Определение С-концевой последовательности аминокислот

С-Концевой анализ можно провести с помощью фермента карбоксипептидазы, который специфически отщепляет С-конце-вой остаток от белка. Эту аминокислоту затем можно идентифицировать. Далее процесс повторяют на оставшемся белке и определяют следующий остаток и т. д. до определения всей последовательности. [c.268]

Из всех методов определения С-концевых аминокислот этот метод самый специфичный. Пользуясь карбоксипептидазой также, как при действии аминопептидазой, можно определять не только С-коицевую аминокислоту, но и последовательно отщеплять аминокислотные остатки с С-конца пептида. Реакция обрывается, когда в пептидной цепи встречается пролин, так как карбоксипептидаза не гидролизует связь СО—N. [c.513]

Электрофоретическое разделение НЬА и НЬ8 по методу подвижной границы показывает, что разница между зарядами этих молекул составляет один элементарный заряд на половину молекулы. Вполне возможно, что эта разница обусловлена заменой всего лишь одной аминокислоты в а- или р-цепи. Для того чтобы дать точный ответ, нужно было бы иметь данные полного анализа аминокислотной последовательности в обеих цепях. Однако установить участок, в котором два вида молекул гемоглобина различаются по аминокислотному составу, можно и без полного определения последовательности аминокислот. Протео-литический фермент трипсин гидролизует пептидные связи, в образовании которых участвуют карбоксильные группы остатков лизина и аргинина. И лизин, и аргинин имеют сравнительно длинные неразветвленные боковые цепи с положительным зарядом на конце. В каждой половине молекулы гемоглобина на 287 аминокислотных остатков приходится около 26 остатков лизина и аргинина. Таким образом, трипсиновый гидролизат половины молекулы гемоглобина должен содержать около 28 пептидов (поскольку в каждой половине имеются две различные цепочки), каждый из которых содержит в среднем немногим больше 10 остатков. В действительности при таком гидролизе отщепляется устойчивое ядро , содержащее около четверти аминокислотного состава половины молекулы. Анализ состава этого ядра , отделенного центрифугированием от прочих пептидов, показывает, что в НЬА и в НЬЗ оно имеет одинаковый аминокислотный состав и, вероятно, одинаковую последовательность аминокислотных остатков. [c.223]

Начальный этап в изучении первичной структуры пептида или белка состоит в определении N-концевой аминокислоты, т. е. той, которая находится на конце цепи и имеет свободную а-аминную группу. Ее можно при помощи специальных методов отщепить и точно идентифицировать. Затем то же самое можно повторить с концевой группой, оставшейся на конце цепи после отщепления первой. Повторяя операции несколько раз и осуществляя ступенчатый гидролиз цепи, возможно определить в нем аминокислотную последовательность с N-конца. Возможно подобное определение и аминокислоты со свободной а-СООН-группой (С-конце-вой), но при помощи иных методов. Этим способом можно определить лишь по несколько звеньев с обоих концов, так как повторные операции удается повторять не более чем 5— 12 раз. Однако таким путем не трудно расшифровывать строение пептидов — продуктов гидролиза белка. [c.24]

Значительно более сложным является определение последовательности аминокислот в пептидных цепях белка. С этой целью прежде всего определяют Ы- и С-концы полипептидных цепей, при этом решаются два вопроса — идентифицируются концевые аминокислоты и определяется число пептидных цепей, входящих в состав макромо-лекул белка. [c.458]

Определение С-концевой структуры молекулы основано на способности бромциана отщеплять от С-конца изоферментов карбоангидразы быка и человека пептиды, содержащие 19 или 20 остатков аминокислот [57—59]. Строение этих пептидов показано в табл. 16.6. При нумерации остатков предполагается, что 21-й аминокислотой во всех случаях является метионин. Это позволяет во всех трех последовательностях выделить наибольшее число гомологичных участков (отмеченных рамками в табл. 16.6). Карбоангидраза В человека при этом оказывается короче на одну С-конце-вую аминокислоту (лизин). Наблюдается также большое структурное сходство карбоангидразы С человека с изоферментами низших видов млекопитающих. Последнее согласуется с результатами физико-химических и кинетических исследований (разд. 2.3). [c.570]

Были определены последовательности 350 нуклеотидов от З -конца гена НА и предсказанных последовательностей аминокислот 32 вирусов гриппа типа А, включая и представителей каждого из 13 известных подтипов НА [1, 42]. Остатки цистеина и другие определенные аминокислоты сохраняются во всех последовательностях. Это указывает, что 13 подтипов НА происходят от общего прародителя, и что они имеют общую основную структуру, Нри парном сравнении частичных аминокислотных последовательностей наиболее удаленными друг от друга подтипами оказались Н1 и НЗ (25% гомология). Другие подтипы были похожи друг на друга наибольшая гомология была обнаружена между Н2 и Н5 (80%). Связь между частичными последовательностями показана на дендрограмме (рис. 28). [c.148]

Дендрограмма, показывающая связь между N-терминальными последовательностями аминокислот НА1, выведенными из геномных последовательностей вирусов, представляющих 13 известных подтипов. Последовательности были выстроены в ряд с использованием аминокислот, которые не изменяются в определенных положениях для всех последовательностей (положение аминокислоты от N-конца большинства подтипов Цис 4, Гли 6, Тре 18, Вал 26, Цис 42, Цис 55, Гли 63, Про 65, Цис 67, Глу 81). Различия последовательности всех попарных сравнений выстроенных последовательностей в процентах, начиная с N-терминального Асп или соответствующей аминокислоты, были использованы для расчета дендрограммы. Таким образом, места расположения каждого разветвления в дендрограмме указывают основное различие последовательности для связанных через эту точку последовательностей. [c.149]

Последовательность нуклеотидов и генетический код. Методы определения последовательности аминокислот в полипептидной цепи были известны еще в 50-х гг. Теоретически это относительно легкая проблема, поскольку все 20 аминокислот, встречающиеся в природных белках, имеют разные свойства. С другой стороны, нуклеотидная последовательность ДНК относительно однородна по составу элементарных звеньев, так как содержит только четыре типа азотистых оснований-гуанин, цитозин, аденин и тимин. Когда еще в 60-х г. был расшифрован генетический код, появилась возможность восстанавливать (дедуцировать) нуклеотидную последовательность транскрибируемой ДНК по аминокислотной последовательности соответствующего белка. Однако генетический код является вырожденным, то есть одной и той же аминокислоте соответствуют несколько разных нуклеотидных триплетов. Следовательно, суждения о нуклеотидной последовательности, основанные на последовательности аминокислот в белке, не однозначны. Кроме того, последовательности аминокислот не содержат никакой информации о последовательности некодирующих участков ДНК. В настоящее время разработаны методы непосредственного секвенирования ДНК [117]. Принцип состоит в следующем длинную молекулу ДНК фрагментируют при помощи агентов, расщепляющих ее в специфических сайтах. Затем определяют последовательность нуклеотидов в каждом из этих фрагментов. Очередность фрагментов в целой молекуле восстанавливают, используя перекрывающиеся концы идентичные цепи разрезают повторно другой рестриктазой, а затем последовательности перекрывающихся фрагментов, образующихся при обработке двумя рестриктазами разной специфичности, сравнивают. Так может быть реконструирована полная последовательность. В пределах отдельных фрагментов порядок нуклеотидов определяют с помощью специальных методов. Раньше секвенирование ДНК было весьма трудным делом, теперь же оно [c.131]

Создание автоматического пептидно-белкового секвенатора [1], его последующие усовершенствования и использование оказали большое влияние на методологию определения структуры белков. Вклад автоматических методов в изучение структуры белков можно оценить по быстрому росту накопленных данных о структурах [4—8]. Назрела необходимость создания компьютерных систем хранения и выдачи данных для того, чтобы можно было полнее использовать опубликованные последовательности аминокислот (прим. ред. в конце главы). [c.425]

Эту процедуру ступенчатого расщепления пептида с N-конца можно повторять многократно, идентифицируя последовательно одну аминокислоту за другой. Метод Эдмана используется в качестве химической основы для определения первичной структуры белков и пептидов. Он реализован в специальном приборе-секвенаторе (от англ. sequen e - последовательность), работающем в автоматическом режиме и позволяющем определить последовательность аминокислот с N-конца пептида до 50-60 аминокислотных остатков. [c.54]

Дендрограмма, показывающая связь между N-терминальными последовательностями аминокислот НА1, выведенными из геномных последовательностей вирусов, представляющих 13 известных подтипов. Последовательности были выстроены в ряд с использованием аминокислот, которые не изменяются в определенных положениях для всех последовательностей (положение аминокислоты от N-конца большинства подтипов Цис 4, Гли 6, Тре 18, Вал [c.149]

N-Koнцe вoй лизин дает а,е- бис-динитрофенильиое производное лизин, расположенный в середине цепи или на С-конце, дает е-моноди-нитрофенильное производное. Фенольная группа тирозина и имино-группа гистидина также реагируют с динитрофторбензолом, но образующиеся производные расщепляются в условиях кислотного гидролиза пептидной связи. Для определения последовательности аминокислот белок подвергают частичному гидролизу и определяют строение образовавшихся ди- и трипептидов анализом концевых групп. Если в гидролизате охарактеризованы все возможные дипептиды, то последовательность аминокислот в белке может быть однозначно определена без дальнейшего анализа концевых групп. [c.690]

Определение аминокислотной последовательности иммуноглобулинов привело к неожиданныхМ результатахМ. Одни участки молекул разных антител имеют сильно различающиеся последовательности (вариабельные участки), тогда как последовательность других участков у них почти не меняется (константные участки). Молекулу антитела можно в соответствии с этими данными разделить на участки, или домены. Вариабельные участки, у Ы-концов легких и тяжелых цепей, принято обозначать соответственно Уь и Ун, а константные участки — Сь и Сн- При исследовании Сн-участков было обнаружено, что приблизительно через 110 остатков большая часть аминокислотной последовательности повторяется. Константный участок тяжелой цепи молекулы IgG состоит из трех таких доменов (Сн1, Сн2 и СнЗ), аминокислотная последовательность которых весьма сходна. В молекуле IgM имеется еще и четвертый Сн-домен. Эти данные позволяют предполагать, что в процессе эволюционного развития иммуноглобулинов происходила последовательная дупликация короткого гена, кодирующего синтез последовательности приблизительно из 110 аминокислот. [c.383]

Благодаря работе Санжера были достигнуты большие успехи в установлении структуры ряда других гормонов, в частности адренокортикотропных гормонов (АКТГ) из передней доли гипофиза [100, 102]. Было установлено, что АКТГ имеют 39 аминокислотных остатков в нолипентидной цепи. Для установления последовательности аминокислот двумя группами исследователей были использованы различные протеолитические ферменты в сочетании с частичным кислотным гидролизом или без него. В первом случае после переваривания трипсином и химотрипсином были получены пептидные фрагменты, разделение которых достигалось с помощью электрофореза, противоточного распределения, ионообменной и бумажной хроматографии. Затем проводили определение последовательности аминокислот с помощью фенилизотиоциа-ната и метода динитрофенилирования для К-концевых аминокислот соответствующих пептидов, а также гидролиз карбоксипептидазой аминокислот с С-конца гормона. Таким образом была определена последовательность аминокислот для бычьего кортикотро-пина VI [103] [c.412]

К концу 60-х годов в молекулярной биологии сложилась парадоксальная ситуация. К тому времени были довольно хорошо разработаны методы определения последовательности аминокислот в белках (первый белок — инсулин, был расшифрован еще в самом начале 50-х годов). Банк белковых последовательностей быстро пополнялся все новыми текстами. Был полностью расшифрован генетический код — словарь для перевода ДНКовых текстов на белковый язык. Но вот парадокс не было прочитано ни одного ДНКового текста [c.64]

Ограничения метода 1) еполное присоединение С-конце-вой аминокислоты к бензильным группам полимера может приводить к образованию примесей, например при синтезе пента-пептида А —А А может быть образована цепь Д2—дз—Д4—Д5 (д.рд реакции второй аминокислоты с оставшейся 1В первой стадии бензильной группой. Эта реакция конкурирует со стадией Б 2) неполное присоединение М-защищенной аминокислоты к свободной аминогруппе (стадия Б) может привести к образованию сокращенных пептидов (например, А — Д2—ДЗ) и неправильной последовательности (например, А — Д2—Д4—Д5). 3) отсутствие аналитических методов определения примесей, которые могут применяться без отделения пептида от полимера. Такое определение может быть очень расточительным, требовать много времени и само по себе приводит к распаду продукта. [c.335]

К сожалению, метод с использованием динитрофторбензола применим ТОЛЬКО для определения нескольких первых от Н-конца аминокпслот. Для более отдаленных от конца аминокислот (начиная с шестой или седьмой аминокислоты от Н-конца) результаты анализа становятся настолько неоднозначнымн, что уже нельзя сделать надежного заключения о действительной структуре полипептида. Поэтому описанный метод можно использовать для определения последовательности аминокислот лишь в коротких полипептидах, состоящих из четырех или пяти аминокислотных остатков. Следовательно, для непосредственного анализа А- и В-це-пей инсулина длиной в 21 и 30 аминокислот этот метод неприменим, не говоря уже о последовательностях таких белков, как Р-галактозидаза и триптофан-синтаза, состоящих из сотен аминокислотных остатков. [c.89]

Реакция фенилизотиоцианата с аминогруппами белков очень похожа на соответствующую реакцию изоцианатов. Было найдено, что фенил-изотиоцианат можно применять для определения содержания аминных концевых групп в белках и последовательности аминокислот в полипептидах и белках в последнем случае проводят постадийное расщепление с аминного конца молекулы. Метод основан на специфической реакционной способности фенилизотиоцианата, который в среде пиридина реагирует с концевыми аминогруппами, образуя фенилтиокарбамилпептиды (ФТК-пептиды). Эти производные при нагревании с безводным хлористым водородом в среде нитрометана легко перегруппировываются, образуя фенил-тиогидантоин N-концевого аминокислотного остатка исходного белка. При нагревании со щелочью фенилтиогидантоин расщепляется, образуя свободную аминокислоту, которую можно идентифицировать, например. [c.370]

Хотя из литературных данных известно, что изучались различные химические методы определения С-концевых аминокислот [206], ни один из этих методов не обнаружил достаточно удовлетворительных результатов, которые давали бы основание к его широкому использованию. Поэтому наибольшее распространение получил способ, основанный не на химической, а на ферментативной реакции с карбоксипептидазой — ферментом, реагирующим лишь с теми пептидами, которые содержат свободную карбоксильную группу. Поскольку рассмотрение ферментативных реакций выходит за рамки настоящего раздела книги, реакция с карбоксипептидазой в данном изложении не описывается. Следует отметить, однако, что проблема развития химии белка настолько важна, что вполне оправданы постоянно продолжающиеся исследования, направленные на поиск и разработку удобных и с широкими возможностями применения химических методов. Было показано, что для установления последовательности аминокислот с С-конца белковой молекулы по крайней мере ограниченное применение могут найти три разных химических метода, так как они дают результаты, подтверждающие данные, получающиеся при использовании карбоксипептидазы. Речь идет о гидразинолизе, этерификации с последующим восстановлением сложноэфирной группы на конце молекулы в спиртовую, а также о реакции с неорганическим тиоци-анатом. [c.376]

Подробное изучение родства в последовательности для генов НА 43 штаммов вируса гриппа 13 известных подтипов было независимо проведено разными группами авторов 3, 53, 128]. Для этого определяли последовательности 300 нуклеотидов на З -конце 4-го сегмента РНК, кодирующ его НА. На рис. 18 представлена дендрограмма, построенная по методу расчета различий в выведенных последовательностях аминокислот. При определении полной последовательности генов НА1 и НА2 было показано, что они высокородственны i[55]. Однако различий для разных подтипов оказывается больше, чем для генов в пределах одного подтипа. Некоторые аминокислоты, в особенности остатки цистеина, полностью сохраняются у НА различных подтипов, что указывает на происхождение этих генов от одного прародителя [3]. [c.107]

Аминокислотные последовательности белков [51, 81]. Одним из основных достижений биохимии явилось определение аминокислотных последовательностей белков. Гомологичность аминокислотных последовательностей родственных белков стала очевидной вскоре после того, как в конце 1950-х и начале 1960-х гг. были разработаны методы секвенирования. С помощью этих методов была выявлена гомологичность разных, но функционально родственных белков одного и того же вида. По некоторым позициям эти последовательности, как правило, демонстрировали идентичность, а по другим различались. Из результатов изучения ряда вариантов гемоглобина человека в то время бьшо уже известно, что точковые мутации обычно приводят к замещению одной отдельной аминокислоты в полипептидной цепи. В ходе расшифровки генетического кода было показано, что такие замены вызываются замещением одного-единственного основания, происходапцим при транскрибировании цепи ДНК. Это открытие стимулировало выяснение эволюционных взаимосвязей между видами путем сравнения числа различий в аминокислотных последовательностях их гомологичных белков. В таких работах строились филогенетические деревья, которые могли сопоставляться с соответствующими схемами, полученными на основе классических палеонтологических и морфологических данных. Методы построения этих деревьев описаны многими авторами [51 1919 1921 1954]. [c.17]

Очевидно, что представленные структуры гомологичны друг другу, но проявляют при этом различные активности. Не только удаление части полипептидной цепи, но и замена одного аминокислотного остатка другим в пределах определенной аминокислотной последовательности может привести к изменению смысла сигнала на противоположный в частности, ингибирующий сигнал YY становится стимулирующим при замене нескольких аминокислот. В то же время некоторое удлинение пептида на С-конце позволяет существенно пролонгировать его действие при сохранении специфической активности, что было показано на примере АКТГ4 [о и тафцина (Пономарева-Степная и др., 1984 По-таман и др., 1992). Создается впечатление, что N-конец НП более семантически значим, чем участки его С-конца. [c.68]

Поскольку надежность определения аминокислотной последовательности снижается при приближении к С-концу пептида, рекомендуется выделить С-концевой (ые) фрагмент(ы) исходного соединения, проверив еще раз его аминокислотный состав, подвижрюсть в электрофорезе при pH 6,5 и полученные характеристики сравнить с ожидаемыми на основании имеющихся структурных данных. Погрешности в установлении С-концевой аминокислотной последовательности могут привести к неправильному соединению фрагментов и, таким образом, к значительным ошибкам при реконструкции полипептидной цепи. Разумно совместить в одном эксперименте контроль структуры С-концевой области пептида с идентификацией амидов дикарбоновых аминокислот. [c.358]

М. Krystal и соавт. [39] секвенировали клонированные кДНК-копии гена НА B/Lee/40. Полная последовательность НА была получена при помощи двух клонов, один из которых простирался от синтетического олигонуклеотида, использованного в качестве праймера при синтезе кДНК, до 1336 основных пар. Второй клон начинался с нуклеотида 483 и простирался до 5 -конца вирионной РНК, что облегчило определение полной последовательности. Общая длина составляет 1882 нуклеотида. Первый АУГ начинается в нуклеотиде 34, и в случае трансляции последовательности с этого инициирующего кодона предсказан белок из 584 аминокислот. N-терминальная последовательность начинается аминокислотой 16 [102]. Последовательность с 3-й по 15-ю аминокислоту неполярна и предположительно является сигнальным пептидом, как и у вирусов гриппа А [1, 22]. [c.276]

В настоящее время масс-спектрометры применяются для анализа последовательности аминокислот в олиГопептидах, получающихся в результате гидролиза белков или другим путем. Для повышения летучести пептиды ацетилируют и метилируют. Пептидные связи легко расщепляются при бомбардировке их электронами, причем фрагментация идет с С-конца пептидов. Поскольку все аминокислоты имеют разный молекулярный вес, то по разнице в массах, соответствующих двум соседним основным пикам на спектре, сразу же идентифицируется С-концевая аминокислота более тяжелого фрагмента. Для определения аминокислотной последовательности исходного иона по разнице между основными пиками на масс-спектрах применяются ЭВМ и составлены соответствующие программы. В настоящее время для такого анализа аминокислотной последовательности белков лимитирующей является стадия фракционирования гидрйлизата белка на отдельные олигопептиды. [c.182]

Другие методы определения последовательности расположения аминокислотных остатков в белковой молекуле основаны главным образом на использовании ферментов, способных ускорять реакции последовательного отщепления аминокислот либо с N-, либо с С-конца полипептидной цепи. Однако они не получили еще столь широкого распространения и аппаратурного оформления, как рассмотренные выше. В последние годы ведущее место в выяснении первичной структуры белков занял метод, который условно можно назвать генетическим он основан на выведении последовательности аминокислот в белковой молекуле исходя из структуры гена, кодирующего биосинтез этого белка. Именно так была расшифрована структура самых длинных полипептидных цепей—фактора VIII свертывания крови (2332 аминокислотных остатка) и субъединицы тиреоглобулина (2750 аминокислотных остатков). Нельзя не упомянуть также только что появившиеся сообщения об определении первичной структуры белков методом лазерной фотодиссоциации учитывая его высочайшую чувствительность (для анализа достаточно 5 нмоль белка при молекулярной массе 50 кДа), он, по-видимому, имеет большое будущее. [c.59]

В 1953 г. Фредерик Сэнгер (Sanger) определил последовательность аминокислот в белковом гормоне - инсулине (рис. 2.25). Эта работа представляет собой веху в развитии биохимии, ибо в ней впервые было показано, что белок имеет строго определенную последовательность аминокислот. Кроме того, это достижение послужило стимулом для других исследователей подвергнуть аналогичному анализу большое множество белков. И действительно, к настоящему времени установлена полная последовательность аминокислот у нескольких сотен белков. Самое поразительное, что каждый белок имеет уникальную, точно определенную последовательность аминокислот. В серии остроумных работ, проведенных в конце [c.26]

Смотреть страницы где упоминается термин Определение С-концевой последовательности аминокислот: [c.68] [c.116] [c.277] [c.41] [c.245] [c.91] [c.53] [c.70] [c.193] [c.193] [c.422] [c.42] [c.134] [c.86] [c.106] [c.120] [c.86] [c.106] [c.228] [c.134]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология