Молекулярная масса, определение методом электрофореза на ДСН-геле

Рис. 4-49. ДСН-электрофорез в полиакриламидном геле. Индивидуальные белки образуют комплекс с молекулами додецилсульфата натрия, несущими отрицательный заряд, и мигрируют через пористый гель полиакриламида в виде отрицательно заряженного комплекса ДСН-белок. Поскольку скорость передвижения в этих условиях тем выще. чем меньще размеры полипептида, этот метод может быть использован для определения приблизительной молекулярной массы полипептидной цепи, а также для изучения субъединичного

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ БЕЛКОВ МЕТОДОМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ В ПРИСУТСТВИИ ДОДЕЦИЛСУЛЬФАТА [c.344]

Рис. 12.30. Графическое определение молекулярной массы белков методом электрофореза в полиакриламидном геле в среде додецилсульфата (по данным Вебера с сотр. [105]).

Определение молекулярной массы белков методом ультрацентрифугирования требует много времени и сложной и дорогостоящей аппаратуры. Поэтому в последние годы разработаны два более простых метода (гель-хроматография и электрофорез). При использовании гель-хроматографии в первую очередь требуется откалибровать колонку. Для этого через колонку с сефадексом пропускают несколько белков с известными молекулярными массами и строят график, откладывая значения логарифмов молекулярной массы против их элюционных объемов, которые находят, как показано на рис. 1.9. [c.45]

Для электрофоретического разделения различных полинуклеотидов используют эффект молекулярного сита, присущий целому ряду гелей. Детальные исследования показали, что посредством электрофореза в гелях можно получить данные о некоторых характеристиках молекул нуклеиновых кислот. Так, например, методом электрофореза можно определить молекулярную массу того или иного полинуклеотида и установить, является ли он рибо- или дезоксирибонуклеотидом. Кроме того, можно выяснить, состоит ли данная молекула из одной или двух полинуклеотидных цепей, а в случае ДНК определить, какую форму имеет молекула — линейную или кольцевую. Несмотря на существование более точных физических и химических методов определения указанных свойств, электрофорез в некоторых отношениях имеет преимущество перед ними. Оно состоит в том, что электрофоретические методы относительно просты, требуют сравнительно недорогого оборудования и могут быть использованы в тех случаях, когда для анализа доступно лишь небольшое количество неочищенного материала. Некоторые физические параметры разделенных нуклеиновых кислот изучают, не прибегая к их элюции из гелей. Например, Роз-нер и др. [1115] исследовали тепловую денатурацию нуклеиновых кислот, разделенных путем электрофореза в гелях. Фраг- [c.368]

При разделении нуклеиновых кислот используют те же методы, что и при фракционировании белков, однако имеются ограничения, обусловленные большим диапазоном величин молекулярной массы (2-10 —Ы0 ° Да), отклонениями от глобулярной формы, различиями в четвертичной структуре (двухнитевые, однонитевые, кольцевые), значительным отрицательным зарядом в нейтральной области pH. Поэтому методы гель-фильтрации и ионообменной хроматографии не получили широкого распространения при фракционировании нуклеиновых кислот и значительно уступают ультрацентрифугированию и электрофоретическому разделению в геле агарозы, полиакриламидном геле или их смеси. Поскольку величина отрицательного заряда нуклеиновых кислот и продуктов их расщепления мало зависит от pH, а отношение заряда к молекулярной массе сохраняется практически неизменным, разделение нуклеиновых кислот при электрофорезе определяется не их зарядом, а размером молекул. При наличии маркеров с известной молекулярной массой возможно определение молекулярной массы препаратов нуклеиновых кислот и их фрагментов. [c.171]

Электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) позволяет снизить до минимума влияние зарядов белков на их подвижность, которая в этих условиях зависит только от размеров молекул. Под действием ДСН третичная и вторичная структуры белков разрушаются. Для определения молекулярной массы очищенных белков, а также мембран, рибосом и т. д. широко используется метод Вебера и Осборна [80]. ДСН высвобождает и солюбилизирует компоненты этих структур, которые невозможно растворить никаким иным способом. В этом методе используется только одна концентрация геля, и график зависимости относительной подвижности (отношение расстояния, пройденного фронтом красителя, к расстоянию, пройденному зоной белка) от логарифма молекулярной массы имеет линейный харак- [c.272]

Аминокислотный состав и последовательность аминокислот выяснены для многих тысяч белков. В связи с этим стало возможным вычисление их молекулярной массы химическим путем с высокой точностью. Однако для огромного количества встречающихся в природе белков химическое строение не выяснено, поэтому основными методами определения молекулярной массы все еще остаются физико-химические методы (гравиметрические, осмометрические, вискозиметрические, электрофоретические, оптические и др.). На практике наиболее часто используются методы седиментационного анализа, гель-хроматография и гель-электрофорез. Определение молекулярной массы белков методами седиментационного анализа проводят в ультрацентрифугах , в которых удается создать центробежные ускорения [c.44]

Большое значение при доказательстве и определении молекулярной массы субъединиц имеют ультрацентрифугирование, ДСН-электрофорез в полиакриламиде, гель-фильтрация и другие уже рассмотренные ранее методы (разд. 3.5.4). В этой связи надо упомянуть, что в условиях диссоциации не только регуляторные, но и каталитические функции ферментов сильно повреждаются или совершенно теряются. [c.388]

При использовании диск-электрофореза в полиакриламидном геле для определения молекулярной массы белков также строят график зависимости между логарифмом молекулярной массы калибровочных белков и подвижностью белковых частиц в полиакриламидном геле, а затем, определив подвижность исследуемого белка, по графику находят его массу (рис. 1.11). Электрофорез проводят в присутствии детергента додецилсульфата натрия, так как только в этом случае наблюдается прямая пропорциональная зависимость между молекулярной массой и подвижностью белков. Белки с четвертичной структурой при этих условиях распадаются на субъединицы, поэтому метод находит широкое применение для определения молекулярной массы субъединиц белка. [c.46]

Абсолютный размер молекул ДНК генома накладывает определенные ограничения на хроматографические и электрофоретические методы, которые могут быть использованы для разделения этих соединений. Даже вирусные ДНК во много раз длиннее встречающихся в природе РНК. Хромосомы большинства бактерий состоят из единственной молекулы ДНК с молекулярной массой около 3-10 (10 пар оснований), а молекулярная масса содержащейся в клетках животных ядерной ДНК еще на три порядка больше (молекула состоит из 10 пар оснований). В силу очень высокого отрицательного заряда и значительных по величине неионных взаимодействий высокомолекулярных ДНК с сорбентом разделение этих соединений с помощью анионообменной хроматографии практически невозможно. В случае гель-электрофореза также приходится сталкивать- [c.183]

Для определения молекулярной массы неизвестных плазмид с помощью электрофореза в агарозном геле в качестве стандартов используют плазмиды, молекулярная масса которых известна (табл. 15.1). Чтобы выявить плазмиды с большой молекулярной массой, клетки лизируют по методу, описанному в разд. 15.2. Для удоб- [c.141]

Тотальную ДНК из клеток человека гидролизуют эндонуклеазой примерно на 500000 фрагментов длиной от 10 до 10 нуклеотидных пар. Затем фрагменты разделяют по молекулярной массе с помощью гель-электрофореза в агарозе, после чего ДНК денатурируют щелочью прямо в геле, чтобы получить одноцепочечные фрагменты. Их переносят на нитроцеллюлозный фильтр и фиксируют высушиванием при 80°С. В результате получается отпечаток (реплика) картины разделения фрагментов ДНК по их размеру. Эти фрагменты можно идентифицировать методом гибридизации с радиоактивными ДНК-зондами, специфичными для определенных генов или хромосом. Любой фрагмент, содержащий всю последовательность зондируемого гена или его часть, будет выглядеть на радиоавтографе в виде темной полосы (рис. 4.60). [c.126]

С другой стороны, в результате денатурации белки часто приобретают свойства, значительно улучшающие их электрофоретическое разделение. Этот факт используется в тех методах электрофореза, в которых проводят предварительное восстановление белков и комплексирование их с ДСН. Электрофоретическая миграция таких комплексов зависит от эффекта молекулярного сита, свойственного полиакриламидному гелю, и размеров молекул, что создает основу для весьма простого и эффективного метода определения молекулярной массы белков (подробное описание метода см. в гл. И.2). [c.215]

Пул и др. [1019] применяли для определения молекулярной массы полипептидов 10%-ный полиакриламидный гель, содержащий 8 М мочевину и 0,9 М уксусную кислоту. Точность определения составляла 15%. Хотя этот метод менее чувствителен, чем описанный ниже электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии ДСН, он позволяет определять молекулярные массы, лежащие ниже 15000, а в сочетании с электрофорезом в полиакриламидном геле, содержащем ДСН, дает возможность разделять полипептидные цепи, имеющие одинаковые размеры, но разные заряды. [c.219]

Настоящий метод дает превосходное разрешение, если первый этап электрофореза проводят в относительно разбавленных гелях при pH, подходящем для всех белков, присутствующих в смеси. Он не только обладает очень хорошей разрешающей способностью, но и позволяет определять молекулярные массы разделяемых компонентов, поскольку подвижность белков при миграции в гелях, содержащих ДСН, зависит лишь от размеров их молекул. Методы такого рода широко используют для разделения природных смесей белков (примеры приведены в главах, посвященных разделению определенных групп белков). [c.231]

Коэффициент удерживания Кя для исследуемого белка и бел-ков-маркеров определяется по наклону графика в координатах — общая концентрация акриламида Г, а молекулярную массу исследуемого белка находят по графику KR — молекулярная масса белков-маркеров. Для надежного определения KR электрофорез следует проводить по крайней мере в четырех гелях различной концентрации (7, 8 9 и 10%), но предпочтительнее в семи гелях. Результаты экспериментов обрабатывают методами статистического анализа [148]. [c.32]

Известно несколько способов нахождения количества молекул гаптена, пришитых к носителю. Самый простой спектрофотометрический способ заключается в регистрации изменения поглощения раствора конъюгата при определенной длине волны по сравнению с исходным белком-носителем. Можно также рассчитать соотношение компонентов конъюгата из данных по молекулярной массе, полученных электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия или по аминокислотному гидролизу конъюгата. Если конъюгат получили путем пришивки гаптена к аминогруппам белка-носителя, то его состав можно определить по титрованию свободных аминогрупп в исходном белке и конъюгате. Наиболее точный расчет состава конъюгата получается с помощью радиоизотопного метода, в котором используют меченный радиоактивным изотопом гаптен. [c.177]

Количество различных типов нуклеиновых кислот в вирусном препарате и их молекулярные массы можно установить с помощью гель-электрофореза, который используют и для определения типа и структуры нуклеиновой кислоты (см. разд. 4.2.2). Детальное описание методов гель-электрофореза нуклеиновых кислот имеется в руководстве [И]. Ниже приведены описания некоторых методов, не вошедших в эту книгу. [c.39]

Электрофорез — метод, в основе которого лежат различия в скорости движения белков в электрическом поле. Эта величина пропорциональна заряду белков. Электрофорез белков проводят на бумаге (где скорость движения белков пропорциональна только их заряду) или в полиакриламидном геле, имеющем определенную величину пор (скорость движения белков пропорциональна их заряду и молекулярной массе). [c.30]

Разделение заряженных соединений с помощью электрофореза можно проводить не только в растворе, но и в различных пористых инертных средах, таких, как крахмал, силикагель, полиакриламидный гель, смоченная фильтровальная бумага. Раствор смеси веществ обычно наносят в виде четкого пятна или зоны, а затем проводят электрофорез, добиваясь иногда полного разделения всех компонентов смеси. Этот процесс, называемый зонным электрофорезом, применяют как для аналитических, так и для препаративных целей. Электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия широко используют для определения молекулярных масс полипептидов (разд. 5.1.7) метод иммуноэлектрофореза рассмотрен в гл. 30. [c.163]

Типичная полулогарифмическая зависимость М от значения подвижности для определения молекулярной массы методом электрофореза в ДСН-полиакрил-а МИД ном геле. [c.232]

Рис, 79. Калибровочные кривые для определения молекулярных масс белков методом электрофореза в Ю7о-ном (/) и 12,5%-ном (//) полиакриламидном геле, содержащем ДСН [414]. Полимер РНКазы был получен при помощи диэтилпирокарбоната по методу Вольфа и др. [1441]. [c.223]

Помимо указанных методов для разделения гистонов и определения их молекулярной массы широко применяют электрофорез в полиакриламидном геле, содержащем ДСН. Следует,, однако, иметь в виду, что при определении молекулярной массы гистонов методом электрофореза в полиакриламидном геле иногда получают ошибочные результаты, если для построения калибровочной кривой используют белки с усредненным аминокислотным составом. Этой опасности можно избежать, приме> нив в качестве маркеров гистоны с известной молекулярной массой [964]. [c.307]

Определение молекулярной массы проводили методом диск-электрофореза на основании относительной подвижности белков в зависимости от концентрации полиакриламидного геля [Hedri k, Smith, 1968]. Согласно расчетам по таблице, предложенной Г. А. Бузун [1976], масса исследуемых анионных изопероксидаз была одинаковой для вирозных и контрольных изоэнзимов, так как тангенс угла наклона линии регрессии был совершенно одинаков как в опыте, так и в контроле (рис. 20). На рисунке представлена зависимость относительной подвижности анионных изопероксидаз от концентрации акриламида в гелях. Проведенный расчет показывает, что их молекулярная масса равна 45—46 кДа. [c.87]

Источники ошибок. Если молекулярная масса белка составляет менее 10000, ее определение методом электрофореза с ДСН может привести к существенным ошибкам, обусловленным конформацией ДСН-белковых комплексов. По данным Свэнка и Манкруса [1267], эти ошибки можно в значительной степени устранить, повысив отношение акриламид бас-акриламид до 10 1 или добавив в гель -8 М мочевину. [c.222]

К наиболее распространенным физико-химическим методам определения молекулярной массы белков наряду с седиментационными относятся гель-хроматография (на колонках и в тонком слое), а также электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсуль-фата натрия. Использование этих методов не требует сложной аппаратуры и большого количества исследуемого материала. Получаемые результаты хорошо воспроизводятся и, как правило, коррелируют с данными, полученными другими методами. [c.116]

В 1972 г. при электрофорезе глютенинов в полиакриламидном геле в присутствии ДДС-Na после восстановления дисульфидных мостиков удалось определить молекулярные массы составляющих их субъединиц [21]. Таким способом были идентифицированы 15 субъединиц с молекулярными массами от 116 000 до 133 000 Да (табл. 6Б.10). Высокомолекулярные (или агрегированные) глиадины состоят из субъединиц с массой 44 000 и 36 000 Да, причем доля первых больше [24, 167]. Впоследствии эти значения были подтверждены всеми исследованиями, в которых использовался данный метод определения молекулярных масс. Удалось выявить генетическую изменчивость состава субъединиц глютенинов [20, 33, 108, 150[. Способ выделения фракций глютенинов может изменить состав их субъединиц [20, 110[ так же, как это происходит при удалении жиров из муки [169]. [c.201]

Первая стадия опре51 еления строения белка состоит в идентификации и количественном определении составляющих его аминокислот. Для этого требуется образец чистого белка, что само по себе представляет значительную проблему. Чтобы получить чистый образец, обычно применяют комбинацию методов (гл. 3), таких, как гель-электрофорез, ионообменная хроматография и центрифугирование по градиенту плотности (белки с большей молекулярной массой оседают быстрее, чем белки с меньшей молекулярной массой). Когда белок в результате применения этих методов становится однородным или когда достигнут максимум биологической активности, белок считается чистым. Тогда его гидролизуют до составляющих аминокислот горячей соляной кислотой и гидролизат анализируют. [c.267]

Теоретически любые растворимые вещества можно разде--лить с помощью подходящего метода жидкостной хроматографии. Ионообменная хроматография и электрофорез применимы в тех случаях, когда соединения имеют ионный характер или содержат ионогенные группы. Область применения гель-хроматографии ограничена соединениями с относительно высокой молекулярной массой (10 —10 дальтон). Адсорбционная и распределительная хроматография используются для разделения веществ со средней молекулярной массой (10 —10 дальтон),. и поэтому эти методы представляют особый интерес для хими-ков-органиков. Небольшие количества веществ можно разделить с помощью различных методов плоскостной хроматографии. Преимуществом последних является возможность анализа одновременно нескольких образцов, а также низкая стоимость, оборудования. Методы плоскостной хроматографии отличаются очень простым аппаратурным оформлением, однако требуют от экспериментатора определенных навыков. Разработано несколько вариантов препаративной плоскостной хроматографии и количественного анализа хроматограмм, однако они в известной степени несовершенны. Современная колоночная хроматография обладает теми же достоинствами и недостатками, что и газовая хроматография, однако в отличие от последней ее можно рекомендовать не только для анализа, но и для препаративного выделения веществ, особенно если эти вещества недостаточно термостойки, разлагаются на свету или легко окисляются. [c.31]

Методические преимущества электрофореза в полиакриламидном геле навели исследователей на мысль о создании таких его вариантов, которые позволили бы определять молекулярную массу макромолекул и в первую очередь белков, В разд. 1.11.1 пoдpoбiю обсуждался вопрос о том, что при электрофорезе в полиакриламидном геле разделение макромолекул зависит как от их размеров, так и от заряда. Отсюда следует, что для определения молекулярной массы необходимо исключить влияние заряда. Для этой цели разработано множество методов, которые можно разделить на две группы. В методах первой группы для определения молекулярной массы используют коэффициент задержки Д. Зависимость между Кт и молекулярной массой изучена еще недостаточно хорошо, и для ее выражения был предложен целый ряд уравнений [б 12, 1106, 1289, 1296]. Хедрик и Смит [538] построили графики зависимости коэффициентов задержки, определяемых по кривым Фергюсона, от молекулярной массы белков и обнаружили между ними линейную зависимость (рис. 75). Поскольку коэффициент задержки является функцией размера, а не массы молекулы [5, 1186, 1366], некоторые белки ведут себя аномально при электрофорезе, если отличаются от большинства других белков по форме молекулы или парциальному удельному объему. Так, например, полимеры ферритина и альбумина дают соответственно более низкие и более высокие значения Кг, чем можно было бы ожидать, исходя из их молекулярных масс [92, 538]. [c.217]

Все методы, включающие на втором этапе электрофорез в геле с ДСН, дают возможность определять молекулярные массы белков, присутствующих в разделенных зонах. Другой подход к определению молекулярных масс рибосомных белков описали Бикль и его сотрудники [119, 120]. После двухмерного разделения рибосомных белков в системе без ДСН центральную часть каждой зоны вырезают, белки элюируют буферо м, содержащим 6 М мочевину и 1 % ДСН, и подвергают их электрофорезу в геле с ДСН. [c.314]

Молекулярную массу интактного олигомера определяют в неденатурирующих условиях с помощью методов ультрацентрифугирования, гель-фильтрации и электрофореза в градиенте полиакриламидного геля (ПААГ). Устойчивость и растворимость большинства олигомерных белков зависит от ионной силы и pH буферного раствора. В отличие от электрофореза в ПААГ,. где на состав буферных растворов накладываются определенные ограничения, в част1юсти ионная сила не должна превышать 0,1, гель-фильтрацию можно вести в буферных растворах стабилизирующих олигомер (например, в присутствии ионов металлов или кофакторов). Для определения молекулярной массы белков применяют классический вариант гель-фильтрации на сшитых декстранах, полиакриламиде или агарозе. В последнее время получены гели нового типа, позволяющие вести процесс при повышенном давлении, благодаря чему время анализа сокращается с 1—2 сут до 30 мин (гл. 6). [c.17]

Набор стандартных белков разделяют с помощью электрофореза в гелях различной пористости с содержанием поперечных сшивок 5 15%. Выявляют белок, окрашивая его кумасси синим или серебром, и определяют молекулярную массу, сравнивая подвижность белка и стандарта. Особенно широкое применение этот метод нашел при определении молекулярной массы протомера сначала осуществляют денатурацию олигомера (например, кипячением в детергенте в присутствии Р-меркап-тоэтанола), а затем проводят разделение в гелях, содержащих ионный детергент додецилсуль-фат натрия. [c.51]

Для каждого конкретного белка такую зависимость легко получить экспериментально. Удобно, напри ер, в разные карманы одной пластины геля последовательно, через известные промежутки времени, вносить аликвоты раствора исследуемого белка. К моменту прекращения опыта для каждого трека на пластине будет известна продолжительность электрофореза, а расстояние миграции легко измерить. Это можно сделать даже для смеси нескольких белков. Дал е по экспериментальным точкам строят график зависимости у/ от О, имеющий вид прямой линии. Тангенс угла наклона этой прямой —значение коэффициента а в написанном выше уравнении. Ясно, что этот коэффи-цие.нт должен зависеть от молекулярной массы белка чем он крупнее, тем медленнее мигрирует в геле. Оказывается, что соотношение между логарифмами коэффициента а и молекулярной массы белка имеет тоже приблизительно линейный характер в широком интервале молекулярных масс — от 20 до 950 тыс. дальтон. Коэффициенты в этом втором линейном уравнении зависят от выбора буфера. Авторы дают их значения для трех стандартных буферов фосфатного (pH 7,2), Трис-боратно-го (pH 8,2) и Трис-барбитуратного (pH 9,8). Так, для 0,01 М Ыа-фосфатного буфера (pH 7,2) имеет место зависимость lgЛi=l,93 lga- -6,99. Точность определения молекулярной массы невысока — в среднем 20%. Однако важное достоинство метода состоит в возможности оценивать суммарную молекулярную массу белков, состоящих из субъединиц, которые диссоциируют при обработке ДДС-Ыа. Таким образом, комбинируя результаты определения молекулярной массы некоего белка описанным методом с тем, что дает для него же электрофорез с использованием ДДС-Ыа, можно выяснить субъединичное строение белка. [c.76]

Пример 11-3. Измерение изменений величины мутантного фермента. Многие методы, применяемые для определения молекулярных масс ферментов, требуют образцов с высокой степенью очистки (например, метод седиментационного равновесия, который будет описан позже) или при использовании не очень чистых образцов дают массы субъединиц (например, ДСН-гель-электрофорез, гл. 9). Использование зональной седиментации позволяет определить молекулярную массу активного фермента непосредственно в неочищенном лизате при применении в качестве метода контроля анализа ферментативной активности. Например, ДНК-полимераза I Е. oli седиментирует при 5 = 5,4. Зоны полимери-зующей и 5 —З -экзонуклеазной активности, связанные с этим белком, седиментируют вместе, поэтому для локализации фермента в градиенте сахарозы можно использовать любую из них. Мутантная форма фермента не обладает полимеразной активностью, однако сохраняет 5 —З -экзонуклеазную. Как следует из рис. 11-26, мутантный фермент обладает значением s = 2,8. Поскольку данная мутация является терминирующей цепь белка, пониженное значение 5 указывает на то, что данный фермент является лишь небольшим фрагментом белка дикого типа и имеет только 0,4% активности. [c.314]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология