Имидазольная группа ионизаци

Из анализа этих данных следует, что в каталитическом акте принимает участие группировка с рКь 6,48, которая при образовании комплекса Михаэлиса теряет способность к ионизации, но освобождается после отщепления холина. Аналогично ведет себя вторая группировка активного центра, имеющая в исходном ферменте рКа 9,35. Величине рК основной группы наиболее близка к значению рК имидазольной группы гистидина. Кислотная группа с рК 9,35 может представлять ОН-группу тирозина, либо 5Н-группу цистеина. Таким образом, из данных Лейдлера и Крупки следует, что рк тех же группировок в ацетилированном ферменте отличается от значений рК в исходном ферменте. [c.183]

У нас имеются данные о том, что в каталитической реакции участвуют обе группы ОН одного остатка серина и одна имидазольная группа одного гистидинового остатка. Мы знаем также, что в ходе реакции сериновый ОН под действием субстрата ацилируется, в то время как имидазольная группа остается свободной и способной к ионизации. [c.423]

Однако существуют веские свидетельства в пользу того, что для проявления каталитической активности необходима имидазольная группа остатка гистидина в активном центре фермента. Зависимость от pH максимальных скоростей как стадии ацилирования, так и деацилирования показывает, что активность фермента пропорциональна доле основной формы группы с рК 7, что лежит в области рК, ожидаемой для имидазольной группы. Одно это не может служить строгим доказательством, что имидазольная группа включается в активный центр это значение рК может отражать 1) ионизацию некоторой другой ионогенной группы, величина рК которой искажена белком 2) имидазольную группу, протонизация которой вызывает образование каталитически неактивной конформации фермента 3) изменение скорость определяющей стадии, а не ионизацию какой-либо группы. Более строгое свидетельство, что имидазольная группа участвует в катализе, следует из факта, что фермент необратимо инактивируется при алкилировании имидазольной группы аналогом субстрата хлоркетоном VIH. [c.177]

В ферментных системах имидазол проявляет свойства кислотно-основных катализаторов и участвует в переносе электронов, протонов, ацильных и фосфатных групп. Каталитические свойства имидазольной группы зависят от степени ионизации ее подвижного атома водорода. На активность имидазольной группы оказывают влияние смежные с ней функциональные группы. [c.209]

Разностная УФ-спектроскопия часто используется при исследовании ионизации фенольного гидроксила тирозиновых остатков, а также при изучении свойств сульфгидрильных групп цистеина и имидазольных групп гистидина. [c.185]

Энтальпия ионизации имидазольных групп в растворе сО ставляет 30 кДж-моль (7 ккал-моль- ), тогда как для карбоксильных групп эта величина пренебрежимо мала. Следует иметь в виду, что на энтальпию ионизации оказывает большое влияние изменение энтальпии образующих сольватную оболочку молекул воды, поэтому данные, полученные для раствора, нельзя прямо переносить на случай частично погруженных в белковую глобулу групп. [c.188]

Нам, однако, представляется более вероятным другой механизм. Обратим внимание, что реакция проводилась в среде с пониженной диэлектрической проницаемостью (80%-ный этанол), что, с одной стороны, способствует проявлению полифункциональных механизмов (см. 3 этой главы), но, с другой стороны, сильно тормозит реакцию электронейтрального имидазола (см. табл. 20) [781. Поэтому не исключено, что ионизация рядом расположенной фенольной группы лишь создает предпосылки для благоприятствующего реакции локального изменения среды вокруг имидазольного нуклеофила. [c.109]

Гуанидиновая группа аргинина и е-аминогруппа лизина (рК 12,48 и 10,53) являются сильными основаниями, и их ионизация более резко выражена, чем ионизация аминогрупп моноаминокислот имидазольная же группа гистидина обладает лишь слабоосновными свойствами. Отдаленные молекулярные группировки оказывают лишь незначительное влияние на постоянные диссоциации аминокислот. В связи с этим можно ожидать, что и постоянные ионизации белков будут близки к постоянным ионизации аминокислот. [c.78]

Влияние pH среды на скорость ферментативных реакций обусловлено тем, что ферменты содержат большое количество групп, способных к ионизации (а-карбоксильная, а-аминогруппа, карбоксильные и аминогруппы в дикарбоновых и диаминокислотах, сульфгидрильная группа цистеина, фенольный гидроксил тирозина, имидазольное кольцо гистидина, гуанидиновая группировка аргинина и т. д.). Изменение pH среды влияет на состояние ионизации этих групп и, следовательно, на заряд молекулы фермента. В зависимости от pH среды изменяется пространственное расположение полипептидных цепей молекулы фермента, что сопровождается сближением или удалением некоторых функциональных групп. Наибольшее значение, по-видимому, имеет характер ионизации групп активного центра и близлежащих функциональных групп. [c.231]

Белки обладают, по существу, теми же ионными группами, что и аминокислоты. Однако в белке большинство сс-аминогрупп и с -карбоксильных групп связаны друг с другом пептидными связями. Кислые группы белков представлены главным образом свободными карбоксильными группами аспарагиновой и глутаминовой кислот, ионизация которых соответствует рК 3,87 и 4,28 (табл. 7). К основным группам белков относятся гуанидиновые группы аргинина (рК 12,48) и е-аминогруппы лизина (рК 10,53). Гидроксильные группы тирозина и сульфгидрильные группы цистеина отдают свои протоны в одной и той же области pH (рК около 10), в то время как имидазольные группы гистидина титруются вблизи pH 6 (табл. 7). [c.81]

Диксон разработал метод, который позволяет на основе данных по ферментативной кинетике идентифицировать функциональные группы, входящие в активный центр фермента. Если связывание субстрата или сам катализ сопровождаются диссоциацией функциональных групп белка или субстрата, то, используя кривые, характеризующие зависимость величин lg Утах, — gKм и lgvo от pH, можно приблизительно определить природу этих функциональных групп К В благоприятных случаях на графиках будут наблюдаться резкие перепады при значениях pH, соответствующих значениям рКа функциональных групп, непосредственно участвующих в ферментативном акте. Как известно, многие ферменты содержат каталитически важные сульфгидрильные и имидазольные группы, и приходится лишь сожалеть, что теплоты ионизации этих двух групп почти одинаковы. Если бы это было не так, то, используя метод Диксона, а также уравнение (4.51), можно было бы не только обнаруживать, но и различать эти два вездесущих нуклеофила. [c.248]

Для бутирил- и пропионилхолинэстераз показано, что в их эстераз-ных центрах находится по одной основной нуклеофильной группе с рК 5,8—7,0 и по кислой электрофильной группе с рК 8,9—9,5. Имидазольная группа гистидина — единственная группа белка с рК5,6— 7,1 среди основных групп белка. Теплота ионизации для холинэсте- [c.165]

Нуклеофильный атом азота имидазольной группы гистидина оттягивает на себя протон, активируя молекулу перекиси водорода, которая замещает ОН-группу у атома железа. Последняя протонируется гистидином и образует молекулу воды. Первое пероксосоединение Ре +—О—О—Н разлагается с образованием еще одной молекулы воды, одновременно присоединяя вторую, депротонированную гистидином молекулу Н2О2. Для регенерации исходной структуры активного центра достаточно обратимой ионизации имидазола, что является довольно быстрым процессом в области pH от 6 до 8. [c.216]

Что касается связи пиридоксального остатка с апоферментом, то она осуществляется за счет фосфатной группы (для катализа она не нужна), водородной связи с азотом пиридинового кольца, гидрофобной связи метильной группы и электростатической связи ионизированного фенольного гидроксила. Ковалентная связь с апоферментом появляется периодически на стадии образования внутреннего шиффова основания. Переход в активном центре при pH 6,3 сопоставляется [25[ с ионизацией фенольного гидроксила. Путем избирательного воздействия на отдельные белковые группы молекулы фермента показано [30, 32, 33[, что в его активном центре расположены одна или две имидазольные группы [25], блокирование которых приводит к инактивации фермента. Резкое снижение активности наблюдается и при блокировании одной сульфгидрильной группы. Эти группы, вероятно, и принимают участие в кислотно-основных превращениях промежуточных шиффовых оснований, хотя в наиболее распространенных механизмах реакции трансаминирования [25] обсуждается лишь действие аминогруппы лизина на нескольких стадиях катализа. Это недостаточно оправдано хотя бы потому, что при pH, соответствующем реакции трансаминирования, аминогруппа является хорошим акцептором, но плохим донором протона, что немедленно затормозит реакцию на стадии депротонирования ЫНз-группы. Кроме того, по стерическим причинам мало вероятно, чтобы одна и та же аминогруппа могла служить эффективным акцептором протона к С -атому пиридоксаля — и фактическим акцептором протона от а-углеродного атома аминокислоты. Поэтому в дальнейшем приводится механизм реакции трансаминирования, следуя работе Полторака [2[, в которой рассматриваются каталитические функции всех кислотно-основных групп активного центра аспартаттрансаминазы. [c.226]

По зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации водородных иопов можно определить, какие ионогенные группы фермента участвуют в каталитическом процессе (входят в активный центр фермента). Так как группы, входящие в активный центр фермента, могут выполнять каталитические функции только в определенной ионной форме, то, определив константу ионизации (р ) этих групп, можно сделать предположение о присутствии той или иной функциональной группы в активном центре фермента. Например, для целого ряда гидролитических ферментов значение рК лежит в области 6,5—7,5 и совнадает со значениями рК имидазольной группы свободного гистидина. [c.232]

Лучше изучен аминокислотный состав боковых цепей недеградированного белка. Потенциометрическим титрованием обнаружено присутствие 51 потенциально отрицательно заряженных групп (карбоксильные и фосфатные остатки) 5 групп, титрующихся в участке расположения имидазольной группы 22 остатка лизина и 14 гуанидиновых групп, что находится в хорошем соответствии с аналитическими данными [19]. Была исследована ионизация остатков тирозина измерением поглощения в ультрафиолетовой области при различных величинах pH. Тирозиновые остатки инсулина ионизируются при величине pH немного выше 10, в то время как тирозиновые остатки нативного яичного альбумина не ионизируются при pH 12. При pH около 12,5 происходят быстрые и необратимые изменения фенольные группы ионизируются и остаются в ионизированном состоянии даже тогда, когда pH повторно сдвигается в область ниже 12. При этом белок денатурируется. Более того, яичный альбумин, который денатурируют другими методами, содержит остатки тирозина в ионизированном состоянии при pH ниже 12 [20]. Причина этого явления, наблюдаемого как для альбумина, так и для некоторых других белков [21], пока не ясна. Водородные связи фенольных гидроксильных групп с другими группами внутри молекулы могут быть необходимы для поддержания четвертичной структуры нативного белка [22]. С другой стороны, непосредственное окружение фенольных групп внутри молекулы может быть сильно изменено денатурацией [20]. Некоторые из боковых групп нативного белка недоступны для действия химических реагентов. Как можно было ожидать, остатки тирозина легко реагируют с кетонами только после денатурирования белка [23]. Из общего числа е-аминогрупп альбумина, равного 20, только три группы реагируют с 1-фтор-2,4-динитробензолом в условиях, когда белок не денатурирован [24]. [c.10]

На основании последующих исследований был сделай вывод, что кз катализируемого химотрипсином гидролиза этилового эфира ацетил-/,-тирозина, этилового эфира ацетил-1.-трш1тс>фана и амида aцeтил-L-тиpoзинa зависит от ионизации группы с кажущейся р/Са, равной 6,7 (388, 389]. Эти данные можно объяснить участием имидазольной группы гистидина о каталитическом процессе. Применение метода, заключающегося в изучении влияния pH в стадии катализа, является само по себе важным достижением в деле изучения активной области гидролитических ферментов, так как ранее обычно рассматривалась только графическая зависимость общей скорости ферментативных реакций от pH, имеющая колоколообразную форму. [c.143]

Начальная быстрая реакция может быть исследована струйным методом. Применив этот метод, чтобы проследить как стадию реакции, предшествующую стационарному состоянию, так и стадию, соответствующую устойчивому состоянию, удалось показать, что кинетика реакции отвечает приведенной выше схеме 393]. Для первой стадии, заключающейся в быстрой адсорбции субстрата на ферменте, константа скорости (k ), по-видимому, больше, чем 10в секг моль . Для второй стадии — ацилирования фермента и одновременного освобождения л-нитрофенола (Pi)—константа равна 3 селг. Третья стадия состоит в отщеплении ацетата (Рг)и реактивации фермента, причем константа скорости равна 0,0254 се " [393]. При использовании в качестве субстратов /г-нитрофенилацетата и 2,4-динитрофенилацетата было найдено, что константа скорости реакции 2 и Аз зависит от pH, причем h зависит от группы с кажущейся константой ионизации 6,7, а Аз зависит от группы с кажущейся константой ионизации 7,3 389] или 7,4 (377]. При pH 6,6 фермент в целом переносит от буфера на ацилирование химотрипсина /г-нитрофенил-ацетатом 0,5 протона (389]. Если бы имидазольная группа заметно ацилировалась, то при этом значении pH можно было бы ожидать отщепления протонов под действием фермента. [c.144]

Амидг.1дролазы рассмотренных типов отличаются еще одной важной характеристикой рЧ-оптимумом каталитической активности (пм. разд.Б.2.3). Эти раз-пчш хоро по согласуются с различиями каталитического аппарата этих ферментов. Наличие у сериновых, цистеиновых и мьталлоэндопьптидаз каталитически активного остатка гистидина, функционирующего как общее основание и общая кислота, ограничивает интервал pH состоянием ионизации имидазольной группы этого остатка. Характерно, что у цистеиновых ферментов, функционирующих при pH 5-6, значение рК имидазольной группы в ацилферменте снижено до 4-4,5. В свободном ферменте рК увеличивается до 8, что обеспечивает существование стабильной ионной пары 1тН ...5 (см. разд.7.1). [c.346]

Наличие рядом с ОН-группой серина положительно заряженного имидазольно-го кольца резко облегчает ионизацию этой группы серина, так что в значительной, а возможно, и подавляющей части молекул она находится в виде соответст вующего аниона. Протонирование имидазольиого цикла 1Из-57 осуществляется с помощью расположенной рядом с ним карбоксильной группы остатка Азр-Ю2. Ионизация резко повышает нуклеофильный характер остатка серина, который атакует пептидную связь с отщеплением С-концевой половины расщепляемого полипептида и образованием продукта ковалентного присоединения его N-кoнцe-вой половины по остатку 5ег-195 в виде ацилфермента. На второй стадии ацил-фермент гидролизуется с отщеплением N-кoнцeвoй половины гидролизуемого полипептида и регенерацией активного центра. Схема двустадийного гидролиза пептидной связи сериновыми протеазами, таким образом, может быть записана в виде [c.205]

Такое поведение характерно для имидазольной или аминогруппы, но не для тнрозинового или серинового гидрокспла. Теплота ионизации группы, принимающей частие в лимитирующей стадии, составляет 7 ккал/моль для трипсина [74а] и 11 ккал/моль для а-химотрипсина [53]. Величина ЛЯ для имнд-азольной группы гистидина в белках равна 6,9—7,5 ккал/моль, а для фенольной группы тирозина - 6,0 ккал/моль. Естественно, необходимо учитывать то обстоятельство, что, если механизм реакции включает предравновесные стадии или конформацион-ные превращения, предшествующие лимитирующей стадии, то величина ЛЯкаж не обязательно должна быть идентичной ЛЯ . [c.258]

Полученные результаты позволили сделать определенные выводы о трех группировках активного центра, значения р/С для которых составляли 5, 6 и 6, 7. На основании зависимости этих величин от температуры был сделан вывод, что наименьшее значение р/С относится к карбоксильной группе (слабая температурная зависимость), а наибольшее — к имидазольной группировке (сильная температурная зависимость). Природа группировки с промежуточным значением р/С, равным 6, оставалась (и остается до сих пор) неясной. Сама величина р/С 6 может быть отнесена к имидазолу, но вместе с тем она не зависит от температуры, что характерно для карбоксила. Авторы предполагают, что это имидазол с аномальной величиной АН ионизации, однако признают, что для окончательного доказательства этого предположения, нужны дополнительные данные. В этой работе были установлены детали механизма действия рибонуклеазы, в том числе обнаружены реакции изомеризации свободного фермента и комплекса фермент—продукт. Тшатель-ность кинетического анализа, проведенного в этой работе, позволяет отнестись с доверием к предложенному авторами химическому механизму действия рибонуклеазы, хотя не вполне ясно, действительно ли все обнаруженные реакции изомеризации входят в последовательность каталитических реакций. [c.218]

Третье предположение было выдвинуто Каннингемом [31], который считал, что хотя р/С фосфорилируемой группы активного центра химотрнпсина и подтверждает участие гистидина в реакции, но теплота ионизации этой группы (определенная по изменению р/С в зависимости от температуры) выше, чем найденная для гистидина. Как и Портер и др., Каннингем считал, что в активном центре находится модифицированный серин , но, по его мнению, серин был модифицирован соседним имидазольным кольцом (возможно, принадлежащим гистидину). Его гипотеза применима также и для холинэстеразы. [c.104]

Электрофорезом называют физический процесс разделения заряженных частиц в электрическом поле постоянного тока. Заряды на поверхности белков возникают вследствие ионизации карбоксильных, амино-, имидазольных, фенокси- и сульфгид-рильных групп, а также при связывании ионов. Многочисленные методы электрофореза, предназначенные для разделения белков, классифицируют в зависимости от типа электролитической системы, типа носителя и даже конструкции аппаратуры и способа обнаружения. [c.111]

Вместо второй амино- или карбоксильной группы боковая цепь аминокислоты иногда содержит другую химическую группу, которая при определенном значении pH также ионизуется. К таким группам относятся фенольная, (тирозин), гуанидиновая (аргинин), имидазольная (гистидин) и сул1 гидрильная группа (цистеин). Ясно, что степень ионизации различных основных групп аминокислот при одном и том же pH будет различной. Более того, небольшие различия могут наблюдаться даже у одной и той же группы. Эти различия используют при электрофоретическом и ионообменном разделении смесей аминокислот, имеющихся, например, в белковом гидролизате. [c.23]