Нингидрин, определение пептидов

Анализ. Обычно анализ а-А. основан на взаимод. с нин-гидрином, в результате к-рого А. расщепляется до альдегида, СО2 и NH3, а NH3 образует с нингидрином фиолетовый краситель. Для количеств, определения измеряют объем выделившегося Oj или, чаще, фотометрируют образующийся краситель. Последний метод используется в автоматич. хроматографах, позволяющих разделять на сульфокатионитах и количественно анализировать сложные смеси аминокислот и пептидов. Еще более чувствителен флуоресцентный анализ продуктов реакции А. с о-фта-левым диальдегидом. Быстро развивается лигандообменный хроматографический анализ А. и пептидов на си-ликагельных сорбентах в присутствии ионов меди. Бумажная и тонкослойная хроматография чаще используются для качественного анализа. Измерение объема N3, выделяющегося при дезаминировании А. азотистой к-той, а также титрование А. щелочью в избытке формалина (методы Ван Слайка и Сёренсена) сохранили лишь историческое значение. [c.138]

Существенные экспериментальные трудности, которые до последнего времени ограничивали исследования в области белковой химии, в значительной степени обусловливались отсутствием простых и надежных способов анализа аминокислот. Лишь благодаря развитию за последние два десятилетия ионообменной и распределительной хроматографии удалось разработать автоматический метод количественного анализа аминокислот с использованием окисления аминокислот нингидрином и фотометрирования продуктов реакции [9]. Однако стремительное развитие химии белков и пептидов, среди которых обнаружены важнейшие биорегуляторы и антибиотики, уже сейчас предъявляет новые требования по чувствительности и быстроте анализа. Сложность аппаратурного оформления и дороговизна эксплуатации, безусловно, ограничивают применение автоматического анализатора Мура и Штейна и в значительной степени обусловливают интерес к разработке новых методов аналитического определения аминокислот, свободных от указанных недостатков. [c.252]

Образование продуктов, обладающих флуоресценцией (сами реагенты не флуоресцируют), позволило значительно увеличить чувствительность метода. С флуорескамином открывается 10 —10 " молей аминокислот. В отличие от нингидрина реакции не мешает присутствие аммиака. Реакция протекает при комнатной температуре при pH 7,0— 9,0. Поскольку флуорескамин в водной среде разрушается (в течение нескольких секунд), для приготовления раствора используют безводные жидкости (ацетон, ацетонитрил, диметилсульфоксид и др.). Продукт реакции стабилен в течение нескольких часов. Пептиды и белки, проявленные флуорескамином, могут использоваться для определения аминокислотного состава и аминокислотной последовательности. [c.130]

Кроме детекторов, предназначенных для количественного анализа аминокислот и пептидов по реакции с нингидрином или другими реагентами, дающими цветную реакцию, были описаны Также и другие детекторы. Полярографическое определение аминокислот в виде их медного комплекса основано на образовании из двух молекул аминокислоты и одного иона меди темно-синего комплекса. Этот комплекс пропускают через ячейку поляро-графа, где определяется количество меди [122]. Аминокислоты можно также определять путем использования динитрофторбен-зола с последующим фотометрическим определением ДНФ-ами-нокислот при 420 нм [123]. [c.27]

Для количественного определения аминокислот и пептидов по приведенным выше реакциям требуется колориметр или фотометр, с помощью которых обнаруживают изменения в свето-поглощении, связанные с протеканием реакций. Поскольку нингидрин наиболее широко используется для обнаружения аминокислот и белков, он послужит основой для дальнейшего обсуждения колориметра. [c.26]

Практически в любом биохимическом исследовании очень важно уметь обнаруживать и точно определять ничтожные количества специфических соединений. Чаще всего для этого используют особые реагенты— индикаторы, которые при взаимодействии со специфическими соединениями определенным образом окрашиваются. Например, для выявления на хроматограмме аминокислот или пептидов, присутствующих в очень малых количествах (доли микромоля), хроматограмму опрыскивают нингидрином (дополнение 8-Е). Если выявляемое соединение находится в растворе, то по интенсивности окрашивания можно определить его количество. Фенолы и концентрированная серная кислота окрашивают сахара (в растворе или на хроматографической бумаге) в красный цвет. Эта реакция лежит в основе колориметрического анализа углеводов. Восстанавливающие сахара выявляют на хроматограммах, опрыскивая последние раствором нитрата серебра. [c.179]

Наиболее общим методом определения концентрации пептидов является колориметрия продуктов реакции с нингидрином [2]. Это один из наиболее чувствительных колориметрических методов. Для обнаружения аминокислот и пептидов разработаны как обычный, так и полностью автоматизированный варианты, причем нингидриновый реагент не вызывает коррозии и его можно подавать обычным микронасосом. Реакция идет по свободным аминогруппам, но в некоторых случаях хромофор образуется с низким выходом. Данные по окрашиванию дипептидов можно найти в работе [3]. У всех дипептидов, содержащих в качестве Ы-концевой аминокислоты аргинин, треонин, серин, глутаминовую кислоту, глицин, фенилаланин, метионин, лейцин и тирозин, интенсивность окраски составляет 1,6-10 у лейцина эта величина составляет 1,7-10 . У дипептидов с М-концевым лизином и аспарагиновой кислотой интенсивность окраски несколько выше (на 20 и 29% соответственно), а дипептиды с Ы-концевым гистидином и триптофаном проявляются несколько слабее (42 и 67% соответственно от средней интенсивности). Дипептиды с М-концевым пролином, валином и изолейцином окрашиваются очень слабо [2,7 6,4 и 8,5% от средней (1,6- 10 ) интенсивности]. [c.391]

Анализ а-А. обычно основывается на их взаимодей-ствии с нингидрином (тракетогидринденгидрат), в результате к-рого А. расщепляется до альдегида, СО и NHз, а нингидрин образует с NHs фиолетовый краситель. Для количественного определения измеряют объем выделившейся СО2 или, чаще, фотометрируют образующийся краситель. Этот метод используется в автоматич. анализаторах, позволяющих разделять на сульфокатионитах и количественно анализировать сложные смеси А. и пептидов. Ароматич. амины и А. также дают цветную реакцию с нингидрином. [c.51]

Указанные недостатки удалось преодолеть благодаря щелочному гидролизу [4]. Эта методика основана на полном гидролизе всех пептидных связей и последующем определении концентрации свободных аминокислот по реакции с нингидрином. Кроме того, при нагревании полностью удаляется аммиак, присутствующий в образце, что очень сильно снижает фон. Щелочной гидролиз позволяет детектировать пептиды, дающие слабое [c.391]

Анализ элюируемых фракций. Содержание пептидов в элюатах можно определять количественно посредством реакции с нингидрином или по Фолину — Лоури, а также одним из реактивов на специфические аминокислотные остатки (см. стр. 129—131). Метод Фолина — Лоури является более чувствительным, особенно в случае длинноцепочечных пептидов. Чувствительность нингидринной реакции на пептиды может быть значительно увеличена путем предварительного проведения быстрого щелочного гидролиза [35]. Если нингидринную реакцию предполагается использовать при анализе фракций с колонок, для элюирования которых будут применяться пиридиновые или коллиди-новые буферы, то соответствующие растворители необходимо предварительно перегнать над нингидрином для удаления взаимодействующих с ним примесей. Если же при анализе фракций, содержащих пиридиновые или коллидиновые буферы, необходимо использовать реакцию Фолина — Лоури, то пробы упомянутых фракций следует предварительно упарить досуха для удаления из них пиридина и коллидина, которые мешают этому определению. Это упаривание удобно проводить путем отбора аликвотных проб соответствующих фракций в аналитические пробирки [c.119]

При двумерном разделении пептидов для обнаружения пятен пригоден значительно более разбавленный раствор нингидрина (0,025%). После элюирования обнаруженных пятен в элюате остается непрореагировавшая с нингидрином (из-за его недостаточной концентрации) пептидная фракция. Эту часть продукта можно использовать для дальнейшего анализа, например оп- )еделения состава смеси аминокислот после полного гидролиза или определения аминокислот с концевым азотом в молекуле. [c.125]

Нингидринная реакция применима для количественного определения простых пептидов, пептидов с высоким содержанием лизиновых остатков или длинноцепочечных пептидов после их предварительного быстрого щелочного гидролиза [35]. Для проведения этого гидролиза аликвотные части пептидов в специальных полипропиленовых ампулах упаривают досуха в сушильном шкафу. В каждую ампулу добавляют по 0,15 мл 13,5 и. раствора едкого натра и нагревают ампулы в автоклаве в течение 20 мин нод давлением примерно 1 кг см . После охлаждения щелочь нейтрализуют, добавляя в каждую ампулу по 0,25 мл уксусной кислоты. [c.133]

Вопрос о том, одинаковы или различны аминокислотные последовательности субъединиц, можно выяснить путем определения числа пептидов в ферментативном гидролизате белка. Наиболее широко используемый для этой цели протеолитический фермент — трипсин, гидролизующий только те пептидные связи, которые образованы карбоксильными группами лизина или аргинина. По суммарному содержанию лизина и аргинина в белке можно примерно предсказать число триптических пептидов, которые должны образоваться при полном гидролизе трипсином. Для белка, состоящего из одной полипептидной цепи, число триптических пептидов равно числу остатков лизина и аргинина в молекуле плюс 1. Вдвое меньшее число пептидов образуется из белка, содержащего две субъединицы с одинаковой аминокислотной последовательностью. Пептиды разделяют на бумаге или других подходящих носителях (гл. 5), используя обычно электрофорез в одном направлении и хроматографию в другом с последующим обнаружением пептидов по реакции с нингидрином. Чрезвычайно маловероятно, чтобы два триптических пептида с различной аминокислотной последовательностью обнаружились в виде одного пятна. Более серьезные возможные осложнения обусловлены тем, что значительная часть триптических пептидов оказывается нерастворимой и не проявляется на пептидных картах, как это иногда случается при исследовании крупных белков. Обычно же число обнаруживаемых пептидов довольно близко к ожидаемому. Следовательно, метод пептидных карт в сочетании с определением молекулярной массы достаточен для того, чтобы выяснить, являются ли аминокислотные последовательности субъединиц одинаковыми или различными. [c.172]

Анализ аминокислотного состава включает полный гидролиз исследуемого Б. или пептида и количеств, определение всех аминокислот в гидролизате. Для гидролиза обычно используют 5,7 н. водный р-р НС1, а при анализе содержания триптофана-4 н. метансульфоновую к-ту, содержащую 0,2% ЗЧ2-аминоэтил)индола, или кипячение со щелочью. Количеств, определение аминокислот в гидролизате проводят с помощью аминокислотного анализатора. В большинстве таких приборов смесь аминокислот разделяют на ионообменных колонках, детекцию осуществляют спектрофотометрически по р-ции с нингидрином или флуориметрически с использованием флуоре-скамина или о-фталевого диальдегида. В последнем случае можно анализировать до 0,1-0,05 нмоль аминокислоты. [c.250]

Определение концевых М-аминных групп разработано достаточно детально. Самым простым, хотя и не совершенным, является метод дезаминирования пептида азотистой кислотой, хлористым нитрознлом, или же окисления бромноватистой кислотой или нингидрином. В результате аминогруппа заменяется гидроксильной или карбонильной и после гидролиза пептида и разделения аминокислот на хроматограмме одна аминокислота исчезает. [c.510]

Эта интересная реакция, фактически представляющая собой процесс, обратный синтезу Штреккера, была подвергнута весьма тщательному исследованию Ван-Сляйком и его сотрудниками [194], которые нашли, что выделение ССЬ при действии нингидрина характерно только для а-аминокислот. В частности, М-ациламино-кислоты (и, следовательно, пептиды) вовсе не образуют СО2 . Таким образом, оказывается возможным определять аминокислоты в присутствии пептидов и белков (N-кар боксильный метод, см. стр. 169). Кроме того, образующийся в результате этой реакции альдегид является характерным для каждой аминокислоты, так как он отличается от последней только тем, что содержит на один атом углерода меньше. Специфическое определение такого альдегида служит средством определения соответствующей аминокислоты. Например, глицин и аланин в белковых гидролизатах могут быть определены по образующимся в результате реакции с нингидрином формальдегиду и уксусному альдегиду. [c.126]

Элюат 2 после колонки разделяется на три потока. Один поток служит для регистрации анализов углеводов (система идентична той, которая показана на рис. 24.5). Второй поток служит для регистрации анализов нормальных пептидов (на рис. 24.6 не показан), а последний поток подвергается гидролизу следующим образом. После смешивания с 13% (вес./об.) раствором едкого натра и тщательного перемешивания азотом он пропускается через змеевик, в котором нагревается до 96 °С, затем охлаждается в змеевике 30, освобождается от пузырьков в отстойнике 26 и возвращается в распределительную магистраль в точке 24. Здесь он нейтрализуется (трубопровод 25), смешивается с раствором нингидрина в метилцеллозольве, вновь тщательно перемешивается азотом и далее подвергается обычной обработке с целью определения аминокислот. Элюаты из коло- [c.148]

Аминокислотный состав П. определяют после их гидролиза (кипячение в 6 и. НС1 в течение 20 ч) до составляющих аминокислот, к-рыс анализируют хромато-графич. методом на сульфокатионитах с автоматич. фотометрироваиием окрагиенных продуктов их взаимодействия с нингидрином. Для определения содержания триптофана применяют щелочной гидролиз пептидов (кипячение в 5 н. NaOH в течение 20 ч), т. к. кислотный гидролиз приводит к разрушению триптофана, а также частично серина и треонина. Глутаминовая к-та при гидролизе подвергается значительной рацемизации. Полиаминокислоты с объемистыми алкильными боковыми группами (валин, изовалин, изолейцин, лейцин) гидролизуются значительно медленнее остальных. Гидролиз П. до аминокислот моишо проводить п при помощи ферментов (трипсин, эрепсин). [c.15]

Также очень неточен метод экстракции окраски пятна от нингидрина ацет-оном [16] и последующего колориметрического определения густоты окраски в колориметре. Действительного внимания заслуживает метод Войвода ( о1 уос1) [17, 18], представляющий собой модификацию метода Попа и Стивенса [19] для определения д-NH2-aзoтa аминокислот и пептидов. Метод оказался пригодным для определения микроколичеств (1—25 у) К 2-азота. [c.405]

В книге достаточно детально рассмотрены основные преимущества и недостатки классического метода определения аминокислотного состава белков с помощью ионообменной хроматографии по Муру и Стейну даны указания относительно выбора ионообменников, подготовки реактивов и численной интерпретации результатов. Значительное место также уделено изложению принципов анализа аминокислот методом газожидкостной хроматографии. Применение этого метода, обладающего на 2—3 порядка большей чувствительностью по сравнению с нингидринной реакцией по Муру и Стейну, позволяет значительно снизить количества белка, требуемые для определения его состава. Анализ аминокислот с помощью газожидкостной хроматографии пока еще не находит широкого применения, однако имеющиеся в ли-Фературе данные позволяют считать этот метод весьма перспективным. Кроме того, обсуждаются возможности использования газожидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектромет-рией для определения состава и аминокислотной последовательности в пептидах. [c.4]

Дженкинсон и Тинслей [19] идентифицировали с помощью хроматографии на бумаге состав аминокислот, гидролизат которых был получен в ходе изучения аминокислот растительного происхождения, выделенных из компоста. Десять мл гидролизата, содержавшего приблизительно 1 мг связанного азота, запаривали досуха при пониженном давлении, растворяли в 5 мл воды и снова упаривали досуха. Остаток растворяли в 1,5 мл воды и центрифугировали. Осветвленную жидкость в количестве 0,04 мл наносили на бумагу Ватман № 1. Разделение проводили элюентом, предложенным Вольфом [20]. Хроматограмму проявляли, окуная лист в 0,2%-ный раствор нингидрина в ацетоне. Были идентифицированы следующие аминокислоты цистеиновая, аспарагиновая, глутаминовая, лизин, аргинин, глицин, гистидин, серии, аланин, тирозин, пролин, валин, треонин, изолейцин, лейцин и фенилаланин. Метионин не поддавался определению, поскольку его трудно было отделить от глицина в описанных системах растворителей. Метио-нин-5-оксид тоже не отделялся от валина. Хроматограммы опускали в 0,1%-ный раствор изатина в ацетоне для обнаружения про-лина и подтверждения отсутствия оксипролина. Детектирование и определение содержания пептида с остатком лизина в середине цепи проводили с помощью 2,4-динитрофторбензола [21]. Эта реакция протекает, поскольку е-аминогруппа, в отличие от а-амино-группы лизина, свободна и может вступать в реакцию. [c.306]

Применение метода газовой хроматографии альдегидов, образующихся из аминокислот при реакции с нингидрином, ограничивается определением нейтральных аминокислот (Хантер, 1956 Златкис, 1960). Метод газожидкостной хроматографии н- и изоамиловых эфиров N-аце-тиламинокислот при сравнительно низких температурах (95—148 °С) был применен при анализе гидролизатов коротких пептидов, элюированных с бумажных хроматограмм (Мейстер, 1961). Этот метод является чрезвычайно перспективным. [c.642]

Высокоэффективным методом разделения является сочетание электрофореза на бумаге с обычной хроматографией. При этом сначала через влажную бумагу, на которую нанесена смесь, пропускают ток высокого напряжения, а затем смесь хроматографируют с помощью подходящего растворителя в направлении, перпендикулярном направлению электрофореза. В результате достигается разделение первоначальной смеси в двух измерениях. Применение такого метода к продуктам ферментативного расщепления белков позволяет получить двухмерную картину, которую называют пептидной картой. Каждый белок дает характерную для него при каждом конкретном способе расщепления картину. Локализацию отдельных компонентов во многих случаях определяют с помощью специфических красителей. При определении аминокислот и пептидов в качестве такого красителя используют, например, нингидрин. Если производится элюция адсорбированных компонентов, то удобнее всего устанавливать их присутствие в элюате спектрофотометрически. Вероятно, наиболее тонким методом разделения белков следует считать иммуноэлектрофорез, при котором эффект достигается за счет использования различий в двух свойствах электрофоретической подвижности и иммунологической специфичности. [c.220]

Среднее содержание а-аминоазота в человеческой плазме — 4,07 мг% с колебаниями от 3,4 до 5,5 мг%- Цифры ниже, чем при определении разложением аминокислот нитритом, так как в последнем случае определяется и аминовый азот из амидов кислот (например, глютамина) и, отчасти, из пептидов и пуринов (но не определяется аминоазот пролина и оксипролина, определимый нингидринным способом). Эритроциты по нингид-риновому способу содержат его приблизительно вдвое больше, чем плазма. [c.149]

Нингидриновая реакция характерна для а-аминогрупп. Растворы белка, а-аминокислот и пептвдов при нагревании с нингидрином дают синее или фиолетовое окрашивание. В этой реакции а-амино-кислоты и пептиды окисляются нингидрином и подвергаются окислительному дезаминированию и декарбоксилированию с образованием аммиака, альдегида и СО2. Нингидрин восстанавливается и связывается со второй молекулой нингидрина посредством молекулы аммиака, образуя продукты конденсации, окрашенные в синий цвет (комплекс Руэмана). Нингидриновая реакция используется для количественного определения а-аминокислот в аминокислотных анализаторах. [c.25]

С нингидрином реагируют не только а-, но и р- и у-аминокислоты, а также аминосахара, пептиды, белки, амины, аммиак, мочевина, креатин и другие ампносоединення. Кроме того, разные аминокислоты дают окрашивание различной интенсивности. Поэтому колориметрический нин-гидринный метод применим для количественного определения только индивидуальных аминокислот и не пригоден для суммарного определения смеси аминокислот, а также в случае сложных биологических смесей, где могут присутствовать аммиак и другие аминосоединештя. В помет,епии, где проводится определение, не должно быть следов аммиака. [c.44]

Аминокислоты взаимодействуют с нингидрином (гидратом трикетогидрин-дена) с образованием СОг, аммиака и альдегида, содержащего на один атом углерода меньше, чем соответствующая аминокислота. В результате реакции возникает голубое или фиолетовое окрашивание, что позволяет осуществить колориметрическое количественное определение аминокислот. Однако эта цветная реакция ие является специфической для аминокислот, поскольку окрашенный продукт с нингидрином дает и NH3, и многие другие соединения, содержащие аминогруппу (в том числе пептиды и белки), с тем лишь отличием, что при этом ие выделяется СО2. Поэтому образование СО2 при реакции с нингидрином — характерный признак присутствия свободной карбоксильной группы, расположенной рядом с аминогруппой, т. е. специфично для а-аминокарбоно-вых кислот. Пролин и оксипролии при реакции с нингидрином образуют производное, окрашенное в желтый цвет. [c.118]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология