Полимеризация верхнего геля

Растворы мономеров и катализаторов готовят на буферном растворе (pH 8,9) и смешивают в стеклянных трубочках для полимеризации. Для разделения липопротеинов сыворотки крови применяют дифференциальный электрофорез, используя три слоя гелей с концентрацией акриламида, повышающейся от верхнего слоя к нижнему. [c.154]

Полимеризация верхнего геля [c.283]

Электрофорез проводят в стеклянных трубках длиной около 70 мм с внутренним диаметром около 5 мм. Перед употреблением трубки тщательно промывают смесью хромовой и серной кислот или горячей азотной кислотой, водой и в заключение ацетоном. Сухие трубки держат вертикально и дно их закрывают резиновым уплотнением так, чтобы резина не входила в трубку. В качестве уплотнения можно использовать резиновые крышки к флаконам для сыворотки, перевернув их наоборот. Исходные растворы для приготовления геля (см. табл. 12.6 и 12.7) хранятся при 4°С в темных бутылях, которые выдерживают при комнатной температуре и откачивают водоструйным насосом, чтобы уменьшить содержание кислорода, ингибирующего полимеризацию. Если нижняя часть столбика геля не достаточно ровная, то в каждую трубочку вводят 0,1 мл 40%-ного раствора сахарозы и осторожно покрывают смесью для полимеризации разделяющего геля (табл. 12.7) до заранее отмеченной высоты, например 50 мм, т. е. около 2 мл смеси для полимеризации. Далее этот слой сразу же очень осторожно из шприца с тонкой иглой (по стенке трубки) покрывают 0,1 мл воды. Во время полимеризации трогать трубки не рекомендуется. После завершения полимеризации разделяющего геля воду удаляют ватным тампоном. Сухую поверхность разделяющего геля сначала промывают примерно 0,1 мл раствора для приготовления промежуточного геля (табл. 12.8), затем вводят 5 мм слоя (0,2 мл) раствора для приготовления промежуточного геля и быстро и осторожно покрывают 0,1 мл воды. Трубку освещают сверху флуоресцентной лампой со спектром дневного света, удаленной максимум на 50 мм. После окончания фотополимеризации слой воды удаляют, а поверхность геля промывают либо буферным раствором из верхней электродной камеры (табл. 12.9), если образец наносят в растворе, либо вновь раствором для приготовления фокусирующего геля, в который вместо воды добавляют образец. Если анализируются химически лабильные соединения, например ферменты, образец лучше наносить в виде [c.302]

В тех случаях, когда готовят двухслойный гель, по окончании полимеризации нижнего геля воду отсасывают, поверхности промывают буфером верхнего геля, заливают этот последний и уже [c.28]

В центре резервуаров в специальных держателях закреплены электроды. В дне верхнего резервуара имеются отверстия для стеклянных трубочек, которые укрепляются зажимными кольцами с резьбой (прилагаются к прибору вместе с конусными и резиновыми кольцами-прокладками). Для полимеризации геля тщательно вымытые трубочки фиксируют на специальной подставке из оргстекла. Герметичность сборки проверяется заранее, до заполнения их гелем. [c.95]

Стеклянные трубки для геля и подставка для них. Колонки геля готовят в стеклянных трубках, имеющих длину 100 мм и внутренний диаметр 6 мм. На время полимеризации геля их вставляют в специальную подставку, представляющую собой двухслойную плексигласовую пластинку, в верхнем слое которой высверлены отверстия для трубок (фиг. 12, А). Трубки устанавливают вертикально и закрепляют внизу завинчивающимися плексигласовыми кольцами и резиновыми прокладками (фиг. 12, Б). [c.88]

Далее готовят разделяющий гель. Поверхность концентрирующего геля дважды быстро промывают смесью для получения разделяющего геля, а затем с помощью шприца заполняют трубку этой смесью так, чтобы получился выпуклый мениск, стараясь избежать образования пузырьков воздуха. Затем конец трубки плотно заклеивают полимерной пленкой. Всю эту процедуру необходимо провести в течение 5 мин после образования концентрирующего геля. Как только полимеризация закончится (через 30—40 мин), осторожно снимают колпачок, переворачивают трубку и аккуратно вставляют ее в резиновый колпачок нижним концом. Из другого конца, ставшего теперь верхним, удаляют раствор сахарозы и промывают поверхность концентрирующего геля смесью такого же состава. Затем наносят образец, включенный в смесь для приготовления стартового геля, и осторожно наливают электродный буфер до верхнего края трубки, не допуская перемешивания двух слоев. [c.263]

ПААГ хорошо прилипает к стеклу даже при малой концентрации акриламида (менее 5%). Это существенно для поддержания геля в устройствах с вертикальным расположением трубок или пластин. Кроме того, хорошее прилипание улучшает теплопередачу от геля к стеклу и уменьшает опасность образования шунтирующей ток пленки жидкости у поверхности стекла. Такой шунт, а иногда и канал, по которому вытекает буфер из верхнего электродного резервуара, может образоваться между боковыми торцами пластины геля и прокладками, определяющими его толщину, в случае загрязнения прокладок или неудачного выбора их материала. Прокладки из тефлона, плексигласа или чистой силиконовой резины не мешают полимеризации геля вблизи их поверхности. Однако некоторые сорта резины с наполнителями, а также смазки, которыми нередко герметизируют прокладки, могут препятствовать полимеризации. Смазку (лучше всего силиконовую) следует наносить тонким валиком из шприца со снятой иглой на таком расстоянии от внутреннего края прокладки, чтобы она не выдавливалась внутрь формы при ее сжатии пружинными зажимами (см. ниже). Для достаточно ровных стекол тефлоновые прокладки можно использовать без смазки. [c.12]

Собрав прибор, заливают буфер в верхний электродный резервуар. При полимеризации геля часть трубки с верхнего ее конца оставляют свободной, и туда при заливке попадает электродный буфер. Затем под него, на поверхность геля, пипеткой с оттянутым полиэтиленовым наконечником наслаивают препарат, в который добавляют предварительно 5—10% сахарозы. Наконечник пипетки не следует подносить вплотную к поверхности геля препарат должен выливаться с высоты 2—3 мм над гелем и свободно растекаться по его поверхности за счет своей повышенной плотности. При любом варианте электрофореза надо быть уверенным в том, что исходный препарат свободен от взвешенных частиц (пыли или осадков), которые будут собираться на торце геля и нарушать однородность тока по его сечению, что повлечет за собой деформацию разделяющихся зон. В этом случае препарат следует отфильтровать или очистить центрифугированием. [c.23]

М трис-буфере, доведенном НС1 до pH 8.8. Полимеризация инициируется удалением воздуха из раствора и добавлением тетраметилэтилендиамина (до 0,8%) и персульфата аммония (до 0,015%). Пока не произойдет полимеризация, разделяющий гель держат под слоем воды. Воду выливают и наслаивают концентрирующий гель, или гель для нанесения, содержащий 4,5% акриламида, 0,12% бисакриламида и 0,1% ДСН в 0,125 М трис-буфере, доведенном НС1 до pH 6,8. Этот гель по-лимеризуется добавлением тетраметилэтилендиамина (до 0,125%) и персульфата аммония (до 0,05%). Перед полимеризацией, чтобы сформировать лунки для проб, в концентрирующий гель вставляют тефлоновую (фторопластовую) гребенку. После полимеризации образовавшиеся лунки промывают несколько раз электродным буфером, содержащим небольшое количество бромфено-лового синего. При этом удаляется непрореагировавший персульфат, а границы лунок слегка окрашиваются, так что их можно видеть при нанесении проб. Верхний электродный буфер содержит 0,182 М глицин, 0,0255 М трис (конечное значение pH 8,3) и 0,1% ДСН. Нижний электродный буфер содержит те же компоненты, за исключением ДСН. [c.157]

Первоначальная процедура заполнения трубок ак-риламидом, описанная Орнстейном [67] и Дэвисом [64], начиналась с полимеризации разделяющего геля в нижней части трубки. Позже была предложена методика [66], по которой разделяющий гель полимеризуется в верхней части трубки, так как при этом образуется более однородная граница раздела между концентрирующим и разделяющим гелями. Заполнение трубки проводят следующим образом. В резиновый колпачок наливают 0,2 мл 40%-ного раствора сахарозы и плотно прижимают трубку к дну колпачка, для того чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха. Трубку устанавливают в вертикальное положение затем готовят около 0,15 мл смеси для получения концентрирую -щего геля (см. ниже) и с помощью небольшого шприца с иглой (длина 8 см, внутренний диаметр 0,6—0,8 мм) наслаивают эту смесь на раствор сахарозы. На поверхность концентрирующего геля осторожно наливают немного воды так, чтобы не произошло перемешивания этих двух слоев и между ними образовалась резкая граница. Высокое разрешение достигается в основном благодаря образованию четкой ровной границы между [c.262]

Прежде чем налить раствор верхнего концентрирующего геля, сливают бутанол и слой незаполимеризовавшегося раствора и промывают край нижнего геля верхним буфером. Остатки буфера можно удалить полоской хроматографической бумаги, не касаясь поверхности геля. Затем вставляют шаблон в виде гребешка (рис. 3, ) так, чтобы до поверхности нижнего геля оставалось около 5 мм, и заливают раствор верхнего геля. Гель оставляют для полимеризации на 30 мин, а затем пластинку сразу же используют в диск-электрофорезе, так как со временем различие в pH между верхним и нижним гелями сглаживается и в результате концентрирующая способность верхнего геля падает. После полимеризации концентрирующего геля нижнюю плексигласовую прокладку удаляют и камеру помещают в аппарат для [c.102]

Для приготовления кислых гелей смешивают 3 мл раствора В, 6 мл раствора А н 15 мл мочевины полимеризацию проводят, добавляя 27,5 мг персульфата аммония в 24 ил °М мочевины. Верхний гель получают фотополимеризацией 0,4 мл раствора В, 2 мл раст-. Еора Г и 5,6 мл 8 М мочевины с 0,1 мл раствора Д. Верхнюю и ннжнюю электродные Камеры заполняют раствором, содержащим 31,2 г Р-аланина н 8 мл уксусной кислоты в 1 л Дистиллированной воды. Белки элюируют раствором, содержащим 19 мл уксусной кислоты, г ацетата аммония и 800 мл ЮМ мочевины. [c.115]

В одной из стеклянных пластинок формы для геля второго направления делали вырез, подобно тому как это предусмотре- но в приборе Стадиера для электрофореза в вертикальных пластинах [Остерман, 1981]. Верхний электродный резервуар иа плексигласа (который при ИЭФ не должен быть- объемистым) имел точно такой же вырез в передней стенке. Этот резервуар через резиновые прокладки зажимами крепили прямо на пластинки геля, совмещая вырезы. При полимеризации верхнего, формирующего геля на поверхность раствора в вырез пластинки укладывали стеклянную палочку диаметром 3 мм (при толщине геля 0,8 мм). Таким образом, на торце геля после полимеризации образовывался желобок. В него с листа парафильма скатывали длинный и тонкий цилиндрик геля, расправляли его. и заливали расплавленным 1%-ным раствором агарозы. Плас-тину геля до уровня верхнего резервуара погружали в 20-литровый аквариум, заполненный нижним электролитом. Электрофо-рез вели в течение 10 ч при силе тока 50 мА. После фракциони- рования 20 мкг белка из клеток тимуса крысы с исходной С-радиоактивностью 5 10 имп./мин авторадиография при двухнедельной экспозиции выявляла 1750 пятен. В том же объ- екте при использовании гелей обычного размера обнаруживаются только 500 пятен. [c.49]

Для заливки и полимеризации геля нижние торцы трубок заклеивают парафильмом или лейкопластырем и устанавливают их строго вертикально в штатив. Деаэрированный раствор мономеров сразу после добавления и надежного смешивания с ним раствора персульфата аммония заливают по стенке трубки из пипетки с полиэтиленовым наконечником так, чтобы верхний участок трубки, предназначенный для внесения препарата, оставался сухим. Затем осторожно по стенке наслаивают воду или изобутанол и ведут полимеризацию, как описано в предыдущем разделе. Если готовят гель для ступенчатого электрофореза (см. ниже), то после окончания полимеризации нижнего (рабочего) геля воду стряхивают, споласкивают поверхности буфером верхнего (формирующего) геля и точно так же заливают слой раствора мономеров верхнего геля, а затем наслаивают на него воду или изобутанол. Перед установкой готовой трубки с гелем в прибор парафильм снимают, а ее свободный конец промывают верхним электродным буфером. [c.23]

Полимеризация полиакриламидного геля есть каталитический процесс, протекающий с помощью тетраметилендиамина и персульфата аммония. Хорошо известно, что последний при длительном хранении своих водных растворов частично теряет реакционные свойства и в связи с этим рекомендуется использование свежеприготовленных растворов. Для исключения многократного взвешивания персульфат аммония поставляется некоторыми фирмами в виде желатиновых капсул с заранее отвешенными количествами. Удобство использования таких фасовок может оборачиваться при секвенировании ДНК нежелательным эффектом размазывания полос ДНК в верхней части геля [Kamps-Holtzapple, Stanker, 1995]. Этими авторами был проведен модельный эксперимент, в котором выяснилось, что именно желатин оказывает такой отрицательный эффект, и они советуют в связи с этим просто вскрывать капсулы и высыпать их содержимое, исключив, таким образом, растворение желатины. Довольно сильным ингибитором полимеризации является растворенный в воде кислород, и для его максимального удаления рекомендуется дегазация уже готового раствора мономеров перед добавлением инициатора и катализатора этого процесса. [c.173]

Смесь для полимеризации следует готовить в количестве, необходимом для опыта. Если используют, например, 12 трубочек, нужно приготовить 30 мл смеси. Осторожным вращением колбочки раствор перемешивают и вносят пипеткой в трубочки, укрепленные в подставке, следя за тем, чтобы пузырьки воздуха не попали внутрь полимеризуемого геля. Уровень вносимой жидкости должен находиться на расстоянии 1—1,5 см от верхнего края трубочки. Сверху осторожно наслаивают воду (0,2—0,3 мл) для образования ровной поверхности геля. Полимеризация обычно заканчивается через 20—40 мин, что определяют по образованию хорошо видимой границы между гелем и водой. По окончании полимеризации наслоенную воду удаляют фильтровальной бумагой. Трубочки снимают с подставки и ввинчивают в отверстия дна верхнего буферного резервуара (рис. 10, /). Верхний резервуар присоединяют к нижнему, предварительно заполненному электродным буферным раствором. Следят за тем, чтобы на концах трубочек не было пузырьков воздуха. На поверхность геля микропипеткой наносят растворы белков. Количество наносимого белка зависит от его гомогенности для индивидуального белка — 25—50 мкг, для гетерогенных смесей это количество может быть увеличено до 50—250 мкг. Плотность наносимых образцов белка повышают добавлением 40%-ного раствора сахарозы до конечной концентрации 0,5 М (20%,). Это необходимо для предотвращения смешивания белка с электродным буфером. Высокая ионная сила исследуемых образцов мешает четкому разделению белков, поэтому такие растворы следует предварительно обессолить. [c.96]

Чтобы поверхность геля была идеально гладкой, трубки по прсмя. полимеризации нсльая сдвигать с места. После окончания реакции поду осторожно отсасывают с по-мощг.ю тонкой пипетки, трубки вынимают т пробок и устанавливают в верхней части аппарата для электрофореза (см, рис. 0). [c.42]

Колонку геля готовят точно так же, как и для щелочной системы анализа. Затем на ее верхнюю часть пипеткой наносят 0,2 мл раствора мономеров, предназначенного для приготовления крупнопористого геля. Еще выше осторожно наслаивают 5—8 мм разбавленного в8раз раствора Б . После этого трубки стелем 15—20мин освещают электрическими лампами мощностью 400—500 Вт на расстоянии 15—20 см до наступления полимеризации, о чем можно судить по появлению опалесценции геля. Жидкий слой сверху удаляют фильтровальной бумагой и вместо него наносят исследуемый раствор. В отличие от анализа в щелочной системе исследуемый раствор перед нанесением разводят в 8 раз разбавленным раствором Б . В остальном все элементы процедуры аналогичны щелочной системе анализа. [c.92]

Однако для определенных условий полимеризации может существовать более чем одно стационарное значение х. Это наступает, например, тогда, когда в системе очень сильно увеличивается скорость, в связи с ярко выраженным гель-эффектом, в особенности при скоростях, близких максимальным значениям. Явление возможно и тогда, когда концентрация мономера в загружаемых реагентах настолько велика, что происходит полимеризация в растворе. При таких условиях верхнее значениех обычно соответствует устойчивому процессу, т. е. при временном уменьшении конверсии увеличивается скорость и, таким образом, восстанавливаются стационарные условия. Однако более низкие значения х — неустойчивы, так как временное уменьшение конверсии уменьшает скорость полимеризации еще больше, так что она достигает очень малого предельного значения, которое соответствует третьему решению уравнения (IV.82). В таких случаях, поэтому, важно приближать процесс к устойчивой области и следить за тем, чтобы начальное содержание реактора также отвечало этой области. [c.217]

Смесь мономера, инициатора, агента передачи цепи и привитого сополимера-стабилизатора в гептане непрерывно подают в верхнюю часть реактора с мешалкой, обеспечивающей быстрое распределение подаваемой шихты в полимерной дисперсии, заполняющей реактор. Этим обеспечивается быстрая адсорбция мономера на частицах полимера, способствующая микроблочной полимеризации, ускоренной благодаря гель-эффекту. Дисперсионная полимеризация проводится с азоинициатором при 90—95 С, т. е. несколько ниже температуры кипения гептана. Для достижения конверсии полимера 97—99% время пребывания в реакторе составляет 10—20 мин. В случае метилметакрилата получена полимерная дисперсия с содержанием твердых веществ 60%, а полимер обладает высокой однородной молекулярной массой и размером частиц в интервале 0,1—5 мкм. [c.249]

Сформулировать принципы выбора состава смесей для получения жестких насадок с различными степенями проницаемости можно после того, как будут рассмотрены взаимосвязанные влияния сшивающего агента и разбавителя на структуру геля. Достаточная жесткость может быть получена при наличии 8—12% сшивающего агента в смеси мономер — разбавитель. Различные степени проницаемости при малых количествах добавленного сшивающего агента получили в результате изменения количества разбавителя с хорошим сродством к гелю. Изменение структуры геля при варьировании количества разбавителя, например при замене стирола толуолом, должно быть аналогичным различным стадиям полимеризации в неразбавленном сополимере. Сначала образуется гель с низкой степенью сшивания и слабо развитой тонкой структурой. Так, диапазон размеров молекул, фракционируемых на геле, приготовленном в присутствии 80% толуола, был весьма близок к верхнему пределу. В присутствии 60% толуола верхний предел размеров пор значительно уменьшился. Набухший в толуоле гель, полученный при содержании в смеси 8% дивинилбензола и 92% стирола в отсутствие разбавителя, был весьма мелкопористым и его калибровочная кривая поднималась вверх в области нижнего предела. В этой связи следует упомянуть также работу Миллара с сотр. [203]. [c.139]

В тех случаях радикальной полимеризации, когда не происходит замедления реакции обрыва (эффект Тромсдорфа — Норриша, гель-эффект), невозможно достигнуть 100%-ного превращения. Верхний предел превращения в каждом случае зависит от условий полимеризации. Это явление получило в английской литературе специфическое название dead end radi al polymerization [131 —134]. [c.26]

Самый распространенный недостаток электрофореза в полиакриламиде состоит в искривлении полос вследствие неправильно проведенной полимеризации. Чтобы этого не было, гелевые растворы нужно тщательно дегазировать перед заливкой, а верхнюю кромку разделяющего геля после полимеризации несколько раз промывать, чтобы удалить все остатки незаполимеризовавше-гося геля. Реактивы для электрофореза бывают разными по чистоте, и для того, чтобы время полимеризации было всегда постоянным, необходимо увеличивать или уменьшать количество персульфата аммония. Для разделяющего геля оптимальное время полимеризации составляет 30 мин. При большей длительности гель становится мягким или не полностью полимеризуется, а при меньшей — полимеризация может пройти неравномерно, что приведет к появлению волнистых белковых полос. Персульфат аммония очень гигроскопичен и не отличается стабильностью. Рекомендуется готовить исходный концентрированный раствор персульфата аммония (50 мг/мл), который хранят в замороженном состоянии порциями по 1 мл. Такой раствор стабилен в морозильной камере в течение нескольких месяцев. [c.158]

Использование персульфата для полимеризации позволяет получать гели с различной пористостью и электрофоретическими свойствами. Поэтому важно, чтобы полимеризация проходила при стандартных условиях. Персульфат может вызывать артефакты, которых легко избежать, если заменить персульфат рибофлавином и использовать фотолитическую полимеризацию вместо химической или применять восстанавливающие агенты, например тиогликолат (0,01—0,001 часть на 1 часть глицина в буфере). С той же целью можно добавлять мер-каптоэтанол (5 мМ) в концентрирующий и стартовый гели и в верхний буфер. Для удаления персульфата и других примесей иногда проводят предварительный электрофорез, но это нарушает прерывистость электрофоретической системы, превращая ее в однородную систему, что не всегда позволяет достичь нужного разрешения. [c.266]

Тритон Х-100 не влияет на разделение белков, но облегчает извлечение гелей из капилляров. Под действием гндаито-ина белковые полосы становятся более узкими. В электродном буфере глицин можно полностью заменить гидантоином [915]. Капилляры заполняются растворами гелей на /2—% нх длины под действием сил поверхностного натяжения. Затем их втыкают в толстый (около 2 мм) слой пластилина, налепленного на дно небольшой чашки Петри. На поверхность раствора геля очень тонкой стеклянной пипеткой наслаивают воду вплоть до верхнего края капилляра. Это нужно делать чрезвычайно осторожно, чтобы избежать перемешивания воды с гелем. Полимеризацию гелей производят в вертикальном положении, причем желательно до употребления выдерживать их не менее 10 ч [c.108]

Сузуки и др. [1253] предложили использовать электрофорез для выделения белков из любого типа геля после любого способа их фракционирования. Вырезанный участок геля с белковой зоной помещают в стеклянную трубку поверх слоя предварительно заполимеризованного геля, который не доходит на несколько миллиметров до нижнего конца трубки. Этот гель можно приготовить следующим образом. Сначала, как обычно, закрывают дно трубки н в нее до желаемой высоты наливают концентрированный раствор сахарозы или глицерина, на который затем аккуратно наслаивают забуференную смесь компонентов полиакриламидного геля. После полимеризации сахарозу или глицерин удаляют, дно трубми затягивают диализной мембраной, а образовавшееся между ней и гелем пространство заполняют буферным раствором. Такую трубку с находящимися в ее верхней части кусочками геля, содержащего сфокусированную при ИЭФ белковую полосу, устанавливают в аппарат для диск-электрофореза и проводят электрофорез в соответствующем буфере. Под действием электрического поля [c.151]

Система 3 [280]. Применяется для препаративного изотахофореза. 100 мл раствора акриламида [3,67% Т, 5% С, 0,012 М. трис —0,01 ЗМ какодилат (pH 7), 0,25 мг% рибофлавина, Ю мкл ТЕМЭД на 100 мл смеси] полимеризуют в стеклянной колонке длиной 30 ом (составная часть прибора Унифор фирмы ЬКВ-Рго(1ис1ег АВ). Полимеризация заканчивается после 3 ч облучения. Нижний электродный сосущ, и резервуар для буфера заполняют ведущим электролитом (0,012 М трис —0,013> М какодилат, pH 7), а замыкающий буфер (0,032 М трис — 0,188 М р-аланин, pH 8,95) наливают поверх геля и в верхний резервуар для буфера. Затем через капилляр, расположенный в верхней части прибора, на поверхность геля наносят слой амфолина (40%, ИЭТ 5—7) объемом 2 мл. Устанавливают постоянный электрический ток (10 мА), причем катод должен быть в верх1Н ем электродном сосуде. Через 5 ч после того, как весь амфолин войдет в гель, ток отключают и на поверхность геля через капилляр наносят пробу, состоящую из 2 мл сыворотки, смешанной с 2 мл замыкающего буфера. Затем вновь включают ток (10 мА) и начинают элюцию ведущим буфером. [c.177]

Для предотвращения возможного перемешивания растворов во время наслаивания буфера Флинт и Харрингтон использовали пробку, образующую границу раздела между двумя растворами [387]. Трубки для геля вставляют в резиновые крыщ-ки от флаконов с сывороткой и заполняют гелеобразующим растворой до уровня, находящегося на 3 см ниже верхнего края трубки. Затем на дно трубки опускают плексигласовую пробку для создания границы раздела. К открытому концу трубки присоединяют кусок тайгонового шланга и добавляют раствор мономеров до уровня, находящегося выше верхнего края трубки. После окончания полимеризации трубки вынимают из резиновых крышек и отделяют от шланга. Выступающие концы геля обрезают вровень с верхним краем трубок и с противоположного конца удаляют пинцетом плексигласовые проб-ки. Тонкую пленку геля, образовавшуюся между пробкой и внутренней поверхностью трубки, также удаляют. Таким образом в каждой трубке получается ровная однородная поверхность геля. [c.372]

Заливают раствор геля плавно, но быстро в форму с помощью шприца или пипетки, стараясь не оставить пузырьков воздуха. Сразу же после заливки на гель наливают слой воды, чтобы исключить доступ воздуха и улучшить полимеризацию. Это позволяет выровнить и сгладить верхний край геля. На гель можно нанести 0,1%- ный водный раствор ДСН, изо-лмиловый спирт, или н-бутанол (последние имеют меньщую плотность, чем вода, что снижает возможность смешивания с [c.59]

С приготовленного разделяющего (нижнего) геля отсасывают всю жидкость н на глубину 1,5 см вставляют гребешок , формирующий карманы для образцов (таким образом, между этими карманами и верхним краем разделяющего геля остается расстояние по крайней мере в 1,5 см). Смесь концентрирующего геля дегазируют и после добавления ТЕМЭД (0,001 объема) наносят пипеткой на дно выемкн в стеклянной пластинке, после чего заливают его сверху бутанолом, насыщенным водой, и оставляют иа 30—60 мнн для полимеризации прн комнатной температуре. Удаляют гребешок и промывают концентрирующий гель верхним буфером с ДСН. После этого камера готова для нанесения образца и электрофореза (см. разд. И1). [c.75]

Для приготовления щелочного разделяющего геля смешивают 16 мл раствора А, 9 мл Раствора Б и 30 мл 8 М мочевины полимеризацию проводят, добавляя холодный раствор, содержащий 22,5 мг персульфата аммония в 15 мл 8 М мочевииы. Концентрирующий гель готовят, смешивая 1,8 мл раствора А, 1,8 мл раствора Б и 7,8 мл 8М мочевины полимеризацию проводят, добавляя раствор, содержащий 4,5 мг персульфата аммония в 3 мл 8М мо-чивииы. Верхнюю и нижнюю электродные камеры заполняют трис-глициновым буфером (0,05 М трис, 0,4 М глицин). Собирающая ячейка омывается раствором, содержащим 52 г трис, 14 мл уксусной кнслоты и 800 мл ЮМ мочевииы. [c.115]

При ИЭФ в пластинах ПААГ и трубках существенно должны различаться способы внесечия препарата, поскольку в трубке его уже нельзя нанести на любой участок геля (и градиента pH). Здесь остаются только две возможности либо вносить белковый препарат в весь объем смеси мономеров до их полимеризации, либо наслаивать его на торец геля в непосредственном соседстве с электродными электролитами. Первый вариант не всегда выгоден, особенно для малых объемов препарата. Кроме того, в этом случае неизбежно имеет место взаимодействие белка с радикалами персульфата аммония, а также воздействие на него повышенной температуры в процессе полимеризации геля. В большинстве случаев белковый препарат вносят на торец геля в объеме 10—50 мкл раствора амфолитов с добавлением в него примерно 10% глицерина или сахарозы. Белки, как правило, следует оберегать от непосредственного контакта с электродными электролитами. Для этого рекомендуется после сборки прибора и заливки в верхний резервуар электролита вытеснить его из верхней части каждой трубки раствором амфолитов, а уже затем под него подслаивать растворы исходных препаратов. [c.39]

Электрофорез во втором направлении проводили по методу Лэммли, в пластине размером 20X16X0,15 см, используя вогнутый экспоненциальный градиент ПААГ (10—30%). Для того чтобы осуществить непосредственный контакт цилиндрика геля первого направления с торцом геля второго направления, при заливке последнего стеклянную форму наращивали резиновым кольцом и смесь мономеров заливали до уровня на 5 мм выше верхних краев стеклянных пластинок формы. После полимеризации кольцо снимали и гель обрезали вровень с краями стекол. Цилиндрик геля в этом случае можно не заливать агарозой, а просто прижать к торцу пластины, уложив на него стеклянную палочку, которую через 30 мин после начала электрофореза можно снять. Электрофорез начинали при силе тока 30 мА, з далее вели в течение 18 ч при 11 мА. Белки фиксировали в геле 10%-ным раствором СНзСООН в 40%-ном этаноле радиоактивные пятна регистрировали флюорографически. [c.56]

В аналитических опытах на каждой пластине обычно ведут электрофорез нескольких препаратов, состав которых можно затем сопоставить при идентичных условиях разделения. Как было локазано на фотографии (см. рис, 3), сопоставляемые препараты фракционируют в параллельных друг другу треках , В ходе полимеризации на верхнем крае геля формируют ряд одинаковых углублений прямоугольной формы — карманов , куда затем и вносят различные препараты. Для этого в еще не заполимеризовавшийся гель или горячую агарозу вставляют гребенку из тефлона или плексигласа такой же или чуть меньшей толщины, чем прокладки между стеклами. Прямоугольные зубцы гребенки и формируют карманы для препаратов. На рис, [c.27]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология