Фермент удельная

Ранее нами было обнаружено, что при пропускании раствора гиалуронидазы через колонку с хитином происходит сорбция балластных веществ и, возможно, ингибиторов фермента, что приводит к увеличению удельной активности фермента. Использование обнаруженного нами факта при разработке технологии очистки гиалуронидазы требует дальнейшего изучения этого процесса и, в частности, определения емкости сорбента. Для этого на колонки с одинаковым объемом сорбента наносили различные количества фермента. Результаты экспериментов сведены в таблице. [c.95]

Из данных таблицы следует, что в процессе очистки удельная активность гиалуронидазы увеличивается в 8 раз, кроме этого, и общая активность препарата возрастает в 2 раза за счет, вероятно, удаления ингибиторов фермента. Наименьшая кратность очистки наблюдалась при пропускании раствора фермента через сорбент без остановки. Оптимальное время связывание препарата с сорбентом — 20 минут. [c.97]

Содержание фермента в препарате выражают через удельную активность — количество фермента на 1 мг белка. [c.187]

Значит, нужно сделать еще что-то. Тут два пути. Можно выделить моносахарид (или его производное) в индивидуальном состоянии и определить его удельное вращение. А можно воспользоваться ферментом, катализирующим ту или иную реакцию этого моносахарида — уж ферменты-то отличают правое от левого Но ферменты — реагенты тонкие и капризные. Надежный анализ с помощью ферментативной реакции требует проверки с применением образцов заведомых моносахаридов, вводимых в ту же реакцию с тем же самым препаратом фермента. И вот тогда только у исследователя появляется действительная уверенность в том, что вещество — моносахарид — идентифицировано. [c.59]

Перед тем как приступить к выделению и очистке того или иного фермента, необходимо выбрать удовлетворительный тест для его идентификации и количественного определения. Прямые методы существуют лишь для очень ограниченного круга ферментов, поэтому используют способность ферментов катализировать специфическую реакцию. Чтобы иметь возможность контролировать степень очистки фермента, его активность относят на 1 мг общего белка (так называемая удельная активность ). [c.198]

Так как в процессе выделения фермента необходимо знать лишь относительную активность на отдельных стадиях очистки, то выражать ее можно в условных единицах (например, в единицах оптической плотности). Их выбор определяется методом измерения активности. После получения гомогенного или высокоочищенного препарата фермента его активность и удельная активность должны быть определены с использованием наиболее точных методов их измерения и выражены в международных единицах. Результаты очистки фермента суммируют в таблице [c.198]

Работу по выделению фермента начинают с разрушения клеточной оболочки тканей, в результате чего фермент переходит в экстрагирующий раствор. Мышечную ткань можно разрушить с помощью мясорубки, а также гомогенизатора. Клеточную оболочку в ткани печени удобно разрушать обработкой ацетоном. Для этого ее помещают в гомогенизатор, заливают несколькими объемами ацетона, предварительно охлажденного до —20° С, и гомогенизируют на холоде 1—2 мин. Полученный гомогенат быстро фильтруют на воронке с отсасыванием. Осадок еще раз аналогично обрабатывают ацетоном, затем измельчают вручную (в ступке) при комнатной температуре и помещают в вакуум-эксикатор. Ацетоновый порошок может храниться в холодильнике несколько месяцев и использоваться по мере надобности. Обработка ацетоном не только разрушает клеточную оболочку, но также обезвоживает тка нь и освобождает ее в значительной степени от липидов. Одним из наиболее часто применяемых способов разрушения клеточной оболочки дрожжей является автолиз. Дрожжи предварительно можно высушить, что позволяет хранить их, как и ацетоновые порошки животных тканей, длительное время в холодильнике (в герметической упаковке). От условий высушивания дрожжей часто зависят выход фермента и его удельная активность. [c.198]

При кристаллизации в ряде случаев происходит увеличение удельной активности фермента или (и) освобождение от примесей сопутствующих ферментов. Поэтому данную стадию можно рассматривать как один из способов очистки энзимов. [c.205]

Для проверки однородности ферментного препарата недостаточно одного метода. Если примесь является ферментом с высокой удельной активностью, это может вызвать нежелательные осложнения при использовании ферментного препарата, например в аналитических целях. В таком случае ферментативный контроль на наличие побочных активностей совершенно необходим. [c.205]

Если фермент кристаллизуется (или осаждается) из раствора сульфата аммония, его хранят в этом растворе в виде суспензии на холоде его каталитическая активность, как правило, остается практически неизменной достаточно долго. Перед работой часть суспензии центрифугируют, осадок растворяют в буфере и используют для работы. Если фермент имеет высокую удельную активность, можно исполь- [c.205]

Концентрацию киназы фосфорилазы следует подобрать так, чтобы не более 20% добавленной фосфорилазы Ь превращалось в фосфорилазу й за 5 мин. Одна единица активности — это количество фермента, катализирующего превращение 1 мкмоль фосфорилазы Ь в фосфорилазу а в 1 мин при 30° С, pH 8,2. Для расчета учитывают молекулярную массу субъединицы фосфорилазы, равную 97 400 Да удельную активность фосфорилазы а в отсутствие АМФ принимают за 70% от активности фосфорилазы Ь, измеренной в присутствии АМФ. [c.224]

Удельную активность фермента Рассчитывали, используя следующие формулы [c.382]

Поляриметрический метод определения ОСп основан на зависимости удельного вращения плоскости поляризации раствора субстрата от количества единиц активности фермента, взятых для проведения реакции. [c.300]

Конфигурацию гликозидных связей дисахаридов можно установить расчетом удельного вращения по правилу Кляйна [191]. Для определения конфигурации гликозидных связей в средних и высших олигосахаридах проводят их ступенчатое расщепление, а затем определяют конфигурацию гликозидных связей в отдельных звеньях, содержащих одну-две гликозидные связи. На основании полученных результатов вычисляют удельное вращение всего олигосахарида [99]. Определение конфигурации гликозидных связей может быть осуществлено также исследованием продуктов ферментативного гидролиза. Отношение данной гликозидной связи к ферменту с известной субстратной специфичностью позволяет сделать заключение о конфигурации этой связи. Сложность определения конфигурации связей этим методом состоит в трудности получения [c.126]

Э. Гриффин, 1916), но и сейчас не потеряла своего значения и стала наиболее широко распространенным способом получения иммобилизованных ферментов в промышленности. В литературе описано получение адсорбционным способом более 70 иммобилизованных ферментов с использованием главным образом таких носителей, как кремнезем, активированный уголь, графитов сажа, различные глины, пористое стекло, полисахариды, синтетические полимеры, оксиды алюминия, титана и других металлов. Последние применяются наиболее часто. Эффективность адсорбции молекулы белка на носителе определяется удельной поверхностью (плотностью центров сорбции) и пористостью носителя. Процесс адсорбции ферментов на нерастворимых носителях отличается крайней простотой и достигается при контакте водного раствора фермента с носителем (статистическим способом, при перемешивании, динамическим способом с использованием колонок). С этой целью раствор фермента смешивают со свежим осадком, например, гидроксида титана, и высушивают в мягких условиях. Активность фермента при таком варианте иммобилизации сохраняется практически на 100%, а удельная концентрация белка достигает 64 мг на 1 г носителя. [c.88]

Число оборотов можно измерить только для чистых ферментов. Отчасти по этой причине активность фермента чаще выражается в единицах активности на i мг белка (удельная активность). Одна международная единица представляет такое количество фермента, которое-катализирует образование I мкмоль продукта в 1 мин при стандартных (обычно оптимальных) условиях. В настоящее время Международный биохимический союз [7] рекомендует новую единицу — катал (кат), представляющую собой количество фермента, которое катализирует превращение 1 моль субстрата в продукт за 1 с. [c.8]

Удельная активность - активность фермента, отнесенная к 1 мг фермента. Пример определения активности фермента дана молекулярная масса фермента, равная 120 ООО г/моль. Концентрация фермента равна 1,0 мМ. Собственно значения активности определяют экспериментально и в данном примере активность равна 2800 мкмоль/мин. Удельная активность равна 2800 12 10" = 2,3 Ю ед/мг. [c.32]

Удельная активность препарата — выражается в единицах ферментативной активности фермента (МЕ или ЕД) на 1 мг препарата и на 1 мг белка (вторая величина характеризует чистоту препарата). [c.29]

При изготовлении ферментного электрода важна высокая степень очистки фермента удельная активность не ниже 10 ед. активности/мг), что позволяет уменьшить его оличество. В этом случае время отклика биосенсора минимально и приближается к ремени отклика базового электрода. Как видно из табл. 9.1, обычно используют не юнее 10 И (1 мг) фермента. [c.125]

Нами было обнаружено, что гиалуронидаза не сорбируется на хитине, в то же время хитин сорбирует балластные вещества из препарата, ЧТО приводит к увеличению удельной активности фермента. Перед использованием хитин отмывали 0.1 М уксусной кислотой (pH 2.9), затем физиологическим раствором (ФР). Активность гиалу- [c.96]

ПодготоЕ ленная путем модифицирования реакцией с -амино-пропилтриэтоксисиланом поверхность достаточно крупнопористого силохрома или силикагеля может быть использована для иммобилизации белков и, в частности, ферментов, нужных для проведения -биокаталитических реакций. Для этого, как указывалось в лек-дии 5, надо провести дальнейшее модифицирование поверхности адсорбента-носителя прививкой агента (глутарового альдегида), способного вступить в реакцию с аминогруппами как модификатора, так и балка. Адсорбент-носитель с привитыми теперь уже альдегидными концевыми группами вводится в реакцию с различными белками. Ра ссмотрим иммобилизацию уреазы — важного фермента, находящего также применение в аналитическом определении мочевины и в аппарате искусственная почка . На рис. 18.9 представлена зависимость активности иммобилизованной уреазы от количества иммобилизованного белка. Адсорбентом-носителем является макропористый силохром со средним диаметром пор 180 нм. Этот размер пор значительно превышает размер глобулы уреазы. Вместе с тем удельная поверхность этого силохрома еще достаточно высока (5 = 41 м /г), чтобы обеспечить иммобилизацию значительного количества уреазы. Из рис. 18.9 видно, что при этом удается иммобилизовать до 120 мг белка на 1 г сухого адсорбента-носителя (это составляет около 3 мг/м ). Активность уреазы снижается не более, чем наполовину, даже при большом количестве уреазы в силикагеле, зато иммобилизованный так фермент можно многократно применять в проточных системах, и он не теряет активности при хранении по крайней мере в течение полугода. [c.341]

Биоспецифическая хроматография применяется для очистки ферментов, так как она позволяв извлекать ферменты из сложных смесей в одну стадию с высокой степенью очистки и с большим выходом. В последнее время в качестве адсорбентов-носителей в биоспецифической хроматографии находят применение как макропористые неорганические адсорбенты (силикагели, силохромы, пористые стекла), так и макропористые органические сшитые сополимеры, например макропористые сополимеры глицидилме-такрилата с этилендиметакрилатом типа сферой (см. лекцию 6) со сферическими зернами разных размеров. Эти адсорбенты-носители обладают разной удельной поверхностью и крупными порами разных размеров. На рис. 18.10 представлен пример биоспецифической хроматографии химотрипсина на сфероне с иммобилизованным химической прививкой белком — ингибитором трипсина (являющегося также ингибитором химотрипсина). Из колонны, заполненной обычным макропористым сфероном без иммобилизованного ингибитора, химотрипсин выходит вместе с остальными белками, а из колонны, заполненной сфероном с привитым ингибитором, сопутствующие белки выходят приблизительно за то же время, а химотрипсин прочно удерживается. Это позволяет отделить [c.342]

Из уравнений ( .26) и ( .27) следует, что для реакций с тепловым эффектом, близким к нулю, или для таких систем, где степень возврата энергии реакции близка к нулю, удельная ферментная активность сравнима с активностью самых обычных неорганических катализа торов, в том числе и адсорбционных. Это следует из того, что прямая I (рис. 19) вблизи Рреакц=0 пересека-ется с полосой III для атомных адсорбционных катализаторов. Это количественное сближение сложного ферментного катализатора с элементарным неорганическим катализатором при изменении энергетических параметров реакции вплотную подводит к вопросу является ли описанная энергетическая, т. е. невалентная, активация ферментов их исключительной особенностью или она в какой-то мере присуща простым каталитическим системам — атомным ансамблям и неорганическим кристаллическим катализа торам. [c.118]

Феноксиметилпенициллин — белый кристаллический порошок без запаха, кисловато-горького вкуса, негигроскопичен, т. пл. 118—120°, [а о = + 180—200° (с = 1,95 -ный спирт), мало растворим в воде, растворяется в метиловом и этиловом спиртах, ацетоне, хлоро< рме, бутилацетате, глицерине. Устойчив в слабокислой среде, но разлагается при кипячении со щелочами и в присутствии фермента пенициллиназы. К солнечному свету устойчив. При взаимодействин с растворами хлоргидрата гидроксиламина, едкого натра, а затем уксусной кислоты, а также нитрата меди выделяется зеленый осадок. Для определения удельного поглощения по ГФ1Х 0,09— 0,1 гпрепарата (точную навеску) растворяют в 4 5"о-ного раствора гидрокарбоната натрия, разбавляют водой до 500 мл и определяют оптическую плотность (D) ири длине волны 268 ммк и при 274 ммк в кювете с толщиной слоя 1 см. Контрольным раствором служат 4 л1/г5 о-ного раствора гидрокарбоната натрня, разведенные водой до 500 мл. Прп длине волны 268 чмк Е = 34,8. Отношение D при длине волны 268 ммк к D при длине волны 274 ммк должно быть не менее 1,21 и не более 1,24. [c.735]

Удельная активность выражается числом единиц активности фермента, приходящихся на 1 мг белка. Молекулярная активность характеризуется числом молекул субстрата, которое подвергается превращению одной молекулой фермента за 1 мин. Когда известно количество активных центров в молекуле фермента, вводится понятие активносги каталитического центра. Она характеризуется числом молекул субстрата, которое подвергается превращению за 1 мин при расчете на 1 каталитический центр. [c.206]

Эта зависимость выражается графически, как показано на рис. 31. Экспериментальные данные обрабатывают, используя указанные графические способы. Определяют величины Кт и V. В случае двух- и трехсубстратных реакций определяют Кт для разных субстратов. По найденным величинам V рассчитывают удельную активность препарата фермента. [c.210]

Повторная гель-хроматография. Раствор фосфофруктокиназы наносят на колонку (2,2x60 см), заполненную биогелем А—1,5т, уравновешенную буфером А. Фермент элюируют тем же буфером. Фракции с наибольшей удельной активностью объединяют. [c.245]

Суспензию сефарозы с иммобилизованной дегидрогеназой промывают 10-кратным объемом раствора мочевины, смешивают с 4-кратным объемом раствора мочевины той же концентрации и инкубируют суспензию при перемешивании. За ходом инактивации следят, измеряя активность фермента на носителе. Через каждые 10 мин из инкуба-ционной смеси отбирают аликвоты препарата дегидрогеназы и без отмывания геля от мочевины вносят их в стандартную систему для определения активности. Реакцию начинают добавлением субстрата через 10 с после внесения суспензии сефарозы. Исследуют влияние концентрации мочевины на процесс инактивации фермента. Оптимальной концентрацией мочевины является такая, которая позволяет провести денатурацию 3 из 4 субъединиц дегидрогеназы и перевести эти субъединицы в раствор. Подбирая концентрацию мочевины, следует получить такую зависимость инактивации фермента от времени, на которой будет выраженное плато на уровне 25% от исходной активности. При определении белка и активности на разных стадиях денатурации можно показать, что в начале плато в связанном с матрицей состояний находится димер дегидрогеназы, сохраняющий 50% от исходной удельной активности. При сохранении в процессе инкубации активности такого димера происходит постепенное отщепление неактивной субъ- [c.302]

Получают препарат II изозима гексокиназы из растворимой клеточной фракции скелетных мышц крысы. После определения белка микробиуретовым методом оценивают удельную активность фермента, а также степень очистки. При этом учитывают, что на долю II изозима гексокиназы приходится 60% от общего содержания фермента в растворимой клеточной фракции скелетных мышц. [c.376]

В подобной системе существуют два разных типа иммобилизованных тетрамеров в первом из них связь с носителем образуют субъединицы одного димера, во втором — по одной субъединице из разных димеров. В диссоциирующих условиях тетрамер I типа переходит в два димера иммобилизованный и растворимый (который в дальнейшем удаляется при промывании), тетрамер II типа остается неизменным. Таким образом, при иммобилизации ГАФД через две субъединицы возможно получить систему, содержащую одновременно димеры и тетрамеры. Корреляция удельной активности фермента с рассчитанным количеством образовавшихся димеров и сохранившихся тетрамеров позволяет судить об активности димерной формы. [c.384]

М, pH 8,9. Реакционная среда содержит 5 мМ ЭДТА, 5 мМ арсенат Na, 3 мМ НАД, 1,5 мМ фосфоглицериновый альдегид и 0,1—0,2 мл суспензии иммобилизованного фермента. Реакцию начинают добавлением субстрата. Проводят сравнение удельной активности, значений Кт и Vmax для иммобилизованных форм фермента И рвстворимого фермента. [c.385]

Получение иммобилизованного мономера ЛДГ. К одному объему геля агарозы, несущей иммобилизованный тетрамер ЛДГ, добавляют два объема 1,5 М мочевины. Инкубацию проводят в течение 3 ч при комнатной температуре и постоянном осторожном перемешивании, после чего агарозу промывают 10 объемами 1,5 М мочевины, а затем 0,1 М Na-фосфатным буфером (pH 7,4) до полного исчезновения белка в пробе (контролируют по поглощению раствора при 280 нм). Отсутствие в пробе мочевины контролируют с помощью реактива Несслера. В полученной суспензии определяют содержание белка, как указано выше. Измеряют удельную активность иммобилизованного мономера, определяют величины удельной активности, Кт и Утзх для субстратов реакции. Сравнивают полученные величины с соответствующими значениями, полученными для иммобилизованного тетрамера ЛДГ и нативного фермента. [c.388]

Используют следующие конечные концентрации реактивов фруктозо-1,6-дифосфат — 2 мМ, арсенат Ыа — 5 мМ, НАД — 2 мМ иммобилизованная альдолаза — 100 мкл суспензии (удобно разводить осевшую агарозу буфером в соотношении 1 1 и после этого отбирать иммобилизованную альдолазу в пробу на активность). Количество ГАФД, необходимое для полного сопряжения, подбирают экспериментально, внося в пробу нарастающие объемы растворимого препарата. Если двукратное увеличение количества фермента в пробе не приводит к росту активности альдолазы, в работе используют его предшествующий объем. Оптическую плотность измеряют с интервалом 15 с непосредственно после заполнения кюветы. Определяют величины удельной активности, Кт, 1 тах ДЛЯ иммобилизовзнного фермента и сравнивают их с соответствующими значениями этих параметров растворимой альдолазы. [c.390]

Кюветы спектрофотометра заполняют средой, содержащей фосфатный буфер (pH 7,4), 1 мМ K N, 1 мкМ ротенон, 1,5 мМ НАДН, 10—20 мкМ цитохром с. Устанавливают длину волны 550 нм (точно ). Для этого кювету помещают в кюветное отделение, устанавливают длину волны по шкале прибора на отметке 550 нм и добавляют к среде нейтрализованный (pH 7,4) раствор аскорбиновой кислоты (конечная концентрация — 5—10 мМ). Цитохром с немедленно восстанавливается, и раствор меняет цвет от красновато-оранжевого до ярко-розового. Устанавливают шкалу длин волн на 550 нм по максимальному поглощению раствора восстановленного цитохрома с, при дальнейшей работе установку длин волн не меняют. Реакцию начинают внесением препаратов в кювету, содержащую окисленный цитохром с, и регистрируют увеличение поглощения при 550 нм. Рассчитывают удельную активность препаратов в микроэлектронэквивалентах за 1 мин в расчете на 1 мг белка. Коэффициент миллимолярной экстинкции для цитохрома с Активность фермента, характерного для внешней мембраны, определяют по разнице скоростей реакций в присутствии и в отсутствие ротенона. [c.412]

Международный биохимический союз рекомендует характеризовать каталитическую активность фермента единицей катал (символ - кат), соответствующей превращению одного моля субстрата в одну секунду. Удельная каталитическая активность фермента выражается в кат/кг или моль субстра-та/(с кг фермента). Молярная каталитическая активность выражается в кат/моль фермента. [c.550]

Когда (-Ь)-сахарозу подвергают гидролизу разбавленной водной кислотой или действием фермента инвертазы (из дрожжей), то образуются равные количества о-(+)-глюкозы и о-(—)-фруктозы. Этот гидролиз сопровождается изменением знака вращения с положительного на отрицательный поэтому этот процесс часто называют инверсией (+)-сахарозы, а получающуюся смесь левовращающей о-(- -)-глюкозы и о-(—)-фруктозы — инвертированным сахаром. (Мед в основном состоит из инвертированного сахара инвертаза в этом случае поставляется пчелами.) В то время как (+)-сахароза имеет удельное вращение +66,5° (+1,160 рад), а о-(+)-глюкоза +52,7° (+0,920 рад), о-(—)-фруктоза имеет сильное отрицательное удельное вращение —92,4° (—1,612 рад), в результате чего и наблюдается отрицательное вращение для смеси. [Поскольку о-(+)-глюкоза и о-(—у-фруктоза обнаруживают противоположное вращение и являются компонентами сахарозы, то их обычно называют декстрозой и ле-вулозой.] [c.971]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология