панкреатическая конформации

Итак, благодаря избирательности бифуркационных флуктуаций и их строгой согласованности структурная самоорганизация белковой молекулы приобретает детерминистические черты (случайность порождает необходимость). Из конформационно жестких и взаимодействующих с ними лабильных фрагментов возникают нуклеации, которые через ряд чисто случайных, но тем не менее неизбежных и строго последовательных событий входят в домены или в нативную трехмерную структуру белка. Весь процесс самосборки пространственной структуры не требует времени больше, чем затрачивается на рибосомный синтез белковой цепи. Уникальность бифуркаций, порядок их возникновения и устойчивый конструктивный характер обусловлены конкретной, отобранной в ходе эволюции аминокислотной последовательностью. В то же время рассматриваемая модель свертывания не исключает образование "неправильных" промежуточных состояний, содержащих структурные элементы, отсутствующие в конечной конформации. Более того, поскольку в основу модели положен беспорядочно-поисковый механизм, осуществляющий сборку белка методом "проб и ошибок", то возникновение непродуктивных состояний белковой цепи становится неизбежным. Однако они нестабильны, так как продуктивные состояния, появляющиеся в результате бифуркационных флуктуаций, всегда более предпочтительны по энергии. К обсуждению этого вопроса вернемся в главе 17 при количественном описании механизма ренатурации панкреатического трипсинового ингибитора. [c.98]

Выявлены функции ближних, средних и дальних взаимодействий, определяющих возможность, направленность и предел самопроизвольного процесса свертывания белковой цепи в нативную конформацию. Этот вопрос рассматривается (с привлечением экспериментальных данных и неравновесной термодинамической модели) в следующей главе после анализа результатов априорного расчета пространственной структуры молекулы бычьего панкреатического трипсинового ингибитора. [c.426]

В предыдущих главах обсуждены результаты первых и пока единственных априорных расчетов трехмерных структур двух низкомолекулярных белков - нейротоксина II и панкреатического трипсинового ингибитора. Они демонстрируют возможность количественного подхода к описанию на атомном уровне нативной конформации и механизма структурной самоорганизации белковой молекулы, руководствуясь только знанием аминокислотной последовательности. Совпадение найденных теоретически и полученных экспериментально значений двугранных углов ф, /, (о и X с [c.482]

Доказать термодинамическую гипотезу свертывания очень трудно. Обычно полагают, что термодинамическая гипотеза подтверждается экспериментами по повторному свертыванию панкреатической рибонуклеазы [4351. В этих опытах восстановленная несвернутая рибонуклеаза повторно окислялась в присутствии 8 М мочевины причем образовывалась случайная система водородных связей. В результате получалось около 100 различных продуктов, каждый из которых характеризовался своим набором из 4 дисульфидных связей (возможны (2-4) /2 -4 = 105 систем связей S—S [436, 4371 кроме того, существуют различные теоретические возможности образования петель. Удаление мочевины и добавление меркаптоэтанола (рис. 4.3) приводило к постепенному и в конечном счете количественному образованию нативной структуры. Этот факт показывает, что исходя из 100 различных групп, находящихся в исходных конформациях, можно получить нативную структуру. Хотя это число и невелико, данный опыт свидетельствует об уникальности продукта свертывания, однако он не позволяет решить вопрос о локальном или глобальном минимуме. [c.182]

Следует подчеркнуть, что в этом небольшом, казалось бы, химическом процессе - отщепление гексапептида от предшественника-заключено важное биологическое значение, поскольку при этом происходят формирование активного центра и образование трехмерной структуры трипсина, а известно (см. главы 1 и 4), что и белки биологически активны только в своей нативной трехмерной конформации. В том, что трипсин, как и другие протеиназы, вырабатывается в поджелудочной железе в неактивной форме, также имеется определенный физиологический смысл, поскольку в противном случае трипсин мог бы оказывать разрушающее протеолитическое действие не только на клетки самой железы, но и на другие ферменты, синтезируемые в ней (амилаза, липаза и др.). В то же время поджелудочная железа защищает себя еще одним механизмом-синтезом специфического белка ингибитора панкреатического трипсина. Этот ингибитор оказался [c.420]

Изучено также пространственное строение панкреатической рибонуклеазы. Наиболее известной особенностью рибонуклеазы является ее способность обратимо восстанавливать нативную пространственную конформацию после разрыва всех 4 дисульфидных мостиков при обработке (3-меркаптоэтанолом и 8 н. раствором мочевины, действующими на водородные связи. После удаления этих реагентов белок повторно свертывается и окисляется, восстанавливая прежние свойства. Более того, фермент остается активным даже после разрыва полипептидной связи между Ala 20 и Ser 21 остатками. Реконструкция осуществляется под влиянием межвитковых взаимодействий боковых заместителей основной полипептидной цепи. [c.115]

Выгодные низкоэнергетические состояния появляются сразу на ранних этапах сворачивания в небольших участках цепи, включающих два - три остатка, а средние и дальние взаимодействия их не только не "портят", но стабилизируют. Эти представления можно использовать для того, чтобы упростить метод расчета низкоэнергетической конформации белка. Вместо того чтобы пытаться сразу найти минимальную по энергии конформацию для всей цепи, находят вначале низкоэнергетические состояния дипептидов. Низкоэнергетические формы трипептидов представляют собой комбинации низкоэнергетических форм смежных дипептидов, что является результатом согласованности три - и дипептидных взаимодействий. Конформационный анализ более сложных олигопептидов проводится методом последовательного увеличения цепи на один остаток. Важно, что новые взаимодействия, возникающие при удлинении цепи, стабилизируют фрагмент и не нарушают уже сложившихся взаимодействий и низкоэнергетических форм. В настоящее время такой полуэмпирический метод расчета дает возможность определить пространственную структуру достаточно сложных полипептидов, включающих до сотни остатков. Например, была рассчитана структура молекулы бычьего панкреатического трипсинового ингибитора, включающей 58 аминокислотных остатков с заданной первичной последовательностью. Однако расчеты более сложных полипептидов потребуют привлечения уже независимых стерических предположений о возможной структуре белка. [c.95]

Природа предоставила нам редкую возможность установить структуру фермент-субстратных комплексов трипсина и химотрипсина с полипептидами, создав множество ингибиторов-полипептидов, которые очень прочно связываются с трипсином и химотрипсином, поскольку зафиксированы в той конформации, которую субстрат принимает при связывании [52]. Эти полипептиды не гидролизуются при физиологических условиях, так как подвижность аминогруппы, которая высвобождается при расщеплении пептида, ограничена и она не может диффундировать из активного центра фермента. При устранении ограничений в панкреатическом ингибиторе трипсина путем восстановления дисульфидного мостика в полипептидной цепи пептидная связь между Ьуз-15 и А1а-16 легко расщепляется трипсином [53]. Структура трипсина, его комплекса с основным панкреатическим ингибитором трипсина и свободного ингибитора была установлена при разрешении 1,4, 1,9 и 1,7 А соответственно [54]. Полученные данные относятся к числу наиболее точных — положение атомов известно с точностью 0,1—0,2 А. Эти и другие исследования дали следующую информацию относительно связывания субстратов [55—65]. [c.39]

Устойчивость к денатурирующим агентам в большой мере зависит от наличия дисульфидных связей в молекуле белка. В ингибиторе трипсина (панкреатический белок) есть три S — S-связи. Если их восстановить, то происходит денатурация без других денатурирующих воздействий. Если затем белок поместить в окислительные условия, в которых происходит окисление SH-групп цистеина и образование дисульфидных связей, то исходная конформация восстанавливается. Даже единственная дисульфидная связь существенно повышает стабильность пространственной структуры. [c.36]

Метод статнстической информации. Это целое семейство процедур, в которых для отбора конформаций, служащих исходными приближениями в последующем расчете, используется разного рода вероятностная информация. Ее источником может быть банк данных белковых структур, статистическое распределение остатков на конформационных картах усредненная предпочтительность парных остаток-остаточных контактов или алгоритмы предсказаний вторичных структур [210-216]. Очевидно, данные такого рода ориентировочны и могут скорее ввести в заблуждение, чем помочь в решении структурной проблемы пептидов и тем более белков. Конформационные возможности каждого из них определяются не статистикой, а определенной и всегда уникальной аминокислотной последовательностью. Показательно в этом отношении исследование М. Ламберта и Г. Шераги [210-212] панкреатического полипептида из 36 остатков. В расчет его структуры в качестве дополнительной вероятностной информации привносятся данные о распределении значений двугранных углов основной цепи в четырех областях конформационной карты ф-ц/ и распределении конформационных состояний трипептидных сегментов на нерегулярных участках трехмерных структур белков, изученных кристаллографически. Набор исходных для оптими- [c.244]

В конце 1970-х и в 1980-е годы исследования подобного плана [40-46] не претерпели существенных изменений и не внесли новых идей в решение проблемы свертывания и структурной организации нативного белка. Для иллюстрации рассмотрим кратко результаты анализа процесса сборки белковой цепи бычьего панкреатического трштсинового ингибитора, полученные С.Миязавой и Р. Джерниганом [46]. Авторы представили белковую последовательность в виде цепочки жестких сфер, совмещенных с атомами С и СР аминокислотных остатков. Конформационными параметрами считались двугранные углы ф, у, которым разрешалось принимать дискретные значения через каждые 10°. Межостаточные взаимодействия учитывались исключительно между теми парами остатков, которые в кристаллической структуре трипсинового ингибитора образуют близкие контакты. При оценке взаимодействия между двумя остатками энергия принималась равной -2,2 ккал/моль, если расстояние между соответствующими атомами СР в нативной конформации белка находилось в интервале 2,4-6,5 А когда расстояние было < 2,4 А, энергия считалась бесконечно большой, а > 6,5 А - равной нулю. Следовательно, притяжение друг к другу могли испытывать только те остатки (жесткие сферы) атомы СР которых сближены в реальной трехмерной структуре. Для [c.488]

Аналогичная задача, отвечающая второй стадии комбинированного Метода, решалась в работе Бэржеса и Шераги [132], которая уже рассматривалась. В ней также конформационные состояния всех остатков Панкреатического трипсинового ингибитора были отнесены не с помощью эмпирических корреляций, а на основе кристаллической структуры молекулы. Оказалось, что рассчитанная с использованием такого идеального Алгоритма предсказания, каким является эксперимент, конформация белка Даже отдаленно не напоминала его нативную структуру. Следовательно, Попытки уложить вторичные структуры в супервторичные и получить [c.509]

Решающим доказательством справедливости предложенного подхода к решению задачи о структурной организации белка явились результаты априорного расчета трехмерной структуры бычьего панкреатического трипсинового ингибитора и количественное представление свертывания белковой цепи как самопроизвольного, быстрого и безошибочного процесса. Рассчитанная при использовании аминокислотной последовательности и стандартной валентной схемы конформация белка совпала с кристаллической структурой молекулы БПТИ. Точность расчета значений всех двугранных углов вращения ф, у, (О и %, расстояний между атомами С всех остатков и длин реализуемых водородных связей оказалась близкой точности рентгеноструктурного анализа белков высокого разрешения. На основе данных о конформационных возможностях аминокислотной последовательности БПТИ получили свое объяснение все детали ренатурации белка, механизм которой был изучен экспериментально. Тем самым, во-первых, была подтверждена неравновесная термодинамическая модель сборки белка. Во-вторых, была апробирована физическая теория структурной организации белка, вскрывающая природу бифуркационных флуктуаций и утверждающая представление о нативной конформации белковой молекулы как о глобальной по внутренней энергии структуре, плотнейшим образом упакованной и согласованной в отношении всех своих внутриостаточных и межостаточных невалентных взаимодействий. Именно гармония между ближними, средними и дальними взаимодействиями ответственна за резкую энергетическую дифференциацию и выделение из множества возможных структурных вариантов стабильной и уникальной для данной аминокислотной последовательности конформации белка. В-третьих, продемонстрированы реальность фрагментарного метода теоретического конформационного анализа пептидов и белков и удовлетворительное количественное описание с его помощью их пространственных структур применительно к условиям полярной среды. Под- [c.589]

Субстратная специфичность заключается в доступности точек контакта в белке для пиримидиновых или пуриновых оснований специфическое действие (расщепление связи 3 — О —Р или 5 —О — — Р) состоит не во внутримолекулярном образовании водородных связей в субстрате, а в нуклеофильной атаке на определенную сторону атома фосфора (определяемую конформацией фермента и расположением точки контакта воды), обеспечивающей вытеснение определенной группы с противоположной стороны. На схемах специфичность субстрата указывается наклоном контуров фермента. Общая схема предполагает, что панкреатическая рибонуклеаза может обладать очень низкой активностью по отнощению к пуриновым производным. Далее, рассмотрение химии диэфиров и моноэфи- [c.383]

Описанный метод был апробирован Левиттом и Уоршелом для расчета пространственной структуры бычьего панкреатического трипсинового ингибитора. Белок, состоящий из 900 атомов и имеющий 319 конформационных степеней свободы (двухфанные углы вращения ф, ф, ш и х), был представлен бусиничной моделью из 110 обобщенных "атомов", обладающей 57 степенями свободы (углы а). Для минимизации энергии такой системы при вариации углов а выбраны следующие три начальных приближения полностью собранная нативная конформация белка, развернутая цепь с фиксированным С-концевым а-спиральным фрагментом (остатки 48—58) и полностью развернутая цепь. Наиболее предпочтительные оптимальные конформации каждого из трех начальных вариантов имели среднестатистические отклонения от кристаллографической структуры белка 2,5, 6,2 и 7,8 А. Минимизация энергии полностью развернутой цепи второго и третьего исходных структурных вариантов не привела к появлению каких-либо элементов белковой нативной конформации конечный результат целиком определялся начальным приближением. Выбранная модель, таким образом, не сработала. [c.288]

Описанная схема использована Танакой и Шерагой для предсказания трехмерной структуры бычьего панкреатического трипсинового ингибитора. Первоначальная идентификация конформационного состояния каждого остатка символами h, , и с и, следовательно, определение ограниченной области возможных значений ф, ф выполнены на основе не предсказательных алгоритмов, а рентгеноструктурных данных. Конформации белка на разных стадиях процедуры Монте-Карло представлялись в виде контактных треугольников, отражающих взаимодействия между всеми парами остатков. Сопоставление контактных треугольников опытной структуры и конечной теоретической конформации молекулы трипсинового ингибитора обнаруживает существенные расхождения. В рассчитанном варианте отсутствует целый ряд контактов, присущих реальному белку, и в то же время имеется много лишних контактов. Неудовлетворительное совпадение при грубом, почти качественном способе сравнения имеет место даже в том случае, когда основная часть информации о структуре небольшого белка, а именно идентификация конформационных состояний всех остатков, была взята из эксперимента и использована в расчете на первом этапе. Помимо расчетной модели, не отражающей конформационной специфики белковой цепи, метод Танаки и Шераги ограничен также возможностями предсказательных алгоритмов. Особенно настораживает то обстоятельство, что в случае рассмотрения белка с неизвестной структурой выбранные на этапе А для остатков конформационные параметры далее не изменяются. Следовательно, допущенные при отнесении с помощью эмпирических корреляций ошибки (а они неизбежны и со-10 291 [c.291]

Аналогичная задача, отвечающая второй стадии комбинированного метода, решалась еще в 1975 г. А. Бэржесом и Г. Шерагой [139] на примере панкреатического трипсинового ингибитора, где также отнесения конформационных состояний остатков были сделаны не с помощью эмпирических корреляций, а на основе кристаллографической структуры молекул. Оказалось, что рассчитанная с использованием такого идеального алгоритма предсказания, каким является эксперимент, конформация белка даже отдаленно не напоминала его нативную структуру (подробнее см. раздел 8.3). [c.320]

На основе экспериментального подхода, объединяющего отмеченные выше и некоторые другие методы, можно проводить изучение денатурации по строго логической и апробированной схеме. Она прежде всего включает получение информации о наличии дисульфидной связи в любом промежугочном продукте, что свидетельствует о сближенности соответствующих участков его полипептидной цепи. Такие данные о серии продуктов, например о моно-8-8-производных, образовавщихся на первом этапе ренатурации, создают о каждом из них специфическое стереохимическое представление. Сопоставление таких (а именно детерминированных числом и положением дисульфидных связей) представлений о всей гамме метастабильных промежуточных продуктов на пути ренатурации от флуктуирующего клубка до нативной трехмерной структуры позволяет выделить ряд связанных между собой продуктивных промежуточных состояний внутримолекулярных конвертируемых реорганизаций, ведущих этот ряд к нативной конформации. Дисульфидная связь как бы делает видимым весь процесс сборки белковой глобулы. В наиболее полной мере имеющиеся возможности реализованы пока лишь для одного белка - бычьего панкреатического трипсинового ингибитора. [c.381]

Более общий подход Левитта и Варшела допускает упрощенное представление не только спиральной, но и других конформаций. Предложенный алгоритм был запрограммирован для ЭВМ, что, однако, не делает метод свободным от ряда серьезных недостатков. Так, в основной цепи белка отсутствовала пептидная группа атомов СО-ЫН, Са-углеродные атомы соединялись виртуальной связью, а боковые цепи заменялись укрупненными атомами (большими искусственными атомами, заменяющими целые атомные группировки). Эта модель была впервые применена к небольшому белку — панкреатическому трипсиновому ингибитору [33], В работе [33] был достигнут определенный успех, который с позиций сегодняшнего дня имеет в основном историческое значение. Следует отме-тить, что это исследование получило высокую оценку и вызвало оживленную дискуссию [14, 44]. Благодаря широкому обсуждению были выработаны общие подходы, применяемые при предсказа1ши структуры белка, согласно которым любая соответствующая процедура должна 1) быть полностью автоматической 2) иметь входные параметры, применимые к любым белкам 3) быть количественно воспроизводимой и 4) быть свободной от неоправданных приспособлений к конкретным объектам. Кроме того, единственной переменной входной информацией о белке должна служить его аминокислотная последовательность. Впоследствии именно Левитт внес большой вклад в развитие методов предсказания третичной структуры белков. [c.596]

Активация панкреатических зимогенов может служить примером усиления первоначального сигнала путем регуляции активности ферментов. Каждая молекула энтеропептидазы превращает большое число молекул трипсиногена в трипсин в свою очередь каждая молекула трипсина катализирует образование новых молекул трипсина трипсин активирует другие зимоге-ны, и активированные протеиназы гидролизуют пептидные связи. Другие примеры усиления сигналов будут рассмотрены далее в этой главе и в гл. 4 и 5. То обстоятельство, что участки пептидной цепи, в которых в процессе активации происходит гидролиз, локализованы около N-конца зимогена и что для появления активности необходимо расщепить только одну связь, хорошо иллюстрирует принцип биологической экономии. Нативная конформация зимогена создает [c.40]

Протеазы часто обладают также эстеразной активностью. При ацетилировании в карбоксинептидазе А всего двух тирозиновых остатков наблюдается шестикратное усиление эстеразного действия, протеолитическая же активность фактически утрачивается. Панкреатические рибонуклеазы (РИКазы) подвергали многим химическим модификациям. Интересна димеризация фермента с помощью сшивающего агента диметилсуберимидата. Нативный фермент представляет собой мономер с низкой активностью по отношению к двухцепочечной РНК, однако после сшивки гидролитическое действие фермента на двухцепочечную РНК усиливается в 78 - 440 раз. При сшивке этого фермента в присутствии ингибитора индолпропионовой кислоты у него появляется также эстеразная активность, что предположительно связано с осуществлением сшивки при необычной конформации фермента. [c.109]