Клеточный цикл анализ

Анализ клеточного цикла в последние годы значительно упростился благодаря использованию детища современной электроники-флуоресцентного анализатора клеток. В этом сложном приборе клеточную суспензию пропускают через узкое отверстие со скоростью нескольких тысяч клеток в секунду, и оптические измерения производятся для каждой отдельной клетки, проходящей мимо маленького окошечка (см. ра щ. 4.3.1). При анализе асинхронной клеточной популяции клетки обрабатывают фиксатором, что приводит к остановке деления и делает клеточные мембраны проницаемыми. Затем клетки обрабатывают красителем, который может флуоресцировать лишь будучи связанным с ДНК. Интенсивность флуоресценции окрашенных таким [c.144]

Наиболее простой метод анализа клеточного цикла предложил Окада (Ока<1а, 1967). Этот метод помимо оценки продолжительности фаз клеточного цикла позволяет получить дополнительную информацию о количественном распределении клеток по фазам цикла. [c.138]

На синхронной популяции делящихся клеток можно более детально изучать химические изменения, происходящие в ходе клеточного цикла. При благоприятных для роста условиях общее содержание белка в типичной клетке на протяжении всего цикла увеличивается более или менее непрерывно (рис. 13-7). Синтез РНК тоже происходит с постоянной скоростью, за исключением М-фазы, когда конденсация хромосом, видимо, препятствует транскрипции, так что синтез РНК почти не идет, а образование белка снижается. Анализ синтеза индивидуальных белков (рис. 13-8) показывает, что подавляющее большинство их синтезируется в течение всего цикла. Таким образом, в процессе роста клетки большая часть ее компонентов образуется постепенно и непрерывно - их синтез ненадолго прекращается лишь во время разделения клетки на две. [c.399]

Дрожжевые мутанты сйс могут быть использованы для анализа сопряжения меаду событиями клеточного цикла [c.410]

Индивидуальные клетки, делящиеся в культуре, можно непрерывно наблюдать с помощью цейтраферной киносъемки. Такие наблюдения показывают, что даже у генетически идентичных клеток длительность цикла весьма изменчива (рис. 13-24). Количественный анализ показывает, что время от одного деления до следующего содержит случайно меняющуюся компоненту, причем изменяется она главным образом за счет фазы Gl. По-видимому, по мере того как клетки приближаются к точке рестрикции в GJ (рис. 13-25), они должны некоторое время выждать , прежде чем перейти к оставшейся части цикла, причем для всех клеток вероятность в единицу времени пройти точку R примерно одинакова. Таким образом, клетки ведут себя подобно атомам при радиоактивном распаде если в первые три часа через точку R прошла половина клеток, в следующие три часа через нее пройдет половина оставшихся клеток, еще через три часа - половина тех, что останутся, и т. д. Возможный механизм, объясняющий такое поведение, был предложен ранее, когда речь шла об образовании активатора S-фазы (разд. 13.1.5). Однако случайные изменения длительности клеточного цикла означают, что первоначально синхронная клеточная популяция через несколько циклов утратит свою синхронность. Это неудобно для исследователей, но может быть выгодно для многоклеточного организма в противном случае большие клоны клеток могли бы проходить митоз одновременно, а поскольку клетки во время митоза обычно округляются и утрачивают прочную связь друг с другом, это серьезно нарушало бы целостность ткани, состоящей из таких клеток. [c.417]

Хотя клетки проводят большую часть своей жизни в интерфазе и только изредка находятся в фазе деления, большинство ранних работ по клеточному циклу было посвящено анализу именно этих коротких периодов клеточного деления (митоза и цитокинеза)-в основном потому, что они доступны для прямого микроскопического исследования. Относительно недавно благодаря использованию более тонких непрямых методов мы сравнительно многое узнали и об интерфазном периоде. В этой главе мы опишем некоторые методы, применяемые в настоящее время для исследования клеточного цикла, рассмотрим регуляцию этого цикла и познакомимся с важнейшими событиями, происходящими в каждой из его фаз. Хотя наши знания о молекулярных основах клеточного цикла довольно фрагментарны, там, где это возможно, мы постараемся обсудить и вероятные механизмы интересующих нас процессов. [c.139]

Рис. 10.12. Графический анализ клеточного цикла. Культуры клеток комара Aedes albopti us в чашках Петри диаметром 5 см регулярно анализировали для установления продолжительности времени удвоения (принимаемого за время генерации). После установления экспоненциального роста культуры к клеткам добавляли Н-тимидии и колцемид и клетки продолжали инкубировать для определения процента меченых клеток, митотического индекса и <02. Способ построения графика указан в тексте (см. разд. 10.7,4).

Анализ клеточного цикла [c.133]

На рис. 19 представлен анализ в градиенте сахарозы различных классов РНК, выделенных через равные промежутки времени в течение одного клеточного цикла. Первое, что бросается в глаза, — это значительный синтез [c.45]

Мутации, специфически влияющие на отдельные компоненты механизма клеточного цикла, нельзя обнаружить по одной лишь утрате способности мутантных клеток к делению, так как к этому будет приводить любой летальный дефект. Мутации цикла клеточного деления Ыс-се11-ё1у181оп-еуе1е) более достоверно выявляются по тому, как они блокируют или нарушают специфическую фазу клеточного цикла при пермиссивной гемпературе (рис. 13-18). У почкующихся дрожжей наличие и размеры почки служат простым визуальным индикатором, показывающим, какой )тап клеточного цикла блокирован у данного мутанта с(1с в случае делящихся дрожжей нужны более сложные подходы с использованием методов анализа клеточного цикла, о которых говорилось выше. [c.410]

В описанных выше экспериментах (рис. 16, 22, 28 и др.) была сделана попытка сопоставить особенности клеточной кинетики с количественными данными, получаемыми при анализе очищенных фракций макромолекул. Мы стремились создать модель, которая отражала бы осуществление основной схемы ДНК—>-РНК—>-Бе-лок в связи с хронологией клеточного цикла в нормальных условиях и при вирусной инфекции, литической и онкогенной. Полученная модель свидетельствует, по-видимому, о наличии ряда закономерностей, управляющих, если можно так выразиться, геометрией внутреннего мира эукариотической клетки (рис. 28). Протекающие в клетке процессы были рассмотрены в связи с проблемами генетической инженерии и химиотерапии рака. Что касается практического выхода подобных исследований, нельзя отрицать, что здесь существует ряд сложностей 95—100]. Так, попытки встроить чужеродный геном в геном клетки могли бы привести к изменению нормальных процессов развития живой системы. Это, вероятно, могло бы быть использовано не только в интересах человека, его здоровья и существования, но и против него. И хотя этические проблемы еще не могут быть решены однозначно, мы должны не только изучать внутренний мир клетки и действующие в нем закономерности, но и исследовать перспективы изменения этого мира в направлении, полезном для человека. [c.87]

В последние годы компартментальный анализ становится все более распространенным методом исследования биологических явлений и процессов. Хотя в настоящее время нельзя указать достаточно полных источников, освещающих проблемы компартментального моделирования (книги [265, 317], к сожалению, охватывают далеко не все интересующие специалистов в области биокибернетики и исследования биосистем проблемы компартментального анализа), можно упомянуть ряд публикаций, касающихся как общих проблем компартментального моделирования (см., например, [296, 345, 350, 353]), так и ряда частных применений. Среди последних есть как задачи традиционного плана — биохимические, экологические или фармакологические [314, 321, 346], так и задачи нового типа — такие, как моделирование клеточного цикла [318]. Наиболее близким к проблемам компартментального моделирования справочным пособием можно, по-видимому, считать обзор [344]. [c.186]

Одно из наиболее эффективных применений ПЦМ получила в исследованиях по клеточной кинетике. Различают статический и динамический ПЦМ-анализ параметров клеточного цикла. Основой статического метода является ДНК-гистограмма (рис. 2), форма которой определяется соотношением клеток в фазах С , 5 и 62+М клеточного цикла. Простейший метод обработки гистограмм заключается в следующем находят максимумы пиков Gi и 02- -М, подсчитывают число клеток (площадь) в гистограмме слева от канала, соответствующего максимуму С, (Л ), а также число клеток справа от канала, соответствующего максимуму 02+М (лг), определяют доли клеток в разных фазах [c.141]

B. Изобразите, пользуясь рис. 7-20, каких результатов можно ожидать при последующем анализе ядерной ДНК. Исходите из того, что фаза синтеза ДНК-8-фаза-занимает в клеточном цикле 5 ч, [c.96]

Все процессы, происходящие в клетке, находятся под генетическим контролем. Не составляют исключения клеточный цикл и митоз. Гены контролируют последовательные стадии-реяликации ДНК, цитокинез, движение, спирализацию-деспирализацию хромо- oSTHT д. Мутации этих генов могут прерывать клеточный цикл на различных этапах. Благодаря этому для исследования клеточного цикла и митоза можно применить генетический анализ. [c.62]

В. Анализ ядерной ДНК должен показать пик изменения плотности в период между 15 и 20 ч и очень небольшие сдвиги в плотности радиоактивной ДНК при более коротких промежутках между введением двух меток (рис. 7-30). Поскольку ядерная ДНК реплицируется в особой S-фазе клеточного цикла, то при добавлении Н-тимидина будут метиться только те клетки, которые находятся в этой фазе цикла. Ядерная ДНК в меченых клетках не будет реплицироваться вновь, пока клетки не пройдут весь клеточный цикл и не вернутся в S-фазу. Если клетки были помечены Н-тимидином на стадии окончания S-фазы, то они опять достигнут S-фазы через 15 ч (или около этого)-именно в это время их плотность может измениться при инкубации с БУДР. Если клетки во время мечения находились в начале S-фазы, они войдут снова в S-фазу не раньше, чем через 20 ч. Изменение плотности меченой ядерной ДНК действительно обнаруживается в интервале между [c.358]

A. Неправильно. Ценность дрожжей как объекта для изучения клеточного цикла состоит главным образом в том, что с их помощью можно проводить углубленный генетический анализ проблемы. Они предоставляют уникальную возможность идентифицировать, клонировать и характеризовать гены, участвующие в регуляции клеточного цикла. [c.475]

Анализ данных различных исследований, в которых были использованы синхронизированные эмбриональные бластомеры в качестве ядер доноров, показывает, что донорские клетки на поздних стадиях G2 или ранней G-1 клеточного цикла являются наиболее пригодными для повышения эффективности развития (Kwen О.Y. et al., 1996). [c.226]

Дальнейшее упрощение анализа клеточного цикла состоит в использовании большой популяции культивируемых клеток, одновременно проходящих одни и те же фазы клеточного цикла Такие синхронные клеточные популяции можно получать разными способами. Самый ранний метод состоял в вьщерживании клеток в растворе вещества, нарушающего определенную стадию клеточного цикла длительное пребывание культуры в таком растворе приводит к тому, что все клетки останавливаются на этой стадии, а после снятия блокады возобновляют цикл и проходят его синхронно. Однако в ходе клеточного цикла параллельно осуществляется много различных процессов, и вряд ли все они будут блокироваться одновременно. Поэтому было бы лучше по возможности применять такие методы получения синхронных популяций, которые не нарушают нормальное прохождение клеточного цикла. Для большинства клеток млекопитающих самый простой и лучший [c.398]

Дрожжи являются одноклеточными грибами и составляют большую группу довольно разнородных организмов. Поскольку они размножаются почти так же быстро, как бактерии, и размеры их генома меньше 1/1000 генома млекопитающих, они оказались чрезвычайно полезными для генетического анализа клеточной биологии эукариот. Хотя яйца Хепорш-шкшочшсльно ценный объект для изучения биохимических и цитофизиологических аспектов регуляции клеточного цикла, для генетических исследований этот объект неудобен. Напротив, работа с дрож- [c.407]

Метафаза занимает значительную часть периода митоза (см. рис. 13-43), как будто клетки выжидают, пока все их хромосомы не расположатся надлежащим образом в экваториальной плоскости. Некоторые эксперименты подкрепляют это представление. Многие клетки останавливаются в митозе на несколько часов или дней, если их обработать такими агентами, как колхицин или винбластин, деполимеризующими микротрубочки в самом деле, этот способ остановки клеточного цикла широко используют, когда нужно получить большое количество митотических клеток для цитологического анализа их конденсированных хромосом (разд. 9.2.3). После удаления агента митотическое веретено быстро регенерирует, и нередко нормальный митоз возобновляется, как только хромосомы правильно расположатся в метафазной пластинке. Высказывалось предположение, что хромосома с неприсоединенным кинетохором служит источником диффундирующего фактора, который в норме задерживает переход к анафазе, предоставляя дополнительное время для правильного присоединения Если такой фактор существует, то при воздействии агентов, разрушающих веретено, следует ожидать появления мощного сигнала, приводящего к продлению метафазы. [c.450]

Выбор метода зависит от цели эксперимента. В ряде случаев бывает целесообразно проводить начальную стадию эксперимента (например, мечение изотопами) на несинхроннзированной, экспоненциально растущей культуре и затем отбирать для ферментативного анализа клетки на определенной фазе клеточного цикла, используя, например, зональное центрифугирование. В экспериментах такого рода отобранные клетки, как правило, далее не культивируются, так что их можно подвергать различным повреждающим воздействиям окружающей среды. [c.146]

Наиболее адекватной тест-системой должна служить культура клеток человека, в которой учитывают хромосомные аберрации и обмены между сестринскими хроматидами, современный метод анализа которых предложили в 1972 г. А. Ф. Захаров и Н. А. Его-лина. При репликации хромосом лимфоцитов периферической крови человека в присутствии 5-бромдезоксиуридина (БДУ) этот аналог включается на место тимидина. Если БДУ дают только в течение одного клеточного цикла, то меченой после второго цикла будет только одна хроматида из двух (см. гл. 6), если же БДУ находится в среде в течение двух клеточных циклов, то мечеными к концу второго цикла будут обе хроматиды (рис. 21.2) одна по обеим комплементарным цепям ДНК, а другая только по одной. Собственно обнаружить различие хроматид (содержащих тимидин и БДУ) удается только с помощью красителей азур-эозина, красителя Гимза, акридинового оранжевого и др., а также при исследовании флуоресценции хромосом с БДУ. После окраски акридиновым оранжевым хроматиды, не содержащие брома, светят в зеленой части спектра, а включившие бром —в красной. [c.536]

Участие циклических нуклеотидов в процессах роста, дифференцировки и малигнизации не может быть определено в таких исследованиях. При отсутствии каких-либо изменений размера клеток расчет уровня цАМФ на единицу массы белка представляется наиболее целесообразным. Данные, основанные на содержании ДНК, могут быть достоверными только в том случае, если распределение клеток по стадиям клеточного цикла в нормальных и трансформированных тканях или культурах сходно, а также если число хромосом диплоидно как в нормальных, так и в трансформированных клетках. Этот вопрос становится принципиально важным при анализе уровня циклических нуклеотидов в опухолевой ткани 1п у уо, где распределение клеток по стадиям клеточного цикла значительно изменяется в зависимости от участка опухоли. В фибробластах, вероятно, существуют изменения аденилатциклазы, связанные с трансформацией, тогда как в других трансформированных клетках (нейробластоме, лейкозе, лимфоме) повышение цАМФ-фосфоди-эстеразной активности может быть одним из ранних проявлений малигнизации нервных клеток. Это позволяет сделать вывод, что в некоторых типах клеток регуляторный ген цАМФ-фосфодиэстеразы может быть более чувствительным к мутационным изменениям, ведущим к трансформации и далее к малигнизации. [c.241]

Краситель Хёхст 33258 флуоресцирует в диапазоне 410— 480 нм после возбуждения ультрафиолетом с длиной волны 315 нм. Он специфически связывается с парами оснований тп-мин — аденин и специфичен, следовательно, не только к ДНК, но и к присутствию тимидина. При анализе клеточного цикла инкубация клеток с БУДР приводит к замене тимидина в новообразованной ДНК на БУДР. Клетки, прошедшие 5-фазу, остаются по содержанию тимидина такими же, как и диплоидные клетки после деления они дают на гистограмме новый пик, соответствующий половинному содержанию тимидина в диплоидных клетках. [c.206]

I. Кратковременные культуры (4—24 ч). Кратковременное поддержание клеток в суспензии для анализа чувствительности к препаратам возможно для клеток из любого источника. Если клетки получены из биопсийного материала опухоли человека, то тест-система имеет ряд теоретических преимуществ способность к росту не является лимитирующим фактором, поскольку рост в этой системе не требуется разрастание клеток стромы и клональный отбор сведены к минимуму, так что результаты могут быть получены быстро, что особенно важно, если испытание проводится с клиническими целями. Метод получил широкое использование в ФРГ при изучении чувствительности к ряду химиотерапевтических препаратов различных типов опухолей [13, 14]. Модифицированный метод с использованием либо клеток, либо фрагментов тканей был применен Силвестрини с сотрудниками [10] также для различных типов опухолей. В обоих вариантах исследовали включение нуклеотидов, меченных тритием, в ДНК или РНК. Ограничения этого метода заключаются главным образом в короткой продолжительности опыта это исключает возможность длительного воздействия лекарственных средств в течение одного или нескольких клеточных циклов. Следовательно, этим методом нельзя исследовать обратимость действия лекарства и остаточную цитотоксичность, что существенно ограничивает круг исследуемых препаратов. Было показано, что при использовании этой тест-системы получаются ложно-отрицательные результаты действия адриамици-на [14], хотя имелись сообщения об успешном применении системы при анализе действия других лекарств с иными механизмами действия [10]. [c.260]

Обычная техника гибридизации in vitro обеспечивает получение усредненных показателей для ткани-мишени в целом. Это затрудняет интерпретацию результатов, полученных на смешанной популяции клеток разных типов, или на популяции клеток одного типа, неоднородных, например, по стадии дифференцировки, или по положению в клеточном цикле при асинхронной пролиферации, или по другим показателям. Техника гибридизации in situ позволяет в известном смысле преодолеть эти проблемы, поскольку полученные результаты относятся к индивидуальной клетке и даже к индивидуальной хромосоме. Комбинация гибридизации с цитологическим исследованием позволяет получить дополнительную информацию о локализации молекулярного гибрида в той или иной структуре ткани-мишени. И наконец, этот метод пригоден для анализа небольшого числа клеток. [c.304]

Б. За исключением митоза, хорошо видимого в световом микроскопе и продолжающегося около 1 ч, определение длительности фаз клеточного цикла требует тщательного экспериментального анализа. В одном из таких экспериментов к асинхронно растущей клеточной популяции (со случайным распределением по клеточному циклу) добавляли Н-тимидин, затем через определенные промежутки времени клетки окрашивали и готовили для радиоавтографии. Клетки, включившие Н-тимидин, засвечивали фотоэмульсию, и над ними появлялись зерна серебра. На рис. 13-2, А изображена зависимость относительного количества меченых митотических клеток от времени, прошедшего после добавления Н-ти-мидина. На рис. 13-2, Б представлен график зависимости среднего числа зерен серебра над митотическими клетками от времени после добавления Н-тим ина. На основе этих данных и другой информации, содержащейся в задаче, определите продолжительность фаз 01, 8 и Оз клеточного цикла Ь-клеток мыши и объясните ход своих рассуждений. [c.239]

В отличие от точковых мутаций перестройки хромосом относят к структурным мутациям. Перестройки могут быть спонтанными и индуцированными. Поскольку такие мутации затрагивают значительные участки хромосом, они изменяют их морфологию, что удается обнаружить под микроскопом. При анализе перестроек исходят из того, что хромосома на протяжении клеточного цикла может быть дихроматидной (период 0 , [c.171]

Динамический ПЦМ-анализ параметров клеточного цикла рассматривает изменения во времени формы ДНК-гистограммы либо при блокировании движения клеток по циклу в определенной его фазе, обычно в фазе митоза, с помощью колхицина, колцемида или винкристина (статмокинетический метод) [32, 33], либо при блокировании (обычно путем замены тимидина на БДУ) с определенного момента окраски вновь синтезируемой ДНК [34]. В результате появляется возможность проследить динамику прохождения клетками отдельных фаз клеточного цикла, определить их продолжительность в абсолютных единицах времени, а также вычленить долю непролиферирующей субпопуляции (пропись № 6). [c.142]

Изучение генетической системы сЬескрош1-регуляции часто основывается на совокупном анализе эффектов, относящиеся как к остановке клеточного цикла, так и к чувствительности клеток к повреждающим агентам. Для формирования адекватных представлений о функциях he kpoint-генов представляются, однако, целесообразными также раздельное рассмотрение и систематическое сопоставление сведений о характере генных взаимодействий, полученных при использовании каждого из указанных критериев. Имея это в виду, мы анализировали влияние парных сочетаний мутаций в генах, опосредующих различные этапы he kpoint-контроля, на чувствительность дрожжевых клеток к у-излучению. [c.100]

Таким образом, первоначальная попытка идентифицировать гены дрожжей, отвечающие за высокую спонтанную г/го--мутабильность, привела нас к получению мутаций в ядерных генах, которые, по всей вероятности, занимают узловые позиции в системе координированной регуляции генетической стабильности, смены фаз клеточного цикла и радиочувствительности. Современные достижения геномики существенно облегчили идентификацию этих генов. Представляются целесообразными как дальнейший детальный анализ уже обнаруженной регуляторной роли генов SRM, так и выявление и исследование функций этих генов применительно к таким, например, существенным аспектам генетической регуляции, как метаболическая индукция/репрессия и сайленсинг. [c.103]

В дальнейшем различается были созданы микроматрицы с нанесенными в строгом порядке образцами ПЦР-фрагментов кДНК для сотен и тысяч известных генов человека и других организмов. Часто создают специализированные микроматрицы для анализа экспрессии определенных типов генов контролирующих клеточный цикл, апоптоз, сплайсинг, трансляцию, синтез цитокинов, комплемента, факторов свертывания крови, факторов транскрипции и др. Например, Т. Шенк с сотрудниками (1998 г.), используя четыре микрочипа, содержащих в сумме фрагменты кДНК для 6600 генов человека, изучили на первичной культуре фибробластов кожи человека, как инфицирование цитомега-ловирусом человека влияет на экспрессию этих генов. Оказалось, что данная вирусная инфекция достоверно изменяет (увеличивает или уменьшает) экспрессию 258 генов. [c.55]

У дрожжей-сахаромицетов подробно изучен клеточный цикл развития (рис. 12.1). Клетки S. erevisiae делятся почкованием. Вегетативные клетки штаммов, выделяемых из природных образцов или используемых в производстве, как правило, диплоидны. При определенных условиях в них происходит мейоз, и диплоидная клетка превращается в аск с четырьмя гаплоидными аскоспорами, окруженными общей оболочкой. Эти структуры называют тетрадами. (В лабораторных условиях споруляцию инициируют перенесением диплоидных клеток в среду, содержащую ацетат натрия.) Оболочку аска можно разрушить механически или ферментативно и с помощью микроманипулятора при наблюдении в микроскоп разъединить ас-коспоры. После прорастания каждая спора дает начало отдельному гаплоидному клону со специфическим генотипом и фенотипом. Данный подход, называемый тетрадным анализом, позволяет методически просто выяснять, локализован ли изучаемый генетический маркер на хромосоме или он входит в состав внехромосомных генетических элементов. Хромосомные гены дают картину расщепления в соответствии с классическими законами генетики, а внехромосомные признаки, как правило, не расщепляются в мейозе. [c.287]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология