Белки, масс-спектрометрия

В период между 1925 — 1930 гг. Сведберг с помощью ультрацентрифугирования произвел определение молекулярных масс различных белков. Одновременно применение других аналитических методов, как, например, электрофореза и различных видов хроматографии, привело к развитию аналитической белковой химии. В 1951 — 1956 гг. Сенгер [20, 21] установил аминокислотную последовательность инсулина. Использованные при этом методы легли в основу систематического определения первичной структуры многих белков. Созданный Эдманом в 1966 г. секвенатор и применение масс-спектрометрии в сочетании с ЭВМ как средством регистрации, обработки и оценки масс-спектрометрических данных привели к тому, что к настоящему времени опубликовано более 15 ООО работ, посвященных определению аминокислотных последовательностей, и установлены первичные структуры более чем для 1000 белков. [c.343]

В результате образуется фенилтиогидантоин, содержащий боковой радикал аминокислоты Ri, который может быть идентифицирован путем измерения какой-либо физической или физико-химической характеристики, позволяющей различать гидантоины, соответствующие разным входящим в состав белков аминокислотам. В качестве такой характеристики может служить хроматографическая подвижность в какой-либо предварительно проградуированной по стандартным образцам гидантоинов системе или молекулярная масса, определяемая с помощью масс-спектрометра. [c.271]

Рис. 27. Комбинация метода Эдмана и масс-спектрометрии в анализе структуры белка.

Книга содержит описание основных современных физико-химических методов, применяемых для анализа органических соединений, — спектроскопии в инфракрасной, видимой и ультрафиолетовой частях спектра, рентгенографии, хроматографии, масс-спектрометрии, полярографии, ЯМР-и ЭПР-спектроскопии и др. Изложены теоретические основы методов, описаны современная аппаратура и возможности применения методов для исследования структуры и состава полимеров. Приведено большое число методик анализа различных природных и синтетических высокомолекулярных веществ — пластиков, эластомеров, смол, белков, целлюлозы, волокон и т. д., а также ряда низкомолекулярных соединений, применяемых при получении и переработке полимеров. [c.4]

Важнейшим этапом в выяснении структуры полипептидов и белков является определение последовательности аминокислот. Не считая применения масс-спектрометрии для решения этой проблемы [14] (см. кн. I гл. 5), основным методом определения последовательности аминокислот является анализ концевых групп он состоит в определении аминных и карбоксильных концевых групп. Для решения этой задачи были разработаны различные химические и ферментативные методы. [c.402]

Существует большое число других более или менее специальных способов, использование которых определяется характером проблемы и доступностью аппаратуры. Так, молекулярные веса даже очень мало летучих веществ часто оказывается возможным определить с помощью масс-спектро-метрии, однако, поскольку масс-спектрометры еще не стали таким же стандартным лабораторным оборудованием, как инфракрасные спектрометры,, их использование для этой цели началось только в последнее время. Во многих случаях, однако, масс-спектрометрия оказывается наиболее удобным методом, в частности потому, что хорошее разрешение обычно достигается вплоть до масс, равных 600. Молекулярные веса соединений с очень большим молекулярным весом, таких, как белки и полимеры, обычно определяют путем анализа на концевые группы, измерения осмотического, давления, вязкости, рассеяния света и скорости седиментации. Некоторые из этих методов будут рассмотрены более подробно в последующих главах. [c.28]

В тандемной масс-спектрометрии первый масс-спектрометр (MS-I) служит источником ионов определенной массы для второго масс-спектрометра (MS-II). В зоне столкновений масс-спектрометра MS-II эти ионы при соударении с электронами распадаются на серию новых ионов-фрагментов, которые и анализируются прибором. Данный метод, который сокращенно обозначают MS/MS, особенно перспективен в анализе смесей веществ большой молекулярной массы. Сначала в первом приборе используют мягкие методы ионизации, что позволяет получить смесь молекулярных ионов, но избежать при этом сильной фрагментации. Из этой смеси масс-спектрометр MS-I отбирает лишь одну из масс, которая направляется во второй прибор MS-II, где подвергается глубокой фрагментации и дает полный спектр, характеризующий строение данного компонента смеси. Важными достоинствами тандемной масс-спектрометрии являются высокая скорость и специфичность. Это мощный метод анализа групп соединений близкого молекулярного строения. Он особенно эффективен, если нужно подавить все сигналы побочных веществ и загрязняющих примесей, всегда присутствующих в биологических образцах. Этот метод позволяет определять аминокислотные последовательности в белках, содержащих до 20 аминокислотных остатков, и в некоторых случаях для этого достаточно всего несколько микрограммов вещества. [c.197]

С целью изучения влияния дефолиантов на синтез свободных аминокислот и белка в листовых пластинках хлопчатника был поставлен опыт с применением изотопа азота N . На растения хлопчатника за 20 мин до обработки дефолиантами наносили раствор сульфата аммония, меченный N (обогащение 31,2). Обогащение азота белка и свободных аминокислот изотопом N определяли на масс-спектрометре. Атом-процент меченого азота в исследуемом [c.139]

Продолжительность экспозиции растений в камере с N2 варьировала по условиям опыта от 12 до 90 часов. По истечении заданного срока экспозиции растения немедленно снимали и подвергали иоследованию. Листья, стебли и корни растений после взвешивания растирали в стеклянной ступке и затем экстрагировали водой. Водные экстракты подвергали нагреванию на кипящей водяной бане. В этих условиях происходила полная коагуляция белков, которые затем отфильтровывали и исследовали отдельно от фильтрата, содержащего только небелковые соединения азота. Выделенные из растений фракции анализировали на содержание азота по Кьельдалю и его изотопный состав на масс-спектрометре МС-2. [c.202]

В самое последнее время был разработан новый метод прямого определения структуры и последовательности аминокислотных остатков в полипептидах с помощью масс-спектрометрии, создавший основу для экспресс-метода анализа первичной структуры белков (М. М. Шемякин, Ю. А. Овчинников, А. А. Кирюшкин, Н. С. Вульфсон). [c.514]

В настоящее время для анализа первичной структуры белков как с С-, так и с N-конца широко применяют масс-спектрометрию. [c.61]

Определение структуры гликопротеинов требует (как и в случае других молекул) их предварительной очистки, которая может быть достигнута с помощью методов, обычно применяемых для белка. Для очистки некоторых гликопротеинов оказалось весьма плодотворным также применение аффинных колонок с лектинами (см. ниже). Углеводный состав гликопротеинов определяли после кислотного гидролиза при помощи газожидкостной хроматографии—масс-спектрометрии (ГЖХ—МС). Для изучения детальной структуры олигосахаридных цепей было опробовано множество различных методов. Наиболее эффективной оказалась комбинация ГЖХ—МС и ЯМР-спектрометрии с высоким разрешением. Особенности связей между сахарами в гликопротеинах (рассмотрение которых не входит в задачу данной главы) имеют фундаментальное значение для структуры и функций этих молекул. [c.300]

ПРИМЕНЕНИЕ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ ЭЛЕКТРОННОГО УДАРА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИНОКИСЛОТНОИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ [c.515]

ЭТОГО прибора, который можно использовать для решения многих других проблем биохимии, то нужно пересмотреть свое отношение к этому следует предпочесть масс-спектрометр прибо ру, предназначенному только для определения аминокислотной последовательности белков. [c.517]

Исследуемую фракцию после модификации описанным выше способом помещают в испаритель и посредством штока вводят в ионный источник. Благодаря различной летучести модифицированных пептидов при плавном нагревании из смеси дробно возгоняются индивидуальные компоненты, и поэтому масс-спектры, которые записываются в определенные промежутки времени, обычно характеризуют те пептиды, содержание которых в газовой фазе является преимущественным. Сравнивая масс-спектры образца, получаемые при различных температу-рах, удается однозначно определять аминокислотную последовательность индивидуальных пептидов смеси. Такой подход дает хорошие результаты при анализе смесей, содержащих до пяти различных пептидов. Ниже будут обсуждены общие приемы установления первичной структуры белков, которые позволят наиболее эффективно использовать преимущества масс-спектрометрии при установлении аминокислотной последовательности коротких пептидов. При этом следует помнить, что для достижения максимального эффекта при установлении первичной структуры неизвестного белка всегда следует комбинировать классические и масс-спектрометрический методы. Такой подход может выглядеть следующим образом [c.521]

В ряде случаев как метод решения структурных задач следует предпочесть масс-спектрометрию. Например, для определения нуклеотидной последовательности участка ДНК, соответствующего определенному гену, потребуется затратить несравненно меньше усилий, если каким-либо методом определена частичная аминокислотная последовательность белка, первичную структуру которого он кодирует. Такая информация может быть получена в течение нескольких недель с использованием масс-спектрометрии. Масс-спектрометрия — идеальный метод быстрой оценки степени гомологичности родственных белков [4]. Кроме того, масс-спектрометрия — это и непревзойденный метод структурного анализа амидов и определения положения остатков триптофана в пептидной цепи. План эксперимента при определении аминокислотной последовательности с применением масс-спектрометрии можно описать следующим образом [c.522]

Как MALDI, так и ионизацию электрораспылением можно легко сочетать с ферментативным расщеплением белков для последующего определения их параметров. После расщепления белка полученная смесь целиком помещается в MALDI-спектрометр и анализируется. В наиболее благоприятных случаях можно определить массу более чем 90% пептидных фрагментов. Этот подход можно использовать для определения изменений в белке, например при определении параметров рекомбинантных белков или для идентификации ковалентно-связанных модификаторов белка. Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением, вследствие того, что она легко сочетается как с ЖХ-МС, так и тандемной масс-спектрометрией, может быть источником еще и дополнительной информации о последовательности аминокислот в белке. При химической ионизации пептид фрагментируется на два комплементарных ряда ионов, которые имеют последовательности аминокислот, начиная с С- и N-терминальных атомов пептида. Тандемная масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением оказывается более экспрессной и находит более разнообразное применение, чем традиционные биохимические методы, такие, как последовательное отщепление аминокислот по методу Эдмана. [c.308]

Одним из чрезвычайно интересных новых областей приложения масс-спектрометрии, которые активно изучается в настоящее время, является биохимия, или, точнее, определение параметров белков. Это является результатом внедрения таких методов, как MALDI и ионизации электрораспылением, которые обеспечивают экспрессное и точное определение средних молекулярных масс белков при малом количестве материала (на уровне пикомолей или ниже). Определяют среднюю молекулярную массу белка, так как для разделения различных изотопных пиков потребовалось бы спектральное разрешение по массе свыше 10000. В сравнении с другими, более традиционными биохимическими методами для определения молекулярной массы биологических макромолекул, такими, как SDS-PAGE и гель-проникающей хроматографии, масс-спектрометрия обеспечивает быстрое и легкое измерение, требующее малых количеств материала и обеспечивающее непревзойденную точность. Однако масс-спектрометрия является деструктивным методом, и использованный образец нельзя восстановить для последующих экспериментов. [c.307]

В предыдущих главах рассматривались основные спектроскопические методы выяснения структуры органических соеди-неиений, базирующиеся на поглощении электромагнитного излучения. Начиная примерно с 1960 г., в дополнение к этим методам все шире используется принципиально иной физический метод - масс-спектрометрия. Основой масс-спектрометрии являются разделение ионов по величинам т/г (отношения массы к заряду) и измерение населенностей (интенсивностей) ионов каждого типа. Популярность метода легко объяснима, поскольку он позволяет определить молекулярную массу и молекулярную формулу практически любого вещества, расходуя ва это ничтожное количество образца.) Кроме того, осколочные ионы несут полезную информацию о структуре изучаемого вещества.- Масс-спектрометрия постоянно развивается как в инструментальном аспекте, так и в отношении методов ионизации, благодаря чему стало возможным регистрировать масс-спектры подавляющего большинства органических веществ, а в последние годы даже высокомолекулярных, термически неустойчивых и нелетучих соединений, например пояи-пептидов и белков с молекулярной массой более 10000. Эта глава посвящена интерпретации масс-спектров и их применению для определения строения органических веществ. [c.176]

Существенным недостатком применения ГХ—МС метода для профильного анализа является невозможность анализа малоле тучих соединений, которые составляют более 75 % всех веществ присутствующих в физиологических средах (белки, пептиды, нуклеиновые кислоты, нуклеозиды и др ) Большие перспекти вы для анализа этих веществ связаны с сочетанием ВЭЖХ с масс спектрометрией [c.187]

Введение различных химических меток, репортерных групп, расширяющих возможности физико-химических методов (ЯМР- и ЭПР-спектроскопия, масс-спектрометрия, рентгеноструктурный анализ и др.) при исследовании структуры и функции белков (см. с. 111). [c.160]

Резкая интенсификация научной деятельности за последние десятилетия вынуждает исследователя отказаться от чтения множества узкоспециальных публикаций и большую часть информации получать из заслуживающих доверия обзоров. Эта ситуация наблюдается и в области анализа аминокислот, пептидов и белков, где каждые пять лет появляются новые эффективные методы, способные заменить уже существующие. Например, в настоящее время газожидкостная хроматография успешно конкурирует с автоматической ионообменной хроматографией аминокислот по Муру и Стейну, которая полностью заменила микробиологический анализ, хроматографию на бумаге и другие методы количественного анализа, существовавшие до 1958 г. Определение последовательности пептидов — трудоемкая задача при использовании обычных методов — производится на данном этапе автоматически на секвенсере Эдмана, а последовательность небольших пептидов удобно определять с помощью масс-спектрометрии. [c.6]

Принципы техники масс-спекрометрии и поведение ионизованных органических молекул под действием электронного удара детально обсуждались многими исследователями [1]. Типы фрагментации в условиях масс-спектрометрии индивидуальных свободных аминокислот [2,3], алифатических эфиров аминокислот [4], Ы-ацетиламинокислот [5] и их алифатических эфиров [6] подробно описаны в ряде обзорных статей [7]. Ввиду общего значения проблемы определения аминокислотной последовательности в пептидах и белках ниже будут рассмотрены принципы применения масс-спектрометрии в области пептидных производных. Следует отметить несколько последних обзоров [7] по этой быстро развивающейся области (см. также разд. 4.8). [c.189]

Можно предвидеть значительное улучшение химических и биохимических методов определения последовательностей оснований в нуклеиновых кислотах и аминокислотных последовательностей в белках. Сейчас газофазный секвенатор, работающий в автоматическом режиме, позволяет надежно определять до 60 последовательно расположенных аминокислот (называемых аминокислотными остатками), расположенных с аминоконца белка. Применение тандемной масс-спектрометрии или других новых методов позволяет устанавливать в автоматическом режиме полные аминокислотные последовательности белков, содержащих несколько сот аминокислотных остатков. [c.180]

Параллельно с изучением строения белков и пептидов в Советском Союзе ведутся интенсивные работы по созданию новых эффективных методов анализа их первичной структуры. В этом отношении особенно перспективным оказался масс-спектрометрический метод. Так, была предложена удачная модификация метода Эдмана с использованием масс-спектрометрии для определения фенил- и метилтиогидантоинов (В. М. Степанов, И. С. Вульфсон). [c.514]

Биохимические метйды, используемые в стандартизации и контроле качества лекарств. Для стандартизации и контроля качества лекарств используют три группы методов. 1. Физические методы — спектрофотометрия, флюоресцентный анализ, масс-спектрометрия и др. 2. Химические методы неорганического, коллоидного и органического анализа состава лекарств и их метаболитов. Эти группы физико-химических методов позволяют установить структуру вещества и лишь сделать предположение о его биологической активности. 3. Биохимические исследования с использованием субклеточных фракций, клеток, тканей, органов и организмов позволяют оценить биологическую активность лекарств. Применение биохимических методов обеспечивает стандартизацию лекарств и контроль качества на этапах производства и хранения. Широкое распространение получило использование свойства специфического взаимодействия белков в системах фермент—субстрат , лекарство—рецептор , антиген-антитело . На основе этого фундаментального свойства белков созданы специфичные и высокоточные методы радиоиммунно-го, иммуноферментного, хемилюминесцентного анализа, аффинной хроматографии и др. [c.478]

Большой вклад в разработку этого метода внесли К. Биман, Е. Ле-дерер а также М. М. Шемякин, Н. С. Вульфсон, Ю. А. Овчинников Применение масс-спектрометрии уже сейчас создает возможность упрощения всего процесса расшифровки аминокислотных последовательностей, начиная со стадии изучения структуры фрагментов. В будущем, вероятно, станет возможным прямое масс-спектрометрическое изучение высокомолекулярных белков. [c.87]

Масс-спектрометры, которые можно использовать для установления первичной структуры пептидов должны удовлетворять двум основным требованиям. Они должны обладать высокой чувствительностью и при максимальной чувствительности регистрировать ионы с массами до 1000 а.е. м. В своих исследованиях автором использовались масс-спектрометры MS-902 к MS-50 фирмы KRATOS и ZAB фирмы VG Analyti al, но можно применять и другие приборы. Приобретение масс-спектрометра для небольшой научной группы, занятой установлением структуры белков, может показаться слишком расточительным предприятием. Однако, если принять во внимание универсальность [c.516]

В настоящее время масс-спектрометры применяются для анализа последовательности аминокислот в олиГопептидах, получающихся в результате гидролиза белков или другим путем. Для повышения летучести пептиды ацетилируют и метилируют. Пептидные связи легко расщепляются при бомбардировке их электронами, причем фрагментация идет с С-конца пептидов. Поскольку все аминокислоты имеют разный молекулярный вес, то по разнице в массах, соответствующих двум соседним основным пикам на спектре, сразу же идентифицируется С-концевая аминокислота более тяжелого фрагмента. Для определения аминокислотной последовательности исходного иона по разнице между основными пиками на масс-спектрах применяются ЭВМ и составлены соответствующие программы. В настоящее время для такого анализа аминокислотной последовательности белков лимитирующей является стадия фракционирования гидрйлизата белка на отдельные олигопептиды. [c.182]

Градуировка прибора проводится при помощи метода Кьель-дала [42]. После градуировки анализ каждого отдельного образца длится всего 20 мин, поэтому образцы можно поместить в дозатор и пропускать через прибор в автоматическом режиме. Система предусматривает контролируемые микропроцессором градуировку спектрометра и обработку данных, что позволяет считывать показания непосредственно в виде значений концентрации белка (мкг/мл или масс.%). В приборе имеются устройство для распечатки экспериментальных результатов и клавиатура для ввода числовых данных, а также встроенный осциллограф (для визуального контроля за разверткой сигнала) и экран цифрового дисплея для представления результатов и вывода сообщений для оператора. [c.38]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология