфосфата). [c.292]

Создание детальной кинетической модели ферментативного гидролиза целлюлозы и его оптимизация представляет собой крайне сложную задачу. Во-первых, целлюлазные комплексы, осуществляющие гидролитическое расщепление целлюлозы, состоят из нескольких различающихся по специфичности ферментов (которые в свою очередь могут иметь множественные формы) и в зависимости от источника могут значительно варьировать по компонентному составу, способности расщеплять природные формы целлюлозы, кинетическим и другим важным свойствам (термостабильности, адсорбционной способности и т.д.). Во-вторых, целлюлозосодержащие материалы, используемые в качестве сырья, представляют собой нерастворимые субстраты с различной реакционной способностью в зависимости от структуры целлюлозы, наличия в их составе нецеллюлозных компонентов (гемицеллюлозы, лигнина и др.), а также от способа их предобработки. [c.157]

В тех случаях, когда фермент реагирует с субстратами последовательно (скажем, принимает какую-то группировку от одного субстрата и передает ее другому), возникает очень простая возможность снижения энергии активации путем изменения общего характера реакции. Например, если конечный акцептирующий субстрат обладает не очень высокой реакционноспособ-ностью в кинетическом смысле, более реакционноспособная группировка фермента может атаковать донорный субстрат и в результате его расщепления образовать реакционноспособную замещенную форму фермента. Именно так, по-видимому, действуют многие гидролазы [c.102]

Прогресс, достигнутый за последнее десятилетие в области изучения механизма ферментативного расщепления целлюлозы, очевиден. Установлено, что целлюлолитические ферменты, входящие в состав целлюлазных комплексов, характеризуются субстратной специфичностью, определенными кинетическими параметрами, изотермами адсорбции на водно-растворимых производных целлюлозы, термостабильностью, их активность и адсорбционная способность зависят от pH, температуры и величины рК ионогенных групп активного центра. [c.44]

Важным элементом рассматриваемой кинетической схемы является расщепление ферментативного процесса на субстрате 5". Анализ показывает, что кинетическая схема с участием фермента, инактивирующегося в процессе реакции, должна быть дивергентной. Кинетику процесса в отсутствие параллельного оттока субстрата (при у = 0) описывает система уравнений [c.324]

Перспективными ферментами для кинетического расщепления рацемических эпоксидов являются энантиоселективные эпоксидгидролазы микроорганизмов, катализирующие гидролиз окси-ранового кольца одного из энантиомеров субстрата с образованием оптически активного вицинального диола и остаточного энантиомера эпоксида . При этом в зависимости от региоспецифичности используемого фермента гидролиз может протекать с инверсией или сохранением исходной конфигурации молекулы субстрата 4 [c.446]

Методы кинетическою расщепления основываются на том, что реакции энантиомеров с хиральными (оптически активными) реагентами протекают с различными скоростями отношение скоростей отражает различие в энергиях активации диастереомерных переходных состояний [16]. При взаимодействии ферментов с рацемическими субстратами реакции часто протекают с полной стереоспецифичпостью, т. е. отношение констант скоростей составляет не менее 10. [c.291]

Методы кинетического расщепления с использованием ферментативных систем ( ферментативные методы ) зависят от доступности фермента, который может реагировать количественно с одним энантиомером в присутствии большого избытка другого энантиомера, остающегося инертным. Например в-аминооксидаза из почек свиньи будет окислять многие в-аминокислоты, оставаясь неактивной по отношению к энантиомерным в-аминокисло-там [3]. Этот фермент можно использовать для обнаружения очень малых количеств в-аминокислот в образцах в-аминокис-лот. При этом исследуемую аминокислоту инкубируют с ферментом в аппарате Варбурга, и количество расходуемого кислорода или выделяющейся двуокиси углерода определяют волюмо-метрически. Оптическую чистоту в-аминокислот можно определить, используя в-амипооксидазу змеиного яда, которая будет катализировать окисление любого ь-энантиомера, оставаясь неактивной по отношению к в-эпантиомеру [3]. [c.295]

Аналогично в качестве реагентов для кинетического расщепления были использованы очищенные ферменты. Замечательным примером может служить а-химотрипсин, котфый эффективен в энантио-селективном гидролизе различных типов сложных эфиров [ 16]. Следует отметить некоторые особенности таких расщеплений, которые могут ограничивать их применимость. Ферменты используют в водных растворах, но в некоторых случаях добавляют небольшое коли- [c.16]

Сопоставляя па данном этапе рассмотрения концепции Хироми и Тома, мы видим, что отнесение константы Михаэлиса к соответствующим микроскопическим параметрам в рамках обеих концепций идентично (сравните выражения 14 и 15, с одной стороны, и 43 — с другой). Однако смысл каталитической константы в обеих концепциях различается (см. выражения 17 и 44). Если по гипотезе Хироми каталитическая копстапта пропорциональна гидролитическому коэффициенту ко, который является строго характеристическим для данного фермента, и определяется исключительно соотношением констант ассоциации субстрата в продуктивном и непродуктивном фермент-субстратном комплексах (17), то по гипотезе Тома величина гидролитического коэффициента зависит от способа связывания фермента с субстратом и от степени полимеризации последнего. На наш взгляд, это придает настолько больн1ую гибкость расчетам на основании концепции Тома, в особенности с помощью машинного анализа, что может в отдельных случаях делать бессмысленными определения показателей сродства индивидуальных сайтов активного центра. фермента, поскольку все наблюдаемые кинетические эффекты могут быть объяснены в рамках вариации гидролитического коэффициента при изменении структуры олигомерного субстрата и способов его связывания с ферментом. То же можно отнести и к определению константы скорости второго порядка ферментативного расщепления субстрата (см. выражения 18 и 45). [c.65]

Основным методическим подходом при картировании акгивно-го центра в концепции Тома является определение относительных частот расщепления связей полимерного субстрата под действием фермента. На рис. 11 видно, что расщепление каждого продуктивно связанного позиционного изомера должно приводить к образованию двух определенных продуктов. В итоге распределение продуктов реакции по олигомерам свидетельствует об относительной доле определенных позиционных изомеров при связывании субстрата с активным центром, и следовательно, о величине соответствующих микроскопических констант ассоциации позиционных изомеров, а скорость появления каждого продукта связана с соответствующим гидролитическим коэффициентом скорости реакции. Из кинетического уравнения (47) следует, что отношение скоростей образования продуктов Рт.г и Р ,+1,,+1 из одного субстрата со степенью полимеризации п равно отношению соответствующих микроскопических констант скоростей второго порядка [c.66]

Можно определять активность АХЭ или ХЭ. Для определения активности АХЭ в большинстве случаев подвергают гемолизу эритроциты ХЭ определяют в сыворотке крови. При использовании цельной крови можно путем выбора специфического субстрата (ацетил-р-метилхолина для АХЭ и бутирилхолина для ХЭ) или применяя определенные концентрации субстрата достигнуть дифференцирования ферментов. Последний из указанных способов основан на уже описанном ингибировании АХЭ более высокими концентрациями субстрата. Так, при концентрации ацетилхолина 10 М определяется преимущественно АХЭ, при концентрации же 10 М — ХЭ, однако в каждом случае в определенной степени (примерно на /б) проявляет активность и другой фермент. Определение активности осуществляют либо по установлению скорости ферментативного расщепления субстрата (кинетический метод) или путем определения конечных продуктов" и не вступившего в реакцию субстрата. [c.165]

Рассмотрите кинетическое поведение системы для следующего простейшего случая ошибочной ориентации субстрата в активном центре фермента фермент Е катализирует односубстратную реакцию, в которой нормальный субстрат РР связывается на ферменте в центре Р, что позволяет осуществить перенос группы р к центру Р фермента. Самопроизвольное отщепление Р от Q регенерирует свободный фермент. Поскольку Р имеет сродство лишь с Р, ошибочная ориентация исключается. Если же субстрат имеет строение. КР, ситуация изменяется. Хотя группировка К имеет то же сродство к Р, как и Р, она способна связываться отчасти и с Q, в результате чего НР иногда образует с ферментом комплекс с обратной ориентацией, не способный к расщеплению. В обоих случаях субстрат связывается с ферментом обратимо, причем в каждый момент времени одна молекула фермента может связывать лишь одну молекулу субстрата. [c.257]

Покажите путем вывода соответствующих уравнений или объясните качественно, к каким кинетическим эффектам приведет ошибочная ориентация субстрата. Сравните графики двойных обратных величин для катализируемых ферментом реакц>1й расщепления РР и НР, а также относительные значения кинетических констант, которые можно получить экстраполяцией этих графиков. [c.257]

Из табл. 26 следует, что действие фермента наиболее эффективно в отношении субстратов, содержащих более крупные боковые цепи. Ароматические остатки меиее чувствительны относительно медленно гидролизуются амиды аминокислот, имеющих полярные боковые группы. Скорости гидролиза пептидов зависят также от природы аминокислот, примыкающих к N-концевому остатку. В ряде случаев оказалось возможным частично выяснить N-концевую последовательность при подМощи лейцинаминонептидазы. Окисленные А и В-цепи инсулина легко гидролизуются ферментом до свободных аминокислот. Путем кинетического исследования удалось установить последовательность первых шести N-коицевых аминокислот В-цепи инсулина. При помощи лейцинаминопептидазы были получены важные данные об N-концевой последовательности ряда природных пептидов и пептидных фрагментов, полученных из белков. Некоторые белки, например рибонуклеаза, лизоцим, Zn-инсулин и сывороточный альбумин, устойчивы к действию фермента, но легко гидролизуются после окисления надмуравьиной кислотой или после удаления Zn (в случае инсулина). Полное расщепление пептида или белка до аминокислот указывает на L-конфигурацию всех входящих в его состав аминокислот. f [c.183]

В основе действия всех фосфорорганических инсектицидов лежит общий механизм, а именно процесс ингибирования холинэстера-зц909-911 Известно, что ацетилхолин присутствует во всех организмах, обладающих сколько-нибудь развитой нервной системой, а также, что нервно-мышечная передача включает ферментативное расщепление его на холин и уксусную кислоту. Этот процесс кинетически может быть представлен как равновесие между ацетилхо-лином и ферментом (холинэстеразой) и активированным комплексом. В последующих двух стадиях происходит образование и диссоциация комплекса ацетилированного фермента и холина [c.558]

Тот факт, что перенос фосфата протекает через ковалентное промежуточное соединение, фосфорилфермент, служит основой предполагаемого механизма катализа щелочной фосфатазой. Фосфорилированный белок можно осадить из смеси фосфата с ферментом прибавлением трихлоруксусной кислоты [60]. Анализ продуктов расщепления белка показывает, что фосфат присоединен к остатку серина [61]. В щелочной среде обнаружить ковалентно присоединенный фосфат не удается, одна1ко Вильсон и сотр. [62—67] с помощью кинетических и изотопных методов показали, что фосфорилфермент образуется при всех значениях pH и что он идентичен фосфорилированному белку, выделяемому из кислого раствора. Свободная энергия гидролиза этого промежуточного соединения удивительно мала, и по величине соответствующей ей константы равновесия он в 10 раз устойчивее обычных фосфорных эфиров [62—64]. Причина того, что фосфатаза не оказывается в термодинамической ловушке, заключается в образовании нековалентного комплекса фермент—фосфат, который при pH 8 в 100 раз устойчивее фосфорилфермента [62]. В результате этого равновесие [c.638]

Фотореактивация. Это фотобиологический процесс, направленный на устранение УФ-индуцированных летальных фотопродуктов ДНК. Механизм этого процесса предполагает участие специального фоточувствительного фермента фотолиазы, субстратом которого являются только пиримидиновые димеры. Фотореактивация приводит к распаду димеров пиримидина. Кинетические закономерности реакции фотоферментативного расщепления димеров соответствуют кинетике классических ферментативных процессов, описываемых по схеме Михаэлиса—Ментен [c.443]

ДНК-топоизомераза I металлофермент, С-концевой фрагмент которого содержит три атома Zn(II) и три участка с двумя дисульфидными связями [427]. Каталитическая реакция расщепления нуклеотидной цепи ДНК включает трансэтерификацию между фосфодиэфирной связью субстрата и боковой цепью Туг-319 фермента [428]. В этой реакции не участвует С-концевой фрагмент белка с дисульфидными связями. Что касается атомов цинка, то они также не оказывают влияния на стадию расщепления фосфодиэфирной связи, однако необходимы для замыкания разорванной цепи после релаксации ДНК [429]. Поэтому исследованный в работе [426] фрагмент с молекулярной массой 67 кДа ДНК-топоизомеразы типа I может катализировать расщепление единичной нуклеотидной цепи, но не в состоянии восстановить целостность суперспирали ДНК. Его субстратная специфичность и кинетические характеристики такие же, как у нативного белка или белка, лишенного цинка [429,430]. [c.114]

Рестрикционные эндонуклеазы П-го типа являются гидрола-зами, специфически взаимодействующими с определенными короткими нуклеотидными последовательностями двухцепочечной ДНК и расщепляющими фосфодиэфирную связь в определенном месте относительно участка узнавания. Несмотря на то, что в настоящее время известно более 1000 рестриктаз, и более ста среди них широко используются в качестве аналитических реагентов, кинетика и механизм реакций катализируемых этими ферментами изучены недостаточно. С чем это связано Во-первых, в большинстве экспериментов обычно используется избыток эндонуклеазы рестрикции, чтобы обеспечить полное расщепление ДНК, поэтому не требуется знания определенных кинетических параметров фермента. Во-вторых, для изучения кинетики реакций ДНК с эндонуклеазами рестрикции, используются довольно сложные и относительно длительные количественные методы регистрации каталитической активности рестриктаз, например, разделение рестрикционных фралментов ДНК электрофорезом в агарозном или полиакриламидном геле с последующим определением относительного количества продуктов УФ-сканированием геля, окрашенного бромистым этидием (или фотонегатива этого геля) или подсчетом радиоактивности фрагментов при использовании меченной ДНК (разд. 1, часть II). [c.68]