Строение холинэстеразы

С точки зрения механизма действия холинэстераз представляет интерес сопоставление химического строения субстратов и величин констант Михаэлиса. Для этого, разумеется, необходимо вести измерение Кт при одних и тех же условиях. [c.159]

Следует напомнить об известных трудностях идентификации функциональных групп активных центров ферментов по величинам рК, полученным из изучения зависимости скорости реакции от pH. Во-первых, одна и та же группировка в белках разного строения может иметь неодинаковое значение рК из-за влияния соседних групп. Некоторую помощь в этом случае может оказать измерение теплоты диссоциации ионогенных групп, рассчитываемой по измерениям температурной зависимости рК. К сожалению, для холинэстераз эти термодинамические константы достаточно надежно не измерены. Согласно данным Шукудза и Шинода [122], теплоты диссоциации основной группировки ацетилхолинэстеразы эритроцитов и холинэстеразы сыворотки крови человека составляют соответственно 8,5 и 6,5 ккал1моль. Эти величины выше или ниже найденной для диссоциации имидазольной группы гистидина в других белках (6,9—7,5 ккал моль [123]). Если признать, что в обеих холинэсте-разах в качестве основной группировки активного центра выступает имидазол гистидина, то трудно понять столь существенное различие в величинах теплот диссоциации. Во-вторых, даже если измерение активности фермента при разных pH рассматривать в качестве своеобразного титрования функциональных групп активного центра, то полученные результаты нельзя безапелляционно считать отражением прямого участия этих групп в каталитическом акте. Можно представить, что ионы Н и ОН -среды выполняют свою функцию, вызывая не только протонизацию или депротонизацию функциональных групп активного центра, но также и более общую функцию создания и поддержания специфической для каждого фермента третичной структуры. Можно думать, что в создании третичной структуры фермента большую роль играют ионные связи между такими группировками, которые расположены вне активного центра и непосредственно не участвуют в реакции с субстратом. Такие ионогенные группировки при взаимодействии могут сближать друг с другом (или наоборот удалять друг от друга) определенные функциональные группы белка, которые непосредственно участвуют в каталитическом акте. Внешне эта непрямая роль кислотно-основных группировок фермента будет отражаться в форме обычной зависимости кинетических констант (и, V, Кт) от pH, но по существу такая зависимость не дает оснований для решения вопроса, является ли она следствием влияния pH на конформацию белка в районе активного центра или диссоциацию группировки, прямо участвующей в реакции с субстратами. [c.184]

В литературе приведено большое количество экспериментально измеренных величин констант Михаэлиса для различных по химическому строению субстратов и холинэстераз различных тканей. Однако в основном это разрозненные данные, полученные часто при несопоставимых условиях реакций, что затрудняет их анализ применительно к исследованию механизма действия холинэстераз. [c.157]

При исследовании ингибиторов близкого строения, для которых частота соударений с активным центром фермента может быть принята приближенно одинаковой, суммарное значение предэкспонента и величина экспериментально определяемой энергии активации могут быть использованы для сопоставления между собой этих ингибиторов и выяснения влияния их химического строения на величину активационного барьера и роль структурного (энтропийного) фактора в ингибировании. Большой экспериментальный материал, полученный при изучении ингибирования холинэстераз фосфорорганическими соединениями, свидетельствует о том, что в ряде случаев энтропийный фактор имеет определяющее значение для реакционноспособности ингибиторов (см. гл. X). [c.137]

Зависимость константы Михаэлиса и максимальной удельной скорости гидролиза от строения субстрата холинэстераза сыворотки крови (pH 8,0, температура 25°) [c.160]

На этом основании было высказано предположение, что одним из факторов, определяющих взаимодействие фермента с субстратом при образовании комплекса Михаэлиса, служит ионная реакция между катионным центром ацетилхолина и анионным центром на активной поверхности фермента. Такое взаимодействие должно быть первичным в реакции фермента с субстратом, поскольку ионные силы проявляются на большем расстоянии, чем другие виды химических взаимодействий. Образованию ионной связи приписывали лишь якорную функцию, в результате реализации которой молекула субстрата ориентируется на поверхности фермента, чем значительно облегчается образование других необходимых химических связей (уже ближнего действия) с группировками активного центра фермента. В связи с этим исследованию кинетики и механизма ингибирования холинэстераз ионами тетраалкиламмония было уделено особое внимание. Задача этих исследований — изучение особенностей строения и роли анионного центра холинэстераз в каталитическом действии указанных ферментов. [c.185]

Кинетические константы, приведенные в табл. 29, показывают, что реакционноспособность всех исследованных ФОС в отношении холинэстеразы значительно выше, чем в реакциях их гидролиза, причем эта большая реакционноспособность, измеряемая величиной константы скорости реакции, находится в соответствии с меньшей величиной энергетического барьера реакции и с большей величиной пространственного фактора (предэкспонента). Причина этого кроется в особенностях химического строения активного центра холинэстеразы и участии в реакции с ФОС не какой-то одной нуклеофильной группировки активного центра, а нескольких групп, расположенных комплементарно структуре молекулы ФОС. [c.210]

Наибольший интерес представляет вопрос о значении измеренных термодинамических констант ингибирования холинэстераз для суждения о реакции фермента с субстратом — ацетилхолином. Конечно, сопоставление ионов ацетилхолина (VII) и, например, тетраметиламмония (XI) должно проводиться с учетом различий в их строении [c.191]

Уже в самом начале исследований было ясно, что речь идет о действительно высоко специфической реакционноспособности ФОС определенного строения, поскольку их ингибирующий эффект проявлялся практически только лишь в отношении холинэстераз, причем в необычайно низких концентрациях ингибитора (часто порядка 10 — 10 М). Обнаруженная одновременно способность ФОС ингибировать некоторые протеолитические и эсте-ролитические ферменты не имела, по-видимому, практического значения для биологической активности ФОС и проявлялась при значительно (на несколько порядков) более высоких концентрациях. [c.204]

Исследования кинетики взаимодействия ФОС различного строения с холинэстеразами, проведенные во многих лабораториях на протяжении последних 15 лет, позволили прийти к определенным выводам как о механизме реакции, так и об особенностях строения [c.205]

Сопоставление кинетических констант взаимодействия ФОС с холинэстеразой и ОН"-ионами свидетельствует о том, что, как правило, изменения химического строения ингибитора однотипно сказываются на изменении реакционноспособности в обоих процессах. При прочих равных условиях структурные замены, ведущие к увеличению дефицита электронов (к увеличению эффективного положительного заряда) у атома фосфора, дают, как правило, повышение как константы скорости взаимодействия с ферментом, так и константы скорости гидролиза. Наиболее отчетливо это можно видеть при сравнении соединений 1—3. Как известно, триэтил-фосфат (XIV) [c.208]

Эти методические подходы в последние годы начали использоваться для анализа связи между строением ФОС и их реакционноспособностью в нуклеофильных реакциях, в том числе в реакциях с холинэстеразами. [c.212]

Пространственное строение неполярной группировки молекулы ингибитора и кинетика взаимодействия с холинэстеразой [c.231]

Выше было отмечено, что при реакции иона тетраалкиламмония (в составе субстрата холинэстераз или ингибитора) с анионным центром активной поверхности фермента, помимо чисто кулонов-ского взаимодействия, имеет значение строение алкильных радикалов у четвертичного атома азота. Это свидетельствует об участии определенным образом расположенных в пространстве алкильных групп при азоте в реакции с активной поверхностью холинэстераз. Возникает, однако, вопрос, какова относительная роль электро- [c.231]

Оказалось, что реакционноспособность ингибиторов по отношению к холинэстеразам в значительной мере изменяется при изменениях строения радикала Я. [c.233]

В табл. 33 представлены кинетические данные, позволяющие видеть, как постепенное приближение к строению ацетилхолина увеличивает константу скорости ингибирования холинэстераз. [c.233]

В настоящее время установлено, что специфичность и каталитические свойства многих ферментов обусловлены наличием в молекуле фермента определенных активных центров или активных участков полипептидной цепочки. В ряде случаев установлен характер и порядок чередования остатков аминокислот в этих функционально наиболее важных участках. Так, особенно важную роль играет фрагмент полипептидной цепи, имеющий строение аспарагиновая или глютаминовая кислота —серин — глицин или аланин (холинэстераза, трипсин, тромбин и др.). От некоторых ферментов оказалось возможным отщепить часть молекулы без существенного снижения их каталитической активности. К числу таких ферментов принадлежат, например рибонуклеаза и ряд протеолитических ферментов. [c.124]

Совершенно очевидно, что активность одного и того же соединения по отношению к разным видам насекомых и животных неодинакова, так как различно строение холинэстеразы разных видов организмов, а также отличны пути метаболизма фосфорорганических соединений. Например, карбофос в организме комнатной мухи претерпевает превращения обычного типа, тогда как в организме крыс образуется малотоксичная ма-латионовая кислота — 5-(1,2-дикарбоксиэтил)-0,0-диэтилдитио-фосфат (1). [c.401]

Теоретически можно синтезировать фосфорорганический инсектицид,, обладающий избирательным действием, исходя из следующих предпосылок различие в строении холинэстераз теплокровных и насекомых, наличие или отсутствие комплементарности ингибитора с поверхностью активных центров холинэстераз теплокровных и насекомых различие в строении холинорецеп-торов теплокровных животных и насекомых, различие метаболитических превращений соединений в теле насекомых и теплокровных. [c.344]

Совершенно очевидно, что активность одного и Того же соединения будет отличаться по отношению к холинэстеразе разных видов насекомых и животных. Это связано с различием в строении холинэстеразы различных организмов [1, 4], а также различными путями метаболизма фосфорорганических соединений в организме насекомых и животных [2]. Так, например, карбофос в организме комнатной мухи претерпевает обычный тип превращений, тогда как в организме крыс он дает малотоксичную малатионовую кислоту [c.473]

Блокирование холинэстеразы фосфорорганическими соединениями сводится к фосфорилированию ее активных центров с образованием диалкилфосфорилированной холинэстеразы. Помимо общих токсикологических свойств каждый фосфорорганический пластификатор в зависимости от химического строения может иметь индивидуальную токсикологическую характеристику. [c.130]

Этот метод дает удовлетворительные результаты при изменении концентрации ацетилхолина не менее чем на 25%, что не позволяет исследовать начальный участок кинетической кривой. Самый по себе метод не дает кинетической кривой, и для ее построения необходим анализ значительного числа проб, что создает большие технические трудности. Наконец следует отметить, что метод Хестрина не вполне специфичен и при наличии в анализируемой пробе эфиров карбоновых кислот (а также ангидридов, галоидангидридов и тому подобных активных ацильных производных) получаются неудовлетворительные результаты. Это особенно приходится иметь в виду при работе с ингибиторами холинэстераз, многие из которых имеют строение эфиров и ангидридов. [c.144]

Путем измерения окраски образующегося индофенолята при помощи спектрофотометра или электрофотоколориметра можно определять активность фермента. В дальнейшем был описан синтез большого ряда эфиров замещенных фенолиндофенолов, исследованы их строение и каталитическая активность холинэстераз в реакциях гидролиза этих эфиров [64—66]. При этом установлено, что незамещенный индофенилацетат гидролизуется как холинэстеразой, так и ацетилхолинэстеразой примерно с одинаковой скоростью. [c.155]

Новый кинетический метод для определения концентрации каталитических центров ацетилхолинэстеразы применили Уилсон и Гаррисон [105]. Метод основан на исследовании скорости взаимодействия фермента с диметилкарбамилфторидом (формула VI), который аналогично фосфорорганическим соединениям ангидридного строения ингибирует холинэстеразы ацилируя их активные центры. [c.172]

В течение длительного времени эзерин и близкие по строению производные карбаминовой кислоты относили к ингибиторам обратимого действия, реагирующим с холинэстеразами по схеме [c.194]

Следует сказать, что кинетический метод исследования сыграл и еще сейчас играет важнейшую роль в изучении механизма взаимодействия ФОС с холинэстеразами. Метод позволяет производить сопоставление специфической реакционноспособности и химического строения ФОС. При использовании полифункциональных ФОС в качестве химических шаблонов появляется возможность исследования структуры активных центров холинэстераз. При исследовании кинетики взаимодействия ФОС с холинэстеразами с самого начала встретились трудности методического характера. Для количественной оценки реакционноспособности необратимых ингибиторов нельзя было обойтись величиной Igo, которая широко применялась при оценке действия обратимых ингибиторов. Если в первые годы изучения ФОС величина Igo по аналогии с исследованиями обратимых ингибиторов холинэстераз типа фи-зостигмина, часто использовалась для оценки антиферментной активности, то в дальнейшем стали появляться работы по измерению кинетики взаимодействия ФОС (подробнее обоснование такого подхода см. стр. 114). [c.204]

Эти факты поудили предпринять систематическое исследование кинетики ингибирования холинэстераз фосфорорганическими соединениями строения (XXXVII) [c.232]

При анализе причин повышения антихолинэстеразной активности необходимо иметь в виду, что сама по себе подвижность Р—8-свЯзи, по-видимому, мало меняется при изменении структуры радикала. Как следует из данных табл. 33, константа скорости щелочного гидролиза в этом ряду соединений почти не изменяется. Это значит, что распределение плотности электронов в молекуле, подвергающейся нуклеофильной атаке гидроксила при щелочном гидролизе, у рассматриваемых соединений различается несущественно. Об этом же говорят величины энергии активации для реакции ингибирования холинэстераз. Таким образом, энергетический барьер нуклеофильного замещения, определяющийся в основном распределением зарядов в реагирующих молекулах, по-видимому, одинаков для всех четырех соединений. Из данных таблицы следует, что увеличение константы скорости фосфорилирования холинэстераз есть следствие повышения предэкспонента RZ, отражающего возрастание пространственного соответствия молекулы ингибитора структуре активной поверхности. При появлении в молекуле ингибитора тетраэдрической структуры с тремя метильными группами (ХХХУП ), близкой по строению катионной группе ацетилхолина XXXИ, повышается способность [c.233]

Таким образом, вопрос о конкретном химическом строении участка холинэстераз в районе катионной группировки требует дальнейшего исследования. При этом необходимо иметь в виду, что использование методов ферментативной кинетики для этих целей может быть полезным только в том случае, если для сопоставления выбираются адэкватные константы, что не во всех случаях принимается во внимание. Так, например, вывод о том, что 3,3-диме-тилбутилацетат в качестве субстрата холинэстераз несущественно отличается от ацетилхолина [174—175], был основан на сопоставлении скорости гидролиза при концентрации оптимальной для каждого субстрата. При этом, следовательно, оценивалась максимальная скорость реакции, которая находится в сложной зависимости от констант скорости промежуточных стадий. Без анализа кинетики этих стадий и оценки констант субстрата или констант [c.236]

Современные данные о механизме действия холинэстераз были получены в результате исследований многочисленных научных работников разных стран. Однако только часть этих исследований цитирована в книге, поскольку автор настоящей монографии не задавался целью посвятить ее холинэстеразам, а стремился на примерах изучения последних оценить лишь основные пути применения кинетических методов. Справедливо упомянуть имена исследователей, которые внесли, пожалуй, наибольший вклад в создание современных представлений о строении и механизме действия холинэстераз. По-видимому, пионерами этого направления следует считать Нахманзона, Уилсона и Бергманна далее следует упомянуть Уитеккера, Августинссона, Берри, Коэна, Олдриджа и Дейвиса. Разумеется, эти имена не исчерпывают и малой доли общего числа ученых, чей вклад в форме многих или немногих экспериментов, а иногда и теоретических высказываний по актуальным вопросам помог созданию современных представлений о хо-линэстеразах. [c.237]

Формулирование конкретного участия в каталитическом акте других групп, исключая серин, следует рассматривать как условное, пока не будут получены более прямые доказательства. По-видимому, понятие активный центр , или активная поверхность , применительно к холинэстеразам не исчерпывается названными выше функциональными группами белковой молекз лы. Эго следует уже из одного того, что отчетливо выявленные кинетическими методами различия между холинэстеразой и ацетилхолинэстеразой не могут найти объяснение, если опираться лишь на такое упрощенное представление о строении активных центров этих ферментов. В действительности каталитическая реакция осуществляется при обязательном участии и других групп молекулы фермента, однако характеристика этих групп — дело будущего. [c.238]