Ацетилхолинэстераза определение активности

Следует напомнить об известных трудностях идентификации функциональных групп активных центров ферментов по величинам рК, полученным из изучения зависимости скорости реакции от pH. Во-первых, одна и та же группировка в белках разного строения может иметь неодинаковое значение рК из-за влияния соседних групп. Некоторую помощь в этом случае может оказать измерение теплоты диссоциации ионогенных групп, рассчитываемой по измерениям температурной зависимости рК. К сожалению, для холинэстераз эти термодинамические константы достаточно надежно не измерены. Согласно данным Шукудза и Шинода [122], теплоты диссоциации основной группировки ацетилхолинэстеразы эритроцитов и холинэстеразы сыворотки крови человека составляют соответственно 8,5 и 6,5 ккал1моль. Эти величины выше или ниже найденной для диссоциации имидазольной группы гистидина в других белках (6,9—7,5 ккал моль [123]). Если признать, что в обеих холинэсте-разах в качестве основной группировки активного центра выступает имидазол гистидина, то трудно понять столь существенное различие в величинах теплот диссоциации. Во-вторых, даже если измерение активности фермента при разных pH рассматривать в качестве своеобразного титрования функциональных групп активного центра, то полученные результаты нельзя безапелляционно считать отражением прямого участия этих групп в каталитическом акте. Можно представить, что ионы Н и ОН -среды выполняют свою функцию, вызывая не только протонизацию или депротонизацию функциональных групп активного центра, но также и более общую функцию создания и поддержания специфической для каждого фермента третичной структуры. Можно думать, что в создании третичной структуры фермента большую роль играют ионные связи между такими группировками, которые расположены вне активного центра и непосредственно не участвуют в реакции с субстратом. Такие ионогенные группировки при взаимодействии могут сближать друг с другом (или наоборот удалять друг от друга) определенные функциональные группы белка, которые непосредственно участвуют в каталитическом акте. Внешне эта непрямая роль кислотно-основных группировок фермента будет отражаться в форме обычной зависимости кинетических констант (и, V, Кт) от pH, но по существу такая зависимость не дает оснований для решения вопроса, является ли она следствием влияния pH на конформацию белка в районе активного центра или диссоциацию группировки, прямо участвующей в реакции с субстратами. [c.184]

Определение функциональной активности ацетилхолинэстеразы эритроцитарных мембран [c.237]

Работа 150. Определение активности ацетилхолинэстеразы в сыворотке крови [c.475]

Баум [618] описал новый электрохимический метод определения активности ацетилхолинэстеразы с тем же ацетилхолин-селективным электродом с жидкой мембраной. Определение активности ацетилхолинэстеразы проводилось для исходных концентраций хлорида ацетилхолина от 2-10 до 3-10 моль/л в 10 — 50 мл буферного физиологического раствора при активности холинэстеразы в пределах от 0,2 до 8 ед. Уже в течение минуты после введения фермента были получены данные о скорости изменения концентрации субстрата. Скорость гидролиза можно контролировать вплоть до 40%-ной степени гидролиза, прежде чем проявляется мешающее действие холина. Сравнение результатов определения активности ацетилхолинэстеразы, полученных электрохимическим методом и спектрофотометрическим ме- [c.203]

Результаты определения молекулярной активности, полученные Берри [100], по-видимому, не могут быть признаны достаточно точными по причинам, указанным выше (недостаточно высокая специфичность использованных ингибиторов и наличие в эритроцитах других белков, помимо ацетилхолинэстераз, которые могут реагировать с ингибиторами). Данные лаборатории Коэна [101, 102], полученные с отмытой стромой эритроцитов и предотвращением побочных реакций ингибитора, и наши данные [103] с очищенным препаратом растворимой ацетилхолинэстеразы эритроцитов, полученные кинетическим методом, наиболее близки. Это дает основание считать, что молекулярная активность ацетилхолинэстеразы эритроцитов при оптимальных условиях действия фермента состав- [c.168]

В области биохимических исследований динамическое измерение активности ионов Н+, Na+ и К+ в биологических средах может быть использовано при решении ряда задач, таких, как титрование малых количеств белковых растворов, определение активности некоторых ферментов (ацетилхолинэстеразы и др.), изучение ионных процессов в суспензии митохондрий и других внутриклеточных структур. [c.99]

Гистохимическая диагностика основана на качественном определении активности тканевой ацетилхолинэстеразы. С этой целью производят поверхностную биопсию слизистой оболочки прямой кишки и выявляют повышение активности ацетилхолинэстеразы парасимпатических нервных волокон собственной пластинки слизистой оболочки. [c.378]

Для определения молекулярной активности ацетилхолинэстеразы эритроцитов были применены те же методы, что и для фермента сыворотки крови. По нашим кинетическим измерениям, Vм ацетилхолинэстеразы бычьих эритроцитов (pH 7,0 температура 40°) составляет 3,4-10 минГ . Данные других авторов приведены в табл. 17. [c.168]

Следует отметить, что поскольку функциональные свойства ацетилхолинэстеразы существенно зависят от структурного состояния мембраны, то определение уровня ее активности используют в качестве конформационного маркера для оценки различного рода модификаций мембранных компонентов под влиянием физико-химических факторов (см. главу 4). [c.55]

Информативным тестом для оценки нативного состояния эритроцитарной мембраны, а также исследования структурных перестроек и изменений в функционировании ее основных компонентов — липидов и белков, индуцированных воздействием целого ряда физико-химических агентов, является определение функциональной активности конформационного маркера мембраны — ацетилхолинэстеразы (см. раздел 1.2.5). [c.149]

Предварительно выделить мембраны эритроцитов из крови согласно методике, описанной в лабораторной работе № 1. Используя описание методики в лабораторной работе № 5, провести определение каталитической активности АХЭ эритроцитарных мембран в норме и при воздействии УФ-излучения в дозах 1,5 3,0 4,5 кДж/м . Данные занести в таблицу, аналогичную табл. 19. Те же эксперименты провести с буферными растворами свободной ацетилхолинэстеразы (10 моль/л). Оформить табл. 19 для фермента в свободном состоянии. Результаты представить в виде графика, где по оси абсцисс отложены величины доз УФ-света, а по оси ординат — значения активности АХЭ, выраженные в процентах от уровня контрольного образца, для свободного (кривая 1) и мембраносвязанного (кривая 2) фермента. Сделать вывод об уровне фоточувствительности разных форм фермента. Чем могут быть обусловлены различия в характере УФ-индуцирован-ных изменений функциональной активности свободной и связанной АХЭ [c.240]

Определение функциональной активности ацетилхолинэстеразы эритроцитарных мембран после индукции пероксидного окисления липидов [c.240]

Таким образом, в основном во всех группах нрепаратов была выявлена в тон пли ниой степени выраженная никоти-иолитпчсская, мускаринолитпческая п ацетилхолинэстераз-пая активность. При этом наблюдается определенная зависимость между химическим строением и биологическим действием соединений. [c.114]

Мембрана из ПВХ приобретала электродноактивные свойства после обработки ее раствором тетра(п-хлорфенил)бората ацетилхолина в эфире фталевой кислоты, который добавляли в качестве пластификатора [55]. Такой электрод обнаруживал обратимость к холпну и его эфирам и по своим характеристикам был даже лучше имеющихся в продаже электродов с жидкими мембранами, описанных выше, для определения активности ацетилхолинэстеразы [56]. [c.228]

Ю. С. Каган и Ю. И. Кундиев (1961) для суждения о скорости всасывания через неповрежденную кожу кроликов меркаптофоса и его изомеров, препаратов М-74 и М-81 исследовали активность холинэстеразы крови сыворотки (ХЭ-сыворотки) и ацетилхолинэстеразы эритроцитов (АХЭ-эритроцитов). Установлена определенная зависимость степени угнетения холинэстера-.зы и последующего восстановления активности фермента от величины дозы препарата. При нанесении меркаптофоса на кожу в дозе 5 мг/кг резкое снижение активности холинэстеразы отмечено ун е через 1 ч, максимума оно достигало на 2-й день опыта, а затем начиналось постепенное восстановление. С увеличением дозы ФОИ, нанесенного на кожу, повышалась степень угнетения фермента и длительность периода восстановления его. [c.63]

Наиболее подробно изученная протеиназа, химотрипсин, существует в нескольких слегка различающихся формах, которые образуются в результате расщепления определенных пептидных связей в молекуле хи-мотрипсиногена. Последняя представляет собой единую полипептидную цепь, построенную из 245 аминокислот аминокислоты в активном ферменте обычно нумеруются в соответствии с их положением в исходном зимогсне. Важную роль в выяснении механизма действия химотрипсина сыграли данные, полученные при изучении ацетилхолинэстеразы. Было показано, что этот ключевой фермент нервной системы необратимо инактивируется группой сильных фосфорсодержащих ядов, используемых как инсектициды и как отравляющие газы нервно-паралитического действия. [c.107]

В качестве тестов для выявления ранних сдвигов в организме работающих в контакте с химическими веществами предлагаются психофизиологические тесты (тесты на внимание, запоминание и др.), измерение мышечной силы и выносливости к статическому усилию, измерение артериального давления, электрокардиография, исследование скорости зрительно-моторной реакции, адаптометрия, ольфактометрия, термометрия, исследование белковых фракций сыворотки крови, тимоловая проба, проба Квика некоторые специальные пробы (определение карбоксигемоглобина, метгемоглобина в крови, активности различных ферментов, например, ацетилхолинэстеразы и т. д.). Неспецифическое действие химических веществ может быть выявлено с помощью исследования иммунобиологической [c.296]

Почти одновременно с открытием ДДТ было найдено, что некоторые органические эфиры фосфорной кислоты обладают сильными инсектицидными свойствами. В определенных пределах их активность может быть связана со способностью выступать в качестве фосфорилирующих агентов. Инсектициды данной группы токсичны как для насекомых, так и для млекопитающих, поскольку они фосфорилируют (и тем самым блокируют) фермент ацетилхолинэстеразу, ответственный за возникновение и передачу нервных импульсов. Инактивирующее действие фосфорорганических ядов можно приближенно представить как нуклеофильную атаку аниона, образовавшегося за счет связанной с ферментом первичной гидроксильной группы, на атом фосфора с отщеплением уходящей группы Ь (схема а). [c.480]

Как следует из данных табл. 17, наибольшей молекулярной активностью обладает ацетилхолинэстераза нервной ткани электрического органа В. ele tri us. Значение УмЗ-Ю минГ , найденное Нахманзоном и Розенбергом на основании определения молекулярного веса методом седиментации и измерения удельной активности очищенного препарата фермента, отличается от других данных, приведенных в таблице. Причина этого расхождения состоит в том, что другие авторы использовали для расчета величины молярной концентрации каталитических центров, независимо от того, сколько этих центров приходится на молекулу фермента. Так, Мичел и Крон [104] определяли концентрацию каталитических центров по количеству Р -диизопропилфторфосфата, присоединившегося к ферменту. Лоулер [106] применяла для этих целей [c.171]

Новый кинетический метод для определения концентрации каталитических центров ацетилхолинэстеразы применили Уилсон и Гаррисон [105]. Метод основан на исследовании скорости взаимодействия фермента с диметилкарбамилфторидом (формула VI), который аналогично фосфорорганическим соединениям ангидридного строения ингибирует холинэстеразы ацилируя их активные центры. [c.172]

Таким образом, исследуя экспериментально зависимость относительной степени торможения активности фермента ([Е ]/[Е]о) от времени и измеряя площадь под полученной кривой, можно, зная величину определить [Е]о, т. е. концентрацию каталитических центров фермента. Константа определенная ранее в работе Уилсона и сотрудников [ПО, 1И ], составляет для карбамилированной ацетилхолинэстеразы электрической ткани угря 2,6-10" (pH 7,0 температура 25°). [c.173]

Приведенные представления и результаты исследования кинетики действия карбаматов на ацетилхолинэстеразу показывают, что определение величины для таких ингибиторов, исходя из зависимости активности фермента от концентрации ингибитора, необоснованно. Это очень отчетливо можно проиллюстрировать результатами исследования кинетики ингибирования двух типов холинэстераз серией производных карбаминовой кислоты [75]. [c.198]

Ацетилхолинэстераза из Ele trophorus ele t-ri us 260 ООО 64 ООО 4 D/M Определение С-концевых групп предполагает гибридную структуру из двух а- и двух р-полипептидных цепей. Молекула имеет два активных участка 56 [c.394]

Буферно-энаитная смесь. Незадолго до начала определения смешивают равные количества рабочего раствора ацетилхолинэстеразы и буферного раствора. Перед использованием смесь выдерживают для достижения определенной выбранной температуры. Раствор отбирают в количестве, необходимом лишь ддя одного определения, так как активность раствора падает при хранении даже в холодильнике. [c.317]

Для определения зависимости действия фермента от pH и концентрации субстрата был использован также кинетический анализ [59]. Как можно было ожидать из приведенных выше данных, константа Михаэлиса Кт значительно изменялась с изменением концентрации Мп2+. (Величина Кт представляет собой концентрацию субстрата, при которой скорость реакции равна половине максимально возможной эта величина служит мерой сродства субстрата к ферменту.) Оптимум pH составлял 8,5 и не зависел от концентрации Мп2+ р/Са гипотетического активного центра фермента был равен 7,2, т. е. был таким же, как у ацетилхолинэстеразы. Маунтер считает, что оба фермента содержат в своем активном центре гистидин. [c.143]

Прежде чем обсуждать вероятность того, что повышение активности эстеразы действительно является причиной защитного эффекта против ФОС, следует точно решить, активность какой именно эстеразы при этом повышается Обычно для определения эстеразы применялся фенилбензоат, но были также поставлены опыты, в которых субстратами служили бензоилхолин и ацетил-Р-метилхолин. Эти опыты показали, что введение алдрина не влияет на активность ложной холинэстеразы сыворотки и ацетилхолинэстеразы эритроцитов. В то же время установлено, что способность гидролизовать триацетин возрастает строго параллельно действию на фенилбензоат. На этом основании авторы пришли к выводу, что сывороточная эстераза , активность которой увеличивалась после введения алдрина, была алиэстеразой. К сожалению, мы не можем больше считать, что [c.243]

Если конформационное изменение индуцируется силами связывания субстрата, как в механизмах индуцированного соответствия или деформационном, индуцирующие силы не могут быть одинаковыми для различных субстратов, и маловероятно, однако не невозмоншо, что для различных субстратов будут наблюдаться одинаковые скорости. Если конформационные изменения являются спонтанными и происходят в присутствии и в отсутствие субстрата, они не могут вызвать индуцирования напряжения, но могут привести к изменению каталитически активной конформации фермента. Такое изменение может произойти со скоростью, которая не зависит от природы субстрата. В связи с этим интересно отметить, что максимальные константы скорости для реакции родственных субстратов, которые, как полагают, имеют общее ковалентное промежуточное соединение, часто точно не эквивалентны. Такие малые различия, которые, по-видимому, превышают экспериментальные ошибки определения констант скоростей, наблюдаются, например, для папаина и ацетилхолинэстеразы [59]. Причиной этого может быть либо то, что разложение общего ковалентного промежуточного соединения не является полностью лимитирующей стадией, так как скорость его образования вносит известный вклад в наблюдаемую максимальную скорость реакции, или то, что скорость определяющей стадией является конформационное изменение, а не разложение промежуточного соединения. [c.244]

Изучение. инактивации дало сведения об активной области некоторых гидролитических ферментов, в частности химот1рипсина и ацетилхолинэстеразы. а-Амино-кислоты или некоторые функциональные производные этих соединений, которые являются специфическими субстратами или конкурирующими ингибиторами для а-химотрипсина, могут быть описаны общей формулой R HR R", где R, R и R" — группы, определяющие свойства этих молекул соответственно а-амино- и.чи ацил-аминогруппа, боковая цепь а-аминокислоты и карбоксильная группа или производное карбоновой кислоты. Было высказано предположение [346], что вышеупомянутые специфические субстраты и конкурируюшие инги- биторы могут соединяться с ферментом путем взаимодействия групп R, R, R" и определенного ряда центров рь р2 и рз, которые, как предполагается, составляют каталитически активную область фермента. Полагают, что степень, с которой любое данное вещество будет связываться с активной областью фермента, зависит от того, в какой мере молекула и асимметрическая каталитическая поверхность дополняют друг друга, и также от того, насколько присоединяющаяся молекула и активная область способны изменять свои поверхности для улучшения контакта. Результаты кинетических исследований с применением ряда субстратов и конкурирующих ингибиторов а-химотрипсина согласуются [c.135]

Какие принципы лежат в основе определения ферментативной активности мембраносвязанных ацетилхолинэстеразы и На , К+-АТФа-зы [c.275]

Смотреть страницы где упоминается термин Ацетилхолинэстераза определение активности: [c.303] [c.244] [c.160] [c.244] [c.374] [c.164] [c.211] [c.243] [c.35] [c.73] [c.354] [c.589] [c.13] [c.363] [c.862] [c.318] [c.363] [c.474] [c.318]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология