Ацетилхолина определение методом

Сразу после затравки производилось определение содержания в крови ацетилхолина по методу Л. Я- Лившиц и [c.243]

Самым старым методом, родившимся в физиологических лабораториях, является метод биологического тестирования убыли концентрации ацетилхолина в присутствии холинэстераз. В качестве биологических тест-объектов наиболее широкое распространение получили прямая мышца живота и сердце лягушки [32], изменяющие свои сократительные свойства под влиянием ацетилхолина. Этот метод позволяет работать с небольшими концентрациями ацетилхолина и холинэстеразы и является очень чувствительным, однако точность определения концентрации ацетилхолина далеко недостаточна для измерения кинетических констант. [c.143]

Метод применяется для определения солей тетраэтиламмония, холина, ацетилхолина. [c.227]

В качестве примера, иллюстрирующего применение этого метода, на рис. 29 приведены результаты исследования кинетики торможения активности холинэстеразы сыворотки крови лошади фос-форорганическим ингибитором — армином [99]. Из данных рисунка видно, что только при определенной концентрации ингибитора зависимость llv t от t является линейной. Вычисленная на основании найденной концентрации фермента и скорости гидролиза ацетилхолина величина молекулярной активности холинэстеразы оказалась равной 7-10 мин. , что удовлетворительно совпадает с результатами, полученными при использовании других методов. [c.125]

Была исследована кинетика взаимодействия этих соединений с холинэстеразой сыворотки крови лошади (препарат 40-кратной очистки) указанным выше методом при pH 7,0, температуре 40°, в отсутствие ацетилхолина и при концентрациях ФОС и активных центров фермента, близких к эквимолекулярным. Результаты определения констант скорости реакции ФОС с ХЭ изображены графически на рисунке. [c.433]

Баум [618] описал новый электрохимический метод определения активности ацетилхолинэстеразы с тем же ацетилхолин-селективным электродом с жидкой мембраной. Определение активности ацетилхолинэстеразы проводилось для исходных концентраций хлорида ацетилхолина от 2-10 до 3-10 моль/л в 10 — 50 мл буферного физиологического раствора при активности холинэстеразы в пределах от 0,2 до 8 ед. Уже в течение минуты после введения фермента были получены данные о скорости изменения концентрации субстрата. Скорость гидролиза можно контролировать вплоть до 40%-ной степени гидролиза, прежде чем проявляется мешающее действие холина. Сравнение результатов определения активности ацетилхолинэстеразы, полученных электрохимическим методом и спектрофотометрическим ме- [c.203]

Электрометрические методы измерение АрН) - В этих методах изменение pH, вызываемое выделяющейся кислотой, измеряется по истечении определенного времени рН-метром. При этом используется специально разработанный Михелем буфер с исходным pH 8,0, буферные свойства которого обеспечивают линейную зависимость между активностью фермента и изменением pH. Другим преимуществом метода является возможность параллельно проводить измерения в нескольких пробах По полученным значениям АрН можно определить число микромолей разложившегося ацетилхолина. Для этого прибавляют стандартный раствор кислоты к смеси буфер — фермент и измеряют уменьшение значения pH при определенных количествах кислоты. Используя эти величины, строят калибровочную кривую, по которой устанавливают количество разложившегося субстрата. [c.168]

В плоском слое нанесенного на. стеклянную пластинку агарового геля, содержащего фермент и индикатор бромтимоловый синий, проделывают отверстия, в которые заливают испытуемый раствор. Для прохождения диффузии пластинку оставляют на определенное время (по возможности, на ночь), затем заливают слой агара раствором ацетилхолина, в результате чего на желтом фоне появляются синие круги, диаметр которых пропорционален концентрации ингибитора. Это дает возможность построить также и калибровочную кривую. Метод пригоден для определения паратиона в концентрации 0,03 мкг/мл. [c.176]

Хорошо известно, что ацетилхолин способен вызывать сокращение мышц всех типов. Этот феномен используется для биологического определения ацетилхолина, причем применяются столь различные мышцы, как прямая мышца живота лягушки, сердце моллюска и кишка кролика. В этих методах добавляют антихолинэстеразное вещество (обычно эзерин), чтобы исключить разрушение ацетилхолина тканевой холинэстеразой. Применение антихолинэстеразного яда называют сенсибилизацией , поскольку оно значительно повышает ответную реакцию препарата на ацетилхолин. [c.181]

Ацетилхолин не токсичен [40, 1191 и не влияет на синаптическую передачу у насекомых [100], в то время как для млекопитающих он ядовит и нарушает функцию синапсов. Это дало возможность предположить, что фармакологически активное вещество, наличие которого в организме насекомых показано во многих ранних работах [44], не является ацетилхолином. Однако в исследованиях, выполненных на пчелах [9], комнатных мухах [22] и мясных мухах [51 ], с помощью комбинации фармакологических и хроматографических методов наличие ацетилхолина бесспорно показано. В отношении мясных мух [106 [ и тараканов [21 ] имеются также данные, что все биологически активное вещество, определяемое с помощью метода прямой мышцы живота лягушки, является ацетилхолином. Во всех описанных ниже работах этот метод был единственным, которым пользовались для определения ацетилхолина. Неспособность ацетилхолина вызывать отравление насекомых или нарушать у них нервную передачу может быть полностью объяснена наличием ионного барьера, защищающего нервную систему насекомых (стр. 193). [c.288]

Рис. 9.7. Определение ацетилхолина методом дифференциальной импульсной полярографии с висящим капельным электролитным электродом [15]. Концентрация ацетилхолина (мкг/мл) О — 0 1 — 0,5 2—1 < —2 4—5.

I. Определение кислоты, образующейся при разложении карбоксилхолина. Манометрические методы Эти методы основаны на измерении объема СОг, выделяющейся при действии на бикарбонатный буфер уксусной кислоты, которая образуется в результате гидролиза ацетилхолина. Определение проводят в аппарате Варбурга (рис. 8). Предложены новые колбы Варбурга, особенно удобные для измерения угнетения ХЭ27. [c.167]

Ж. Сннсгеймер с соавторами для определения хлорида ацетилхолина применили метод амперометрического титрования растворам тетрафеиилбората натрия ири pH = 4,6. Метод отличается высокой чувствительностью и достаточной степенью точности. [c.123]

Биораспознающий компонент биосенсора—это белок, макромолекула или комплекс со специфической поверхностью или внутренними распознающими центрами, необходимый для распознавания определяемого вещества. Компонент обусловливает селективность по отношению к определяемому веществу и передает сигнал на преобразователь. Тип реакции, катализируемой фермен> том, определяет выбор преобразователя. Определяемое вещество, а значит, и доступньк методы преобразования обусловливают природу биораспознающего компонента. Рассмотрим два примера, в которых фермент используют для создания сенсора на субстрат этого фермента. На схеме 7.8-1 ферментативная реакция включает перенос злектрона таким образом, для определения холестерина можно использовать в качестве преобразователя амперометрический электрохимический сенсор. Схема 7.8-2 включает изменение [Н+1 следовательно, контроль превращения ацетилхолина возможен с помощью рН-электрода или рН-чувствительного красителя в оптическом приборе. Другие ферменты можно использовать в случае реакций гидролиза, этерификации, расщепления и т. д. определяемое вещество обычно является субстратом фермента. (Как можно провести анализ, если вы не смогли найти подходящую ферментативную реакцию с участием определяемого вещества, ио знаете, что оно является иигибитором ферментативной реакции ) [c.519]

Большое различие е действии тиолов на центральную нервную систему обусловливает интерес к исследованию их влияния на основные ферментные системы мозговой ткани. В литературе отсутствуют данные о действии меркаптанов на активность холинэстеразы. Определение активности хо-линэстеразы производилось нами потенциометрическим методом, основанном на появлении уксусной кислоты при гидролизе ацетилхолина [121. Исследуемые меркаптаны вводились крысам внутрибрюшинно в дозах, близких к ДЛ5,,. На васоте отравления определялась активность данного фермента в головном мозгу, плазме крови и эритроцитах (табл. 6). [c.556]

Для количественного определения концентрации ацетилхолина и ее изменения в ходе энзиматической реакции к анализируемому раствору (если необходимо, после осаждения белков трихлоруксусной кислотой) прибавляют щелочной раствор гидроксиламина и затем сильно подкисленный соляной кислотой раствор РеС1з. Окрашенные растворы колориметрируют при 540 ммк. Чувствительность метода — 5 мкг ацетилхолина. Ошибка определения обычно +1%. Окрашенные растворы подчиняются закону Ламберта — Бэра при концентрациях ацетилхолина 5—50 мкг/мл. [c.144]

Большинство методов определения активности холинэстераз основано на измерении скорости образования уксусной кислоты из ацетилхолина (или других карбоновых кислот из ацилхолинов) с использованием рН-метрии. По-видимому, первым методом, [c.144]

Для оценки силы антихолинэстеразного действия препаратов мы пользовались величиной /50, которую получали при определении активности проб фермента, предварительно экспонированных в течение 10—12 мин. при 38—39° с разными концентрациями ингибитора. Определение активности холинэстераз производилось по принципу, использованному Платт-пером и Галером (1928) с тем отличием, что количество ацетилхолина, оставшееся неразрушенным после контакта с энзимом, определялось не па биологическом объекте, а фотоколориметрически, по методу Хестрина (1949). В качестве источника истинной холинэстеразы использовалась кровь коровы, в качестве источника ложной холинэстеразы — сыворотка крови лошади. [c.463]

Значения констант можно сравнивать только в том случае, если они устанавливались в точно соблюдаемых условиях, т. е. при определенной температуре, pH, продолжительности инкубации и реакции, концентрации фермента и субстрата. Так, например, в электрометрическом методе фермент инкубируют 30 мин при 25 °С, исходное значение pH 8,0 реакцию с ацетилхолином проводят в течение пОмин при концентрации последнего 7,3-10" лголь/л. Для определения значения I50 измеряют активность ингибитора при различных его концентрациях. По полученным результатам строят график, в котором процент угнетения (отношение ингибированного фермента к неингибированно-му) сопоставляют с отрицательным логарифмом концентрации ингибитора. Пример такой обработки опытных данных представлен на рис. 7. Истинное значение piso искажается побочными реакциями, протекающими в зависимо- сти от свойств ингибитора и фермента, а также условий опыта. Такими побочными реакциями, конкурирующими с ингибированием фермента, являются спонтанный гидролиз субстрата, гидролиз ингибитора, вызываемый содержащимися в ферменте фосфорилфосфа-тазами, адсорбция на стенках стеклянного сосуда при работе с очень разбавленными растворами, реакция с другими активными группами присутствующих белков. Кроме того, в случае слабого ингибитора одновременно протекают и угнетение, и реактивация фермента. Некоторые авторы считают, что для бимолекулярной реакции между ингибитором и ферментом [c.164]

Можно определять активность АХЭ или ХЭ. Для определения активности АХЭ в большинстве случаев подвергают гемолизу эритроциты ХЭ определяют в сыворотке крови. При использовании цельной крови можно путем выбора специфического субстрата (ацетил-р-метилхолина для АХЭ и бутирилхолина для ХЭ) или применяя определенные концентрации субстрата достигнуть дифференцирования ферментов. Последний из указанных способов основан на уже описанном ингибировании АХЭ более высокими концентрациями субстрата. Так, при концентрации ацетилхолина 10 М определяется преимущественно АХЭ, при концентрации же 10 М — ХЭ, однако в каждом случае в определенной степени (примерно на /б) проявляет активность и другой фермент. Определение активности осуществляют либо по установлению скорости ферментативного расщепления субстрата (кинетический метод) или путем определения конечных продуктов" и не вступившего в реакцию субстрата. [c.165]

Титриметрическое определение уксусной кислоты, образующейся при расщеплении ацетилхолина, с феноловым красным в качестве индикатора используется для определения табуна и зарина в концентрации 0,1 мкг/мл, а с крезоловым красным — для определения инсектицидов Многие авторы применяют АрН-метод. Наиболее подходящим для контролирования протекающих очень быстро процессов ингибирования действия ферментов, например в случае расщепления метилфторфосфорилхолинов, является потенциометрический метод, при котором постоянное значение pH поддерживается автотитратором. Очень важно, что по этому методу можно работать без добавл ения буфера. Таким образом исключается присутствие различных ионов, которые в известной мере влияют на действие ферментов. [c.176]

Отмеченные здесь возможности находят приложение в конкретных методах. Йип и Кук (Yip, ook, 1959) произвели экспериментальное сравнение энзиматических методов, заканчивающихся колориметрическим определением ацетилхолина и определением уксусной кислоты путем титрования, измерения разницы pH и измерения углекислоты. Было показано, что их чувствительность, точность и трудоемкость приблизительно одинаковы. Следует отметить, что холинэстераза разных видов животных и даже разных тканей одного животного различается по своей активности. Кроме того, многие методы выделения холинэстеразы позволяют полу-wT ai [c.17]

Значительный интерес представляет агар-диффузионный метод определения количества фосфорорганических пестицидов (Sandi, Wight, 1961). Предварительно готовится смесь агара с гемолизи-рованной кровью и бромтимоловым синим с рН-7.7. Смесь ровным слоем наносится на стеклянную пластинку. В лунки агарового слоя помещают по 0.1 мл раствора исследуемого образца (вытяжка из анализируемых тканей) и оставляют на 18 час. После опрыскивания раствором ацетилхолина вокруг лунок образуются окрашенные зоны, но величине диаметра которых можно судить о количестве пестицида в образце. Предварительно должна быть произведена градуировка. Чз ствительность определения составляет около 10 моль/л. [c.21]

Некоторые исследователи, например из группы Гилмана и Джерарда, нашли, что при воздействии ДФФ на нерв можно подобрать такие концентрации яда (например, lO- Ai), при которых холинэстераза оказывается почти полностью угнетенной, а проведение не нарушается [4, 15, 25]. В результате возник спор по поводу экспериментальной техники. Группа Нахманзона считает, что манометрический метод недостаточно точен для определения низких уровней холинэстеразы (хотя Боярский и др. [4] в дальнейшем не нашли остаточной холинэстеразы и при использовании высокочувствительной методики, основанной на исчезновении ацетилхолина). Далее, они полагают, что в обработанном ДФФ нерве часто имеется избыток яда, который не находится в контакте с холинэстеразой. При гомогенизаций такой контакт происходит и-наблюдается высокая степень угнетения фермента, которая, по существу, является артефактом. При исключении этих факторов группа Нахманзона нашла, что проведение осуществляется только в том случае, есл-и в наличии имеется холинэстераза [7,9, 35]. Однако Крисцичелли и др. [15], Боярский и др. [4] и Гилман [26] тоже приводят экспериментальные доказательства в пользу того, что избытка ДФФ обычно не бывает. [c.186]

Лучший из известных колориметрических методов определения холинэстеразы основан на измерении количества ацетилхолина, остающегося к концу реакции с помощью методики Хестрина [43]. Использование этой методики для определения активности холинэстеразы описали Меткаф [70], Роббинс и др. [901, Флейшер и др. [33] и Винсент и Сегонзак [108[. Преимущество метода состоит в его исключительной чувствительности, вследствие чего он особенно пригоден для измерения очень малых количеств фермента, например в микроопределениях, применяемых для выявления отравлений ФОС, или в исследовании небольших остаточных количеств ФОС у тяжело отравленных животных. Многие ингибиторы холинэстеразы создают помехи при пользовании этим методом, и поэтому он малоудобен для изучения угнетения холинэстеразы 1п уТ1го. [c.435]

Рис. 19-26. Измерение тока через открытый канал ацетилхолинового рецептора при разных значениях мембранного потенциала. С помощью таких измерений можно установить ионную селективность каналов. Ток, переносимый через открытый канал ионами определенного вида, будет изменяться при изменении мембранного потенциала определенным образом в зависимости от вида иона и градиента его концентрации по обе стороны мембраны. Зная градиенты концентраций основных присутствующих ионов, можно определить ионную селективность канала путем простого измерения зависимости ток/напряжение более полную информацию можно получить в результате повторных измерений при других концентрациях иона. А. Зарегистрированный с помощью метода пэтч-клампа ток, проходящий через одиночный канал, находящийся в растворе с фиксированной концентрацией ацетилхолина, при трех различных значениях мембранного потенциала. В каждом случае канал случайным образом переходит из закрытого состояния в открытое и обратно, но при некотором значении мембранного потенциала, которое называют потенциалом реверсии, гок равен нулю даже тогда, когда канал открыт. В данном случае потенциал реверсии близок к О мВ. Б. Такое же явление можно наблюдать, измеряя после одиночной стимуляции нерва общий ток через больщое количество одиночных каналов с ацетилхолиновым рецептором, находящихся в постсинаптической мембране нервно-мыщечного соединения. На графиках показаны изменения этого гока, измеренного с помощью внутриклеточных электродов в условиях фиксации напряжения. Каналы открываются при коротком воздействии ацетилхолина, но если мембранный потенциал поддерживается на уровне потенциала реверсии, го ток равен нулю. Поскольку открытые каналы проницаемы как для Na . так и для К . а значения электрохимических движущих сил для этих ионов различны, нулевой ток в действительности соответствует уравновещенным и направленным навстречу друг другу токам Na и К . (Эти каналы проницаемы и для Са , но ток, переносимый ионами кальция, очень мал, так как их концентрация низка.)

Доказано, что ацетилхолин выступает как передатчик нервного импульса в автономных ганглиях . Позднейшие исследования показали, что ацетилхолин является передатчиком самостоятельного нервного импульса в мышцах млекопитающих выявлена возможность аналогичного механизма его действия на центральную нервную систему . Эти выводы были проверены, особенно в клинической части " . Полученные результаты положили начало многочисленным исследованиям деталей этих явлений, например распределения, специфичности и очистки холин-эстераз , методов определения активности этих энзимов и изучения взаимодействия энзима, среды и алкалоидов . Следует добавить, что чисто химические гипотезы не дают полного представления о всем физиологическом процессе. Недавно появилось интересное сообщение об электротехнической трактовке передачи импульса и было обращено внимание на электрогенетические свойства ацетилхолина . [c.574]

УФ-облучение в интервале длин волн 300—400 нм 3 — УФ-облучение в интервале длин волн 240—390 нм. Каталитическую активность регистрировали по методу Хестрина, основанному на колориметрическом определении концентрации ацетилхолина [c.150]

Метод Хестрина основан на колориметрическом определении концентрации ацетилхолина. Его чувствительность составляет [c.237]