Белки определение аминокислотного

Изучение химического строения белка начинают с определения аминокислотного состава. Для этого проводят полный кислотный гидролиз белка с последующим разделением и идентификацией аминокислот гидролизата. С развитием методов хроматографии эта задача ре-щается достаточно просто. [c.376]

Об использовании экзопептидаз, таких как аминопептидаза и карбоксипептидаза, для определения аминокислотной последовательности вблизи N- и С-концов белков говорилось в разд. 23.3.4. Эндопептидазы являются протеолитическими ферментами, которые избирательно расщепляют пептидные связи в точках, удален ных от концов белковой молекулы. Эндопептидазы сильно различаются по своей специфичности. Обычно сами аминокислотные остатки с любой стороны расщепляющейся пептидной связи являются наиболее важными детерминантами специфичности протеолитических ферментов. Так, трипсин разрывает пептидные связи, в образовании которых участвует карбонильная группа остатков Arg или Lys схемы (25), (26) . [c.274]

Главное различие между цепями белка и полиэтилена или полиэтилен-терефталата (дакрона) заключается в том, что в молекуле белка не все боковые группы одинаковы. У фибриллярных белков определенная повторяющаяся последовательность боковых групп придает конкретному белку-кератину или коллагену-вполне конкретные механические свойства. Глобулярные белки имеют еще более сложное строение. Эти молекулы обычно содержат от 100 до 500 аминокисло г, полимеризованных в одну длинную цепь, и полная последовательность аминокислотных остатков в каждой молекуле одного глобулярного белка одинакова. Эти остатки могут быть углеводородными, кислыми, основными, нейтральными или полярными. Свертывание белковой цепи в компактную глобулярную моле- [c.313]

Рис. 9.15. Пары БУ—А и БУ—Г. тем, что мы не знаем, какой вырожденный кодон находится в данном месте ДНК. Однако определение аминокислотного состава ряда ревертантов амбер-мутантов (т. е. результатов мутаций, приводящих к бессмысленному кодону УАГ) в белке головки фага Т 4 показало, что замены пар оснований в различных локусах цистрона происходят с разными вероятностями [143]. Мутации ЦАА-)-УАА в локусе г II фага Т4 индуцируются ЫНгОН с частотами, меняющимися в 20 раз в зависимости от локуса ДНК [144]. Сходные факты обнаружены при ультрафиолетовой реверсии этих мутаций [145]. Все приведенные выше факты могут объясняться и тем, что вероятности мутаций внутри цистрона зависят от направления репликации гена, близости контрольных, регулирующих элементов и т. д. Однако Кох получил прямые доказательства влияния соседних пар оснований на мутагенез [146].

Образование продуктов, обладающих флуоресценцией (сами реагенты не флуоресцируют), позволило значительно увеличить чувствительность метода. С флуорескамином открывается 10 —10 " молей аминокислот. В отличие от нингидрина реакции не мешает присутствие аммиака. Реакция протекает при комнатной температуре при pH 7,0— 9,0. Поскольку флуорескамин в водной среде разрушается (в течение нескольких секунд), для приготовления раствора используют безводные жидкости (ацетон, ацетонитрил, диметилсульфоксид и др.). Продукт реакции стабилен в течение нескольких часов. Пептиды и белки, проявленные флуорескамином, могут использоваться для определения аминокислотного состава и аминокислотной последовательности. [c.130]

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА БЕЛКА [c.525]

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА БЕЛКОВ [c.477]

Исследование аминокислотного состава белков. Определение аминокислотного состава белков обычными химическими методами, их разделение в виде солей, сложных эфиров и других соединений—одна из самых трудоемких и сложных работ. Применение хроматографического анализа позволяет значительно облегчить и упростить определение аминокислотного состава белков. [c.41]

Методы определения аминокислотной последовательности полипептидных цепей хорошо отработаны. На многих стадиях исследования применяются автоматизированные процедуры анализа, особенно при проведении поэтапного отщепления концевых аминокислотных остатков, начиная с Ы-конца. В благоприятных случаях можно определить последовательность 60 и большего числа остатков почти без вмешательства исследователя. Таким образом, для многих небольших белков определение аминокислотной последовательности является теперь едва ли не рутинной операцией. Для крупных белков или белков, обладающих плохой растворимостью, эта задача более сложна. Однако, как правило, если необходимо знать последовательность белка и есть готовность выполнить требующуюся работу, окончательный успех почти гарантирован. Относительная простота определения последовательности остатков сразу же вызывает два вопроса какую информацию можно непосредственно извлечь из последовательности и как эти данные могут пригодиться при проведении других экспериментальных исследований [c.65]

IV, ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ [c.122]

Б. X, сформировалась как самостоятельная область во 2-й пол. 20 а на стыке биохимии и орг, химии, на основе традиционной химии прир. соединений. Ее развитие связано с именами Л. Полинга (открытие а-спирали как одного из главньп элементов пространста структуры полипептидной цепи в белках), А. Тодда (выяснение хим. строения нуклеотидов и первый синтез динуклеотида), Ф. Сенгера (разработка метода определения аминокислотной последовательности в белках и расшифровка с его помощью структуры инсулина), Дю Виньо (хим. синтез биологически активного гормона окситоцина), Д, Бартона и В. Прелога (конформационный анализ), Р. Вудворда (полный хим. синтез мн. сложных прир. соединений, в т.ч. резерпина, хлорофилла, витамина В] ) и др. крупных ученых. [c.288]

При исследовании первичной структуры белка, а также для идентификации в них определенных аминокислотных остатков белковую Молекулу сначала расщепляют по ограниченному числу мест на более мелкие фрагменты. [c.139]

Литература к разделу Определение аминокислотного состава белков и пептидов . [c.195]

Только благодаря появившимся в начале 40-х годов новым методам, вопрос об определении аминокислотного состава получил свое полное и окончательное разрешение. В настоящее время основными способами такого определения являются следующие 1) распределительная хроматография 2) ионофорез 3) электрохроматография 4) ионообменная хроматография и 5) противоточное распределение. Последним методом пользуются главным образом при разделении пептидов. Метод распределительной хроматографии на бумаге, разработанный в 1941 г. Гордоном, Мартином и Синджем, положил начало новой эры в развитии химии белка. [c.479]

Благодаря этим новым методам, разработанным очень детально, определение аминокислотного состава белка не является уже трудноразрешимой проблемой. [c.482]

В период между 1925 — 1930 гг. Сведберг с помощью ультрацентрифугирования произвел определение молекулярных масс различных белков. Одновременно применение других аналитических методов, как, например, электрофореза и различных видов хроматографии, привело к развитию аналитической белковой химии. В 1951 — 1956 гг. Сенгер [20, 21] установил аминокислотную последовательность инсулина. Использованные при этом методы легли в основу систематического определения первичной структуры многих белков. Созданный Эдманом в 1966 г. секвенатор и применение масс-спектрометрии в сочетании с ЭВМ как средством регистрации, обработки и оценки масс-спектрометрических данных привели к тому, что к настоящему времени опубликовано более 15 ООО работ, посвященных определению аминокислотных последовательностей, и установлены первичные структуры более чем для 1000 белков. [c.343]

Необратимые флуктуации и механизм самоорганизации белка. Предполагают, что в начальный период все флуктуации - периодические вращения атомных групп вокруг ординарных связей - являются беспорядочными и несинхронизированными друг с другом. В равновесных системах все флуктуации обратимы и согласно основной теории вероятности (так называемого закона больших чисел) составляют пренебрежимо малые поправки к средним значениям. За редким исключением (например, рассеяние света гомогенной средой и броуновское движение, вызываемые обратимыми флуктуациями плотности) они не коррелируют со свойствами системы и не оказывают влияние на ее переход в равновесное состояние В неравновесных системах среди множества обратимых, неустойчивых флуктуаций возникают необратимые флуктуации, оказывающие радикальное воздействие на эволюцию системы. Они не остаются малыми поправками к средним значениям, а существенно меняют сами эти значения, стирая различие между случайным отклонением и макроскопическим проявлением системы. При свертывании белка подавляющее большинство флуктуаций также обратимо и неустойчиво. Но некоторые из них приводят к сближению определенных аминокислотных остатков, и тогда те могут эффективно взаимодействовать между собой. По своим последствиям образующиеся контакты между валентно-несвязанными атомами могут быть подразделены на близко-, средне- и дальнодействующие. Флуктуации, приводящие к образованию первого вида, изменяют взаимное расположение атомных групп в пределах одного аминокислотного остатка второго вида - расположение остатка относительно соседних в последовательности третьего - относительно удаленных по цепи остатков. В зависимости от конформационного состояния белковой цепи по ходу ее сборки одни и те же флуктуации могут быть как обратимыми, так и необратимыми. Последними, т.е. бифуркационными, флуктуации становятся только в том случае, если каждая из них возникает в строго определенном месте последовательности бифуркаций между флуктуирующим клубком и трехмерной структурой. Обратимые флуктуации бесследно исчезают, а необратимые, стабилизированные специфическими невалентными взаимодействиями остатков, остаются в виде гигантских "застывших флуктуаций". [c.96]

Хроматографический анализ органических веществ развивался попутно с хроматографией неорганических веществ. В 1935— 1936 гг. появились первые сообщения об успешном применении метода Цвета в анализе синтетических красителей. Из жидкофазных вариантов хроматографии наиболее широкое применение в органической и биологической химии получила бумажная хроматография. Это тонкий микрометод, позволяющий разделять смеси нескольких десятков компонентов на полоске пористой бумаги, которая выполняет роль хроматографической колонки. Хроматограмма получается в виде пятен, окраска которых соответствует природной окраске разделяемых компонентов смеси. При анализе бесцветных веществ пятна проявляют, опрыскивая бумагу реактивом, образующим с разделяемыми компонентами окрашенные соединения. Например, при определении аминокислотного состава белков после их гидролиза бумагу опрыскивают раствором нин-гидрина, в результате чего на поверхности бумаги появляются пятна розового цвета, соответствующие индивидуальным аминокислотам (см. рис. 1.2). Если разделяемые бесцветные вещества обладают способностью к флуоресценции, бумагу облучают ультрафиолетовыми лучами (кварцевой или ртутной лампой) и тогда хроматограмма становится видимой. Этот случай можно наблюдать при разделении смеси антрахинонов, пятна которых в ультра- [c.9]

Определение нуклеотидной последовательности ДНК может стать мощным методом определения аминокислотной последовательности белков. Генетический код является вырожденным в том смысле, что большая часть аминокислот описывается более чем одним кодоном. Поэтому нельзя установить нуклеотидную последовательность по коллинеарной аминокислотной последовательности. Однако удается извлечь информацию о неизвестной аминокислотной последовательности белка, анализируя исходную нуклеотидную последовательность. Реализация этого косвенного метода наталкивается на серьезное препятствие экспериментальные ошибки, отвечающие делециям н вставкам отдельных нуклеотидов в полинуклеотидной последовательности, настолько нарушают порядок нуклеотидных триплетов, что правильное определение аминокислот оказывается пока не возможным. [c.18]

Если бы Л1Ы знали, какой вклад в трехмерную конфигурацию всей белковой молекулы вносит каждая аминокислота, взятая в данном окружении соседей, то, определив аминокислотную последовательность, мы могли бы изобразить третичную структуру этого белка. Определение аминокислотной последовательности сейчас является стандартной работой в биохимических лабораториях, однако третичные структуры можно определить пока лишь с помощью трудоемкого и длительного метода дифракции рентгеновских лучей. За исключением влияния пролина, разрушающего спирали, вклады отдельных аминокислот в структуру белка еще не выяснены. Имеются некоторые, хотя и скромные, успехи в предсказании третичных структур белков путем вычисления сум ,1ы минимальных энергий попарных атомных взаимодействий вдоль пептидной цепи, но от этого метода, по-впдимому, люжпо ожидать гораздо большего. [c.402]

Поскольку в качестве одного из основных путей использования дрожжевой биомассы планируется получение аминокислот, было проведено определение аминокислотного состава белка выращенных дрожжей. Сравнение данного состава с таковым для паприна (используемого в качестве кормовой добавки биомассы углеводородокисляющих дрожжей) [2] указывает на высокую кормовую ценность полученного продукта (табл. 4). Биомасса .tropi alis богата незаменимыми аминокислотами, в частности, содержание такой ценной аминокислоты, как лизин превышает 7 г/100 г белка, тогда как в паприне его содержится 4,5 г/ 100 г белка, а в рыбной муке до 6 г /100 г белка. [c.211]

Определение пространственной структуры белков по аминокислотным последовательностям - одна из центральных задач молекулярной биофизики. Традиционные подходы, применяемые к расчету структуры небольших органических молекул, неэффективны для решения этой задачи в связи со следущими ососбенностями а) огромным числом переме1пшх, описывающих атомную структуру бел- [c.111]

ГЕН (от греч. genos-род, происхождение), участок молекулы ДНК (в нек-рых случаях РНК), в к-ром закодирована информация о биосинтезе одной полипептидной цепи с определенной аминокислотной последовательностью. Г.-единица наследств, материала, обеспечивающая форкт-рование к.-л. признака организма и его передачу в ряду поколений. Контролируют все клеточные процессы на молекулярном уровне, обеспечивая биосинтез белков, в первую очередь ферментов. Если белок состоит из более чем одной полипептидной цепи, синтез каждой из них контролируется самостоятельным Г. [c.517]

Значительным успехам в понимании детального строения антител способствовал тот факт, что у больных с опухолями лимфатической системы (например, при опухоли костного мозга — множественной миеломе) была обнаружена секреция огромных количеств гомогенных иммуноглобулинов или их фрагментов. В скором времени подобные опухоли были найдены у мышей, которые стали источником экспериментального материала. Оказалось, что белки Бенс-Джонса, секретируемые в мочу у больных миеломой, представляют собой легкие цеп имлгуноглобулннов. Определение аминокислотной последовательности показало, чго у каждого больного белок Бенс-Джонса гомогенен, однако не было обнаружено даже двух больных, секретирующих один л тот же белок. Позже были получены также интактные гомогенные миеломные глобулины и макроглобулины (IgM). [c.382]

Единственная установленная функция витамина К — это его связь со свертыванием крови. Как удалось проследить, недостаточность витамина К приводит к понижению содержания протромбина (рис. 6-16), некоторых факторов свертывания крови (факторов VII, IX и X) н одного плазматического белка, функция которого пока еще не установлена. В 1972 г. было обнаружено, что дефектный протромбин, образующийся в печени в отсутствие витамина К, не способен связывать ионы кальция, необходимые для последующего связывания протромбина с фосфолипидами и активации его в тромбин. Основываясь на этих сведениях, удалось локализовать структурные различия между нормальным и дефектным белком в М-концевом участке этого гликопротеида, содержащего 560 остатков . Из триптических гидролизатов нормального и дефектного протромбина были выделены пептиды, различающиеся по электрофоретической подвижности. Тщательный химический анализ в сочетании с изучением ЯМР-спектров показал, что в нормальном протромбине остатки в положениях 7, 8, 15, 17,20, 21, 26, 27, 30 и 33, которые при определении аминокислотной последовательности были все идентифнцнро-ваны как глутаминовая кислота, в действительности являются остатками карбокснглутамата. [c.389]

Для качественного определения белков известны различные, не всегда специфичные, классические цветные реакции, основанные часто иа присутствии определенных аминокислотных остатков (табл. 3-5). С этой целью можно использовать также денатурацию при осаждении белков путем добавления трнхлоруксусной, пикриновой, хлорной илн фосфорновольфрамовой кислот, солей тяжелых металлов (Си, РЬ, 2п, Ре н др.) и путем нагревания в изоэлектрической точке. [c.355]

Установление первичной структуры начинается с определения аминокислотного состава и молекулярной массы выделенного и очищенного белка. Белки, состоящие из нескольких полнпептидных цепей, разделяются с помощью денатурирующих реагентов (концентрированный раствор мочевины или ДСН) на мономеры. Дисульфидные мостики расщепляют восстановлением меркаптоэтанолом. Для предотвращения дисульфидного обмена и окисления образующихся свободных меркаптогрупп их блокируют каким-либо методом, например алкилированием иодуксусной кислотой с образованием 8-карбоксиметильного производного или цианэтилированием акрилонитрилом. После определения Ы- и С-концевых аминокислот полипептидная цепь расщепляется химически или ферментативно (в нескольких вариантах) на меньшие перекрывающиеся фрагменты. Для каждого фрагмента устанавливается аминокислотная последовательность. И наконец, комбинируя отдельные последователькости, приходят к полной последовательности исходной полипептидной цепи. [c.364]

Результаты определения аминокислотного состава большинства белков указывают на наличие такого количества цистина, которого вполне достаточно для образования дисульфидных мостиков между известным числом открытых полипептидных цепей. Однако гемоглобин лошади, имеющий шесть N-кoнцeвыx валииовых остатков [160, 245], не содержит [c.175]

Определение последовательности аминокислотных остатков в пептидах (Ледерер М. М. Шемякин и Н. С. Вульфсон). Благодаря широкому применению автоматических аминокислотных анализаторов определение аминокислотного состава пептидов не представляет в настоящее время значительных трудностей. Однако один из важнейших вопросов установления первичной структуры белков и пептидов — определение последовательности аминокислотных остатков в цепи продолжает оставаться весьма трудоемким и сложным. Недавно было установлено, что при масс-спектрометрировании эфиров Н-ацилированных олигопептидов в качестве первого акта фрагментации молекулярного иона происходит элиминация алкоксильной грушты и возникает линейный ион, у которого положительный заряд локализован на С-конце, а N кoнeд защищен ацильным остатком. Дальнейший распад этого иона заключается в последовательной элиминации аминокислотных остатков с перемещением положительного заряда вдоль цепи. Например, фрагментация [c.591]

Аналогичным путем было проведено исследование Са -связывающих белков Аргосом [3881, который показал, что предсказания могут способствовать определению аминокислотной последовательности, особенно в сомнительных случаях. Кроме того, с помощью предсказаний он попытался определить положение Са- -связываю-щих центров в ацилпереносящем белке синтетазы жирных кислот Е.соИ. а также в белках кровесвертывающего каскада. [c.155]

Многие из указанных выше эффектов можно прекрасно проиллюстрировать на примере механизмов связывания и катализа, осуществляемых ферментом лизоцимом. Лизоцим занимает особое место в истории энзимологии, поскольку его трехмерная структура была первой нз структур белков, определенных методом рентгеноструктурного анализа [134]. Это маленький белок, состоящий из одной полипептидной цепи длиной в 129 аминокислотных остатков, катализирует гидролиз гликозидных связей углеводного компонента клеточной стенки бактерий (как часть защитного механизма против бактериальной инфекции). Природным субстратом лизоцима является чередующийся сополимер (86) Л -ацетил-[5-0-мурамовой кислоты (NAM) и Л -ацетил-р-й-глюкоз-амина (NAG), связанных [i-1-> 4-гликозидными связями, однако большая часть работ по изучению механизма была проведена на более простых субстратах. Так, поли-Л -ацетилглюкозамин также гидролизуется ферментом, однако эффективность этой реакции существенно зависит от размера субстрата и трисахарид (NAG)3 фактически является ингибитором лизоцима. Сравнение трехмерных структур фермента и комплекса последнего с (NAG)a показывает, что трисахарид связывается во впадине фермента. Такое сравнение позволяет детально исследовать связывание трех моно-сахаридных звеньев (NAG)a в участках А, В и С фермента, которое осуществляется посредством комбинации гидрофобных рччимодействий и водородных связей. Как отмечалось при об- [c.528]

Все изученные к настоящему времени опсины, которые были выделены из сетчатки многих видов животных, представляют собой небольшие белки с мол. массой 30 ООО—40 000. Для опсинов, выделенных из палочек некоторых видов животных, был определен аминокислотный состав (но не последовательность аминокислот). Углеводная часть комплекса, состоящая из одного (или нескольких) остатка глюкозамина и маннозы, прочно связана с аспарагиновым остатком молекулы белка. С белком ассоциировано также значительное количество липидов, главным образом фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин. Вопрос о том, связаны ли эти фосфолипиды со зрительным пигментом, составляя часть его молекулы, или они просто являются загрязнениями, попавшими из липидной области рецепторной мембраны, остается открытым. [c.306]

Идентификация гена в отсутствие гетерологичного зонда или какой-либо информации об этом гене — задача не из легких. В таких случаях часто приходится разрабатывать принципиально новую схему отбора. В ее основе может лежать иммунологическая идентификация искомого белка, определение его активности, ДНК-гибридиза-ция с олигонуклеотидным зондом, нуклеотидная последовательность которого была определена исходя из данных о частично секвениро-ванной аминокислотной последовательности очищенного искомого белка, или комплементация мутантов. Очень часто после идентификации гена, кодирующего определенную функцию, можно выделить аналогичные гены из других организмов, используя первый вьщеленный ген в качестве гетерологичного зонда для ДНК-гибридизации. Результативность данного подхода зависит от близости нуклеотидных последовательностей зонда и искомого гена. Эта стратегия оправдывает себя в случае консервативных в эволюционном плане генов, например генов, кодирующих белки, которые участвуют в фиксации азота, но в больщинстве случаев она малопригодна. [c.319]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология