Олигонуклеотиды полимеризация

ДНК-полимераза I состоит из одного полипептида длиной 911 аминокислотных остатков (а. а.) (Air=102 000 D). Этот фермент отличается от прочих ДНК-полимераз Е. соИ наличием З -экзонуклеазной активности. Фактически ДНК-полимераза I — это два фермента на одной полипептидной цепи ограниченный протеолиз расщепляет эту ДНК-полимеразу на большой и малый фрагменты с разными активностями. Большой субфрагмент ДНК-полимеразы I (называемый также ДНК-полимеразой Кленова или фрагментом Кленова) обладает полимеризующей и З -экзонуклеазной (корректирующей) активностями. Малый субфрагмент несет З -экзонуклеазную активность, 5 -экзонуклеаза ДНК-полимеразы I действует на 5 -конец полинуклеотидной цепи только в составе дуплекса и отщепляет от него как моно-, так и олигонуклеотиды. Направление действия 5 -экзонуклеазы совпадает с направлением полимеризации новой цепи ДНК, т. е. в ходе полимеризации экзонуклеаза расчищает дорогу для полимеразы (рис. 29). Подобные свойства ДНК-полимеразы I соответствуют ее функциям в клетке эта полимераза удаляет различного рода дефекты из ДНК в ходе репарации и служит вспомогательной поли- [c.48]

Однако, несмотря на отмеченные здесь трудности, некоторые олигонуклеотиды и их мономеры все же были успешно разделены (см. литературу, приложение XV). Дело обстоит гораздо проще, когда речь идет о полимерах одного нуклеотида. При исследовании влияния длины цепи олигонуклеотидов на биосинтез белка потребовались олигонуклеотиды определенных размеров. Для этого синтетический полинуклеотид (применявшийся в качестве искусственной информационной РНК) частично гидролизовали ферментативным путем, а затем хроматографировали [81]. Например, из полиуридиловой кислоты на сефадексе 0-200 удалось получить фракцию со средней степенью полимеризации от 42 до 132, а на 0-75 —фракции со степенью полимеризации от 5,8 до 42. [c.223]

При использовании частично очищенного фермента образованию полимера предшествует индукционный период. Хотя индукционный период можно уменьшить, добавляя небольшие количества олигонуклеотида или полинуклеотида, полная зависимость реакции от присутствия такой затравки не установлена. Между затравкой и продуктом реакции существуют сложные отношения. Действие олигонуклеотидов при уменьшении индукционного периода, по-видимому, неспецифично. Например, соединение, состоящее из остатков адениловой кислоты, инициирует в одинаковой степени полимеризацию как УДФ, так и АДФ. [c.479]

ДНК расщепляется ДНК-азой панкреатической железы и слизистой кишечника с образованием динуклеотидов и олигонуклеотидов различной степени полимеризации, которые дальше расщепляются фосфатазой (например, слизистой кишечника) до мононуклеотидов и нуклеозидов. [c.377]

Химический синтез нуклеиновых кислот (в биологическом смысле этого слова) пока еще не осуществлен, однако в конечном счете это будет достигнуто при условии, что будет определена точная структура природных полимеров. Методы полимеризации мононуклеотидов оказались уже сейчас пригодными для синтеза олигонуклеотидов и низших полинуклеотидов при контроле последовательности нуклеотидов. [c.467]

Радиационная полимеризация свободных нуклеотидов дает небольшой выход олигонуклеотидов (порядка 0,15 молекул на 100 эв), содержащих в среднем по 10 мономерных единиц. В присутствии ДНК-затравки этот процесс может ускориться. Само собой отпадает предположение о том, что радиационная сборка мономерных единиц в полимерную цепь может иметь упорядоченный характер. [c.36]

I по одноцепочечной ДНК-матрице с использованием небольшого затравочного олигонуклеотида (праймера), комплементарного определенному участку матрицы, и радиоактивных дезоксирибонуклеозид-трифосфатов. Для каждой матрицы проводят четыре независимые реакции полимеризации, при этом каждый раз [c.114]

Во избежание циклизации образующихся олигонуклеотидов в реакци-онную смесь добавляют определенное количество регулятора молекул лярной массы (см. с. 150) — нуклеотида с защищенной, например ацети-лированной, гидроксильной группой. Такой нуклеотид как бы обрывает реакционную цепь наращивания олигонуклеотидов и делает невозможной ее циклизацию. Таким образом были синтезированы различные олигонуклеотиды со степенью полимеризации 15. При конденсации не мононуклеотида, а ди- или тетрануклеотидов различного строения получаются блоколигонуклеотиды , построенные из блоков, каждый из которых содержит различные нуклеотиды. [c.366]

Полученные полимеры по своим свойствам напоминают природные олигонуклеотиды под действием кислот и щелочей они распадаются с образованием смеси 2 - и З -фосфатов нуклеозидов, под действием фермента змеиного яда дают 5 -фосфаты нуклеозидов. Однако их отношение к панкреатической рибонуклеазе, избирательно расщепляющей только З -фосфаты, отличает их от природных РНК- Этот фермент, как уже указывалось выше (стр. 249), полностью расщепляет природный полимер синтетические полимеры, напротив, расщепляются лишь частично и разбиваются на олигонуклеотиды с меньшей степенью полимеризации, уже не способные к расщеплению указанным ферментом, но подвергающиеся кислому и щелочному гидролизу. Этот результат вполне естествен и подтверждает, что в синтетическом полимере, в отличие от природных РНК, наряду с 3 -5 -связью (VHI) имеется и 2 -5 -связь (IX), не расщепляющаяся панкреатической риГонуклеазой. Образование последней происходит при раскрытии полимеряого циклического фосфата (VII) наряду с полимером, характеризующимся 3 -5 -связью. [c.250]

Как всегда при выяснении строения сложного органического соединения, в том числе и специфического полимера, можно идти и синтетическим Путем, т. е. получать соединения с заранее заданным строением, и, сравнивая их с веществами природного происхождения, выносить суждение о строении последних. При определении строения полинуклеотидов речь должна идти о синтезе специфических олигонуклеотидов, т. е. таких, в которых имеется совершенно определенная заданная последовательность мононуклеотидных звеньев. Рассмотренный выше метод неспецифической полимеризации мононуклеотидов (стр. 251) для этой цели непригоден, так как необходимо иметь метод, который позволил бы создать цепь постепенно, наращивая мононуклеотидные звенья в нужном порядке. [c.254]

На результаты разделения решающее влияние оказывают состав и форма градиента. Как правило, на ОЕАЕ-замещенной целлюлозе или декстране гомологичные олигонуклеотиды разделяются в соответствии с длиной цепи (рис. 37.14), с учетом того, что способность преобладающего основания увеличивать элюирующий объем возрастает в ряду С, U, А, G (рис. 37.15). В буферных растворах с нейтральным значением pH (5,4—8,0) в присутствии 7 М мочевины даже в простом линейном градиенте олигонуклеотиды разделяются строго в соответствии с зарядом молекулы, т. е. в соответствии с числом фосфатных групп или со степенью полимеризации (рис. 37.16) 98, 38]. Дальнейшее разделение одинаково заряженных фрагментов осуществляется в тех же условиях, но в отсутствие мочевины. Можно также вести элюирование в присутствии мочевины при низких [c.55]

В ряде опытов был изучен фосфоролиз, т. е. обращение реакции полимеризации [158, 166, 168]. Для этого используемый полинуклеотид инкубировали с ферментом в присутствии избытка неорганического фосфата, что приводило к образованию нуклеозиддифосфатов в результате последовательного отщепления моно-нуклеотидных единиц. Оказалось, что легко фосфоролизируются не только полимеры, полученные путем биосинтеза, но и обладающие затравочной активностью олигонуклеотиды. Динуклеотиды же и динуклеозидмонофосфаты, как и следовало ожидать, не поддаются фосфоролизу. РНК вируса табачной мозаики и высокополимерная РНК дрожжей могут легко подвергнуться фосфоролизу, но если дрон<жевую РНК предварительно обрабатывают щелочью, то фосфоролиз протекает медленно. Медленно протекает и фосфоролиз многочисленных тяжей, образованных, например, из поли-А и поли-У. Неполностью (па 20—30%) протекает фосфоролиз транспортной РНК клеточной цитоплазмы, что можно объяснить особенностями вторичного строения s-PHK. По-видимому, фосфоролиз затрагивает преимущественно концевые группы. [c.256]

Олигодезоксирибонуклеотиды. Простейшим подходом к получению гомогенных олигодезоксинуклеотидов является полимеризация (точнее поликонденсация) мононуклеотидов. Так, при полимеризации тимидин-5 -фосфата под действием дициклогексилкарбодиимида были получены олигонуклеотиды общей формулы (р(1Т) со степенью полимеризации до Одной из существенных побоч- [c.86]

Аналогичный подход — полимеризация три- или тетрануклео-тидного блока — был также использован для получения олигонуклеотидов с повторяющейся тринуклеотидной и тетрануклео-тидной 372 последовательностью. Для синтеза соединений такого типа часто применяется и другой подход, основанный на ступенчатом наращивании цепи олигонуклеотида. [c.88]

В полимеризацию, катализируемую ферментами этой группы, могут вступать только производные мононуклеотидов попытки осуществить аналогичную полимеризацию производных ди- и олигонуклеотидов оказались безуспешными. Молекулярный вес образующегося полимера в значительной степени зависит от условий полимеризации часто удается получить как олигонуклеотиды (например, тринуклеозиддифосфаты при реакции, катализируемой по-линуклеотидфосфорилазой), так и полинуклеотиды с молекулярным весом в несколько миллионов. [c.97]

Олигонуклеотид с З -концевой гидроксильной группой может служить затравкой полимеризации, т. е. акцептором, к которому присоединяются полимеризующнеся остатки мононуклеотидов. Последовательность мономеров в растущей полимерной цепи при этом не зависит от последовательности мономеров в добавленном олиго-или полинуклеотиде добавленная затравка входит в состав продукта реакции, составляя его 5 -концевую последовательность. Такая функция олиго- или полинуклеотида наблюдается для реакций, катализируемых терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой и полинуклеотидфосфорилазой. [c.97]

Олигонуклеотид с З -концевой фосфатной группой может резко увеличивать скорость ферментативной полимеризации, не включаясь в состав продукта реакции и не влияя на последовательность мономеров в нем. В этом случае говорят, что олигонуклеотид действует как инициатор . Механизм действия инициаторов не выяснен единственный надежно доказанный случай такого функционирования олигонуклеотида — реакция, катализируемая полинуклеотидфосфорилазой. [c.99]

В некоторых случаях возможна ферментативная полимеризация и в отсутствие добавляемого олиго- или полинуклеотида. Обычные препараты полинуклеотидфосфорилазы катализируют полимеризацию нуклеозиддифосфатов и без затравки или инициатора. Такая способность, однако, теряется при дальнейшей очистке фермента она связана, очевидно, с присутствием олигонуклеотидов в мало-очищенных ферментных препаратах. В некоторых условиях удается осуществить синтез полинуклеотидов без матрицы с ДНК- и РНК-полимеразами эти случаи будут рассмотрены ниже. [c.99]

Некоторые олигонуклеотиды наиболее удобно получать расщеплением соответствующих полимеров. Это относится к гомогенным олигорибонуклеотидам, легко получаемым кратковременным щелочным гидролизом соответствующих гомогенных полирибонуклеотидов, а также к олигорибонуклеотидам типа (Хр) Ур, которые легко получить, расщепляя продукт полимеризации ррХ и ррУ (под действием полинуклеотидфосфорилазы) нуклеазой, специфичной к остатку Ур. (Здесь X и V — остатки нуклеозидов.) Ряд ди-, три- и тетрануклеотидов может быть достаточно легко выделен из продуктов расщепления РНК под действием РНК-аз. [c.103]

Представлены данные гидролиза полиадениловой и полинозино-вой кислот до мононуклеотидов большими количествами рибонуклеазы [118]. Возможность неферментативного катализа в этом случае полностью не исключена . Подобные результаты были отмечены для пуринсодержащих олигонуклеотидов, которые при использовании обычных методов устойчивы к панкреатической рибонуклеазе [119]. В подходящих условиях фермент обнаруживает синтетическую активность. Помимо полимеризации нуклеозид-2, 3 -циклофосфатов, рибонуклеаза может катализировать образование З -алкиловых эфиров при соответствующей обработке уридин-2, З -циклофосфата рибонуклеазой и первичными спиртами. Вторичные и третичные спирты здесь не эффективны, как и в случае химической реакции с алкоголятами натрия [120]. [c.380]

Аналогично при полимеризации тимидин-3 -фосфата (который сначала превращается в Р1,Р -дитимидин-3 -пирофосфат) при обработке избытком дициклогексилкарбодиимида в безводном пиридине образуется сложная смесь продуктов [12]. Наряду с гомологическим рядом циклических олигонуклеотидов, образующихся из линейных соединений фосфорилированием 5 -гидроксильной группы, находящейся на одном конце, 3 -фосфатным остатком, находящимся на другом, были получены с еще более низкими выходами линейные тимидинолигонуклеотиды (вплоть до пентапуклеотида), несущие З -фосфатные концевые группы. [c.480]

Количество циклических олигонуклеотидов можно несколько уменьшить полимеризацией тимидин-5 -фосфата (3 части) в присутствии 3 -0-ацетилтимидин-5 -фосфата (1 часть) в качестве агента, прикрывающего цепь. В результате продолжительной обработки (в течение 6 дней) смеси дициклогексилкарбодиимидом в пиридине при комнатной температуре и последующего щелочного гидролиза образуется сложная смесь соединений, основным в которой был циклический дииуклеотид. Линейные полимеры, содержащие 2—11 нуклеотидов (с общим выходом около 50%), были частично очищены и охарактеризованы (без выделения в твердом состоянии) посредством многократного хроматографирования на колонке [13]. При этом были обнаружены также многочисленные неидентифицированные побочные соединения. Заключение о чистоте и гомогенности отдельных пиков, полученных в результате хрома- [c.480]

Рассмотрение стереохимических данных говорит о том, что образование циклодинуклеотидов через промежуточный триэтерифицированный 2, 3 -циклический фосфат маловероятно, а вероятность образования циклических три- и тетрануклеотидов еще меньше. Кроме того, при полимеризации использовали очень концентрированные растворы, что еще больше уменьшало возможность образования циклических олигонуклеотидов. Такие соединения не были [c.492]

ОКОЛО трех мононуклеотидов) с последующей сополимеризацией смеси олигонуклеотидов приводит к образованию полинуклеотидов с пуриновыми и пиримидиновыми участками 131]. Кроме двух первых типов сополимеров, был получен и третий тип при полимеризации динуклеотида — аденилил-3 5 -уридин-3 -фосфата (после циклизации концевого моноэтерифицированного фосфата в 2 3 -циклический фосфат под действием хлоругольного эфира). Этот тип представлял собой олигонуклеотиды с определенным расположением чередующихся адениловой и уридиловой кислот [32]. [c.497]

Аналогично полиадениловая кислота расщепляется диэстеразой селезенки (или рибонуклеазой Т2) до смеси аденозин-З -фосфата и устойчивых к ферменту олигонуклеотидов, содержащих исключительно 2 —5 -межнуклеотидные связи. Синтетические гомополимеры инициируют ферментативную полимеризацию нуклеозид-5 -пирофосфатов под действием полинуклеотидфосфорилазы. Не [c.503]

Однако при использовании бензоилхлорнда реакция протекает по третьему механизму с разрывом связи е , так как несмотря на способность карбонильной группы к реакциям присоединения в диоксановом растворе происходит значительная полимеризация. Эта реакция включает, вероятно, прямую мeж юлeкyляpнyю нуклеофильную атаку 5 -гидроксильной группы атома фосфора, в результате которой образуется промежуточный олиго(нуклеотид-бензо-илангидрид), гидролизующийся затем до олигонуклеотида. Тот же реагент в пиридине бензоилирует уридин-2, 3 -циклофосфат (наряду с наличием незначительной полимеризации), т. е. реакция протекает по механизму б . В результате обработки аденозин-2, З -циклофосфата бензоилхлоридом в обоих растворителях получается главным образом соединение олигонуклеотидной природы. Пространственные аспекты конформации ангидрида циклофосфата и бензойной кислоты могут играть очень важную роль с точки зрения удобства атаки атома фосфора. [c.515]

Наряду с полирибонуклеотидами важно было изучить также модельные полидезоксирибонуклеотиды. Для них долгое время не удавался ферментативный синтез. Поэтому здесь первые успехи принесла органическая химия. Корана 1удалось, применяя создан-ный им метод конденсации мононуклеотидов, получить целый ряд олигонуклеотидов до степени полимеризации, равной 15. Для этого нуклеотиды приводились в соприкосновение со специальным реагентом, дициклогексилкарбодиимидом, ведущим конденсацию с отнятием воды [c.224]

Далее, в сшитых структурах олигонуклеотиды присоединяются к поверхности полимера, вследствие чего дальнейшая полимеризация мононуклеотидов осуществляется в условиях гетерогенного катализа и имеет стереоконтролируемый характер. Обычно роль зародышей в процессе полимеризации играют образующиеся более крупные олигомеры (со степенью полимеризации выше 4), на которых происходит дальнейшая полимеризация. [c.86]

Полимеризация мононуклеотидов. Полимеризация мононуклеотидов приводит к гомополинуклеотидам, которые служат объектом для различных химических, ферментативных и физиологических исследований. Впервые метод был разработан на тимидин-5 -фосфате, который является более простым мономером в связи с отсутствием в гетероциклическом основании функциональных групп, подлежащих защите Полимеризация проводилась в присутствии дициклогексилкарбодиимида или других активирующих агентов в среде пиридина. Обычно максимальная длина цепи получаемых олигонуклеотидов достигала 10 мономерных единиц. [c.404]

Первые успешные эксперименты по полимеризации монорибонуклеотидов с образованием олигонуклеотидов исключительно с Сд-—Са -связями были проведены Корана с сотр. Так, при полимеризации 2 -0-ацетил-уридин-3 -фосфата в присутствии дициклогексилкарбодиимида в пиридине с последующей щелочной обработкой получена смесь, из которой были выделены линейные ди- и тринуклеотиды и циклические олигонуклеотиды [c.414]

Олигонуклеотиды с более длинной цепью образуются при полимеризации смеси 2 -0-ацетилрибонуклеозид-3 -фосфатов и 2, 5 -ди-0-ацетил-рибонуклеозид-З -фосфатов. В частности, полимеризацией смеси 2 -0-ацетилуридин-З -фосфата и пиридиниевой соли 2, 5 -ди-0-ацетил-уридин-З -фосфата в присутствии дициклогексилкарбодиимида с последующей обработкой уксусным ангидридом и аммиаком были получены гомологичные олигоуридилилнуклеотиды, содержащие до десяти мононуклеотидных единиц [c.415]

Аналогично полимеризацией смеси К-бензоил-2 -0-ацетиладенозин-3 -фосфата и пиридиниевой соли К-ацетил-2, 5 -ди-0-ацетиладенозин-3 -фосфата получают олигонуклеотиды аденина с длиной цепи до пяти мононуклеотидных единиц [c.415]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология