Преципитации метод также

В практическом отношении антитела преимущественно применялись для решения проблем идентификации и количественного определения веществ. Здесь имеется в виду использование белков как природных маркеров некоторых сырьевых материалов с целью распознавания их в продуктах питания для контроля качества. С этой целью изготовлены специфические иммунные сыворотки этих белков. Так, например, методы преципитации в геле послужили для обнаружения в пшеничной муке примесей ячменной муки [76] или в муке из твердой пшеницы примесей муки из мягкой пшеницы [90, 91]. Они могут быть использованы также для проверки отсутствия клейковины в кормовых рационах [7]. В такой стране, как ФРГ, где законодательство разрешает использовать в производстве пива только солод из ячменя и хмель, исключая особенно зерно риса и кукурузы как более дешевые источники крахмала, для контроля поступающего в продажу пива применили метод иммунохимической идентификации [98]. Иммунохимический подход (метод преципитации и RIA) также использовали для контроля запрещаемых законом в некоторых странах добавок в пиво препаратов протеаз как средства стабилизации [32]. В этих двух последних случаях проблема распознавания сложна, поскольку изготовление пива предусматривает вспенивание сусла при перемешивании, пастеризацию при стерилизации, т. е. происходит в условиях денатурации белков. Задача распознавания денатурированных бел- [c.112]

Иммунохимические методы, основанные на реакции преципитации, очень удобны для качественного и количественного анализа белков, для определения гомогенности белковых препаратов и наличия в них примесей, а также для идентификации компонентов белковых смесей. Как вспомогательный метод реакция преципитации применяется для изучения структуры белка. Преимущество этого метода по сравнению с другими состоит в том, что он может быть использован тогда, когда нельзя провести количественный химический анализ, например при определении данного компонента в смеси белков. Именно в этих случаях результаты, полученные с помощью иммунохимических реакций, могут быть очень полезны. [c.17]

Метод иммуноэлектрофореза позволяет сравнивать между собой не только смеси белков (антигены) с помощью данной иммунной сыворотки, но также и иммунные сыворотки с помощью данного антигена. Для такого исследования в пластинке агарового геля вырезают две параллельные канавки, а между ними на расстоянии 3 мм от края каждой делают лунку для образца. В нее вносят раствор определенного белка и, проведя электрофорез, заполняют канавки сравниваемыми иммунными сыворотками. Полосы преципитации, которые появляются с обеих сторон от нанесенного образца, позволяют сопоставлять исследуемые иммунные сыворотки. [c.148]

До настоящего времени гель-фильтрация в тонком слое находила применение главным образом при разделении белков. Разработаны модификации метода, сочетающие гель-фильтрацию с электрофорезом и иммунной преципитацией. Настоящая глава посвящена методическим аспектам тонкослойной гель-фильтрации, некоторым приложениям метода, а также указанным модификациям. Большое внимание, уделяемое разделению белков, отражается и в подборе конкретных примеров. Однако это не означает, что область применения метода ограничивается этой группой веществ. [c.256]

Иммунодиффузию в агаре можно проводить по методу Хансона [14]. После гель-фильтрации на пластинках 10-20 см гель сефадекса удаляют механическим путем, оставляя только полоску шириной 3—5 см, содержащую разделяемые белки. Затем пластинку заливают расплавленным агаром (охлажденным до 50 °С), который при застывании образует гель толщиной 1 мм. При аккуратном выполнении этой операции агар покрывает полоску сефадекса, не нарушая слоя. Таким путем удается получить хорошие зоны преципитации, однако следует заметить, что эта методика требует большого экспериментального навыка. Иммунодиффузию в геле агара можно также выполнять после переноса белков на ацетилцеллюлозные мембраны [57] или полоски фильтровальной бумаги [13]. Полоски помещают на агаровый гель, где осуществляют иммунодиффузию. [c.271]

Зоны можно также сфокусировать в результате наложения молекулярно-ситового эффекта, например, если электрофорез ведется в полиакриламидном геле, то в результате влияния градиента плотности. При проведении электрофореза биополимеров все чаще используются принципы аффинности и иммунной преципитации. Контролировать ход электромиграционного разделения с высоким разрешением удобно с помощью метода двумерного электрофореза и иммунной преципитации. [c.283]

С помощью иммунохимического метода, включающего анализ специфических преципитатов для различных компонентов групповых веществ [48], было доказано, что значительная часть группового вещества действительно соединяется с антителом, и, следовательно, групповая активность не связана с неизвестными примесями, находящимися в выделенных препаратах. Метод преципитации также можно использовать для получения данных о чистоте и гомогенности изолированных групповых веществ [29]. [c.171]

Существуют три основных направления исследований, с помощью которых можно установить, какие именно группы ответственны за специфичность групповых веществ. Первое включает использование непрямых методов торможения реакции преципитации и гемагглютинации и специфического подавления простыми сахарами и олигосахаридами известной структуры некоторых ферментов, действующих в обычных условиях на групповые вещества. Второй метод, ферментативный, позволяет выяснить химические изменения, происходящие в групповых веществах при нарушении их серологической специфичности под действием определенных ферментов. Третий метод заключается в выделении и идентификации серологически активных фрагментов из продуктов частичного гидролиза макромолекул. Последний метод дает также сведения о строении фрагментов углеводных цепей, не связанных с групповой специфичностью. Более ограниченные сведения относительно строения групповых веществ дают обычные химические методы периодатного окисления [110, 111[ и метилирования [112]. [c.179]

В классическом методе иммуноэлектрофореза в агаровом геле сочетание электрофореза с иммунодиффузией дает большое увеличение числа различаемых компонентов, хотя степень разрешения электрофореза при этом не повышается. В сыворотке человека таким путем можно обнаружить 20—30 компонентов в зависимости от качества применяемой антисыворотки. Линии преципитации соответствуют индивидуальным белкам, а не группам белков с одинаковой подвижностью. Обычно иммуноэлектрофорез рассматривают как источник качественной информации о белковом составе сыворотки. И действительно, он служит наиболее эффективным способом обнаружения недостаточности того или иного белка и изучения свойств моноклональных иммуноглобулинов. Описан также полуколичественный метод определения белкового состава сыворотки с применением иммуноэлектрофореза [8, 80]. Более удачным решением пробле- [c.335]

Несмотря на то что методы преципитации в геле занимают значительное место в изучении и количественном определении антигенов, а также широко применяются для контроля специфичности и определения титра преципитирующих антител, предел чувствительности данных методов составляет около 5 мкг/мл, и их невозможно использовать для количественного определения антигенов небольшой мол. массы, которые образуют только нерастворимые комплексы. По этой причине возникла необходимость в разработке альтернативных методов количественного определения антигенов. В 1945 г. Кумбс и сотр. [c.12]

Чувствительность метода поднимается двояко. Во-первых, это. возможность по данной калибровочной кривой уловить различия 1в концентрациях образцов. Результат зависит от того, с какой ошибкой найдены точки кривой, а также от ее наклона н линейности. Во-вторых, чувствительность определяется минимальным количеством антигена или антител, которое можно определить данным методом. В РИД этот параметр зависит от размера лунок, случайных ошибок, а также от того, насколько ВИДИМЫМИ и четкими получились кольца преципитации при небольших концентрациях образцов. [c.215]

Предельное разбавление антисыворотки, при котором еще удается наблюдать кольца преципитации (при подобранной оптимальной концентрации раствора антигена), характеризует содержание специфических антител в сыворотке это разбавление называют титром антител. Таким образом, указание на то, что титр антител в антисыворотке равен 1000, означает, что при разбавлении антисыворотки крови иммунизированного животного в тысячу раз данный метод в указанных условиях позволяет обнаружить эти антитела по образованию колец преципитации. Очевидно, что эта характеристика — не строго количественная, ведь из нее нельзя вычислить количество микрограммов антител, содержащееся в одном миллилитре сыворотки. Однако для целей наблюдения за ходом развития иммунного ответа метод вполне пригоден. Из изложенного следует также и то, что указание титра антител в антисыворотке не имеет смысла без уточнения метода, которым этот титр определялся. [c.119]

Применение химических методов концентрирования н очистки вирусов основано на преципитации вирусных частиц под действием химических реагентов, К этой группе методов можно отнести также методы ферментативной обработки, с помощью которых гидролизуются балластные белки и свободные нуклеиновые кислоты в процессе очист ки. Применение химических методов для концентрирования и очистки вирусов животных может быть успешным только для определенных групп вирусов, устойчивых к химическим реагентам. [c.45]

Серологическое и аллергологическое исследования. При шистосомозах иммунодиагностика дополняет микроскопическое исследование, но в качестве самостоятельных методов диагностики ее применять не рекомендуется. Практическое значение имеют РИФ, РСК, ИФА, РП, РГА, а также внутрикожная проба, реакция флоккуляции на предметном стекле, реакция кольцепреципитации, реакция преципитации вокруг яйца шистосомы, реакция агглютинации церкариев, реакция иммобилизации мирацидиев и др. Для исследования необходимы гепаринизированная кровь (не менее 1 мл) и [c.393]

Гаптенное ингибирование представляет собой достаточно простой метод определения относительной стабильности приципитатов, образованных конканавалином А и рядом полисахаридов. Мерой стабильности служит число микромолей метил-а-в-маннопиранозида, вызывающее 50%-ное ингибирование реакции преципитации с данным полисахаридом. Стабильность преципитатов, несомненно, связана с такими особенностями структуры молекулы полисахарида, как природа и относительное количество терминальных невосстанавливающих гликозильных остатков, а также длина боковых цепей. Если боковые цепи полисахарида содержат по одному моносахаридному остатку, комплекс конканавалина А с этим полисахаридом очень легко диссоциирует под действием метил-а-о-маннопиранозида. [c.96]

В опытах по иммунодиффузии раствор исследуемого препарата отделен от антисыворотки зоной геля, в который и препарат, и антисыворотка могут диффундировать (двойная диффузия). По другому способу раствор антигена диффундирует в гель, в котором уже находятся антитела (одиночная диффузия). С течением времени концентрация реагентов становится достаточно высокой для специфической преципитации, и в том месте, где это произошло, линия или полоса преципитации становится видимой. В общем случае каждая система антиген — антитело образует отдельную полосу. Для решения специфических вопросов преципитации разработано большое число различных экспериментальных приспособлений двойную диффузию обычно проводят в чашках Петри или (в меньших масштабах) в тонкой пленке геля на предметном стекле. Полосы можно сделать более заметными путем окрашивания. Одиночную диффузию удобнее проводить в маленьких вертикальных трубочках. Недавно Охтерлони [68] опубликовал обзор с исчерпывающей библиографией, охватывающей все аспекты иммунодиффузионного анализа. Очищенный препарат следует проверить в опытах по одномерной или двумерной диффузии при возможно большем числе концентраций препарата [69]. Появление одиночной полосы с обеими антисыворотками является доказательством гомогенности препарата. Однако гомогенный препарат не обязательно должен давать одиночную полосу. Имеется несколько причин, которые могут вызвать образование двойной полосы и в случае гомогенного антигена. Это может объясняться недостаточным контролем температуры или осаждением, напоминающим кольца Лизеганга, при использовании определенных типов антител, если применяется очень сильная неразбавленная антисыворотка. Более того, установлено, что гомогенный антиген, имеющий несколько антигенных детерминантов, может дать несколько полос преципитации. Эти вопросы обсуждены Кроуле [70] и Фингером [71]. Тем не менее гетерогенность является наиболее обычной причиной двойных или множественных полос нрецииитации. Следует иметь в виду, что неантигенные компоненты нельзя определить этим методом, и нужно также отметить, что примеси, дающие перекрестную реакцию, не будут найдены, если их скорость диффузии меньше, чем у гомологичного антигена [72]. Это обычно не вызывает осложнений, за исключением случаев, когда компонент, дающий перекрестную реакцию, сам является довольно сильным антигеном и может порождать свое собственное антитело, [c.53]

Детали этого метода описаны Кабатом и Мейером [66, 77]. Если можно получить сильные осаждающие антисыворотки, химический анализ преципитата гликопротеин — антитело может дать полезные сведения. Если гликонротеин гомогенен, то весь его гексозамин, гексозы, фукоза и сиаловые кислоты должны быть найдены в иммунном осадке (после поправки на растворимость осадка и если антитело присутствует в избытке). Ценность этой методики для гликонротеинов ясна в противоположность простым белковым антигенам гликонротеины могут содержать значительные количества таких легко определяемых компонентов, которые иммунный у-глобулин содержит только в небольших количествах [78—81]. Естественно, если препарат содержит несколько антигенных компонентов и антисыворотка содержит антитела ко всем этим компонентам, количественный анализ преципитации может указывать на гомогенность, хотя образец загрязнен. При таких обстоятельствах полная кривая осаждения даст большую информацию, и ингибирование осаждения низкомолекулярными веществами (если они доступны) также иногда можно использовать, чтобы отличить гомогенные препараты от гетерогенных. [c.54]

Высокая степень иммунологической специфичности молекул групповых веществ обусловлена генетическим контролем их биосинтеза. Все имеющиеся данные свидетельствуют о том, что специфичность групповых веществ определяется последовательностью сахаров на нередуцирующих концах углеводных цепей. Таким образом, групповые вещества крови — великолепный объект не только для изучения взаимосвязи между структурой углевода и иммунологической специфичностью, но и для выяснения путей, по которым идет образование этих структур под влиянием генов. Иммунологические свойства групповых веществ и их зависимость от структуры изучаются с помощью специальных методов, таких, как торможение реакции гемагглютинации и преципитации простыми сахарами и торможение активности ферментов, участвующих в деградации групповых веществ. Эти методы позволили получить данные относительно природы сахаров, играющих главную роль в специфичности, за несколько лет до их прямого выделения, а также помогли найти подходы к задаче получения фрагментов с различной серологической специфичностью. С помощью непрямых методов было убедительно показано, что a-N-ацетил-в-галактозаминоильный и сс-в-галактозильный остатки определяют соответственно А- и В-специфичности, а а-ь-фукозиль-ные остатки — Н- и Ье -специфичности. Эти данные были подтверждены при установлении строения активных фрагментов, выделенных из продуктов частичного кислотного гидролиза групповых веществ. Выяснение строения многих активных и неактивных фрагментов позволило предположить строение участков углеводных цепей, ответственных за серологическую специфичность А-, В-, Н- и Ье -веществ. [c.212]

Как уже отмечалось, картина преципитации, получаемая при иммуноэлектрофорезе, сильно зависит от свойств иммунной сыворотки. Для каждого компонента смеси антигенов существует определенный диапазон концентраций, в котором получаются хорошо сформированные четкие линии преципитации (зона эквивалентности). В многокомпонентных смесях концентрация отдельных антигенов может различаться в широких пределах. Концентрация (титр) антител в применяемой иммунной сыворотке также может варьировать в значительной степени. Таким образом, вполне возможна ситуация, при которой зоны эквивалентности для разных компонентов смеси не будут перекрываться. В связи с этим иммуноэлектрофорез многокомпонентных смесей рекомендуется проводить при нескольких относительных концентрациях антиген-антитело, так как при использовании только одной такой концентрации можно не обнаружить какие-то компоненты. Предложен, в частности, метод иммуноэлектрофореза с применением последовательных разведений сыворотки человека [618, 619]. Этот метод иммуноэлектрофоретического титрования полезен для полуколичественного определения от- [c.239]

При анализе методом двойной иммунодиффузии препарат GGT, очищенный из почек быка с применением иммуноаффинной хроматографии, дает с гомологичными антителами три отдельные дуги преципитации, каждая из которых проявляет GGT-активность. Ферментный препарат может быть также разделен на четыре активные фракции изоэлектрическим фокусированием. GGT из почек крысы, очищенная на иммуноадсорбенте, дает с гомологичными антителами две дуги преципитации, обладающие ферментативной активностью. Эти наблюдения подтверждают предположение, что GGT присутствует в виде нескольких молекулярных форм, которые могут отличаться по содержанию сиаловой кислоты. Тэйт и Мейстер [34] впервые продемонстрировали, что чистая легкая форма GGT из почек крысы может быть разделена на несколько ферментных форм. Эти наблюдения делают очевидным тот факт, что молекулярные формы, очищенные на иммуноадсорбентах, иммунологически неразличимы. [c.162]

Принцип совмещения электрофоретической миграции антигена в агаре с его преципитацией под действием антител был развит в 1966 г. Лореллом [И], который разработал метод ракетного иммуноэлектрофореза для быстрой оценки количества индивидуальных антигенов в смеси с помощью моноспецифических антител, введенных в гель, а также двумерный (перекрестный) иммуноэлектрофорез, позволяющий оценить как качественный, так и количественный состав сложной смеси антигенов с помощью полиспецифических антисывороток. [c.12]

Антигены, значение р1 которых при pH 8,6 больше, чем у антител, находясь в геле, обладающем высокими электроэндосмотическими свойствами, способны достаточно быстро мигрировать к аноду навстречу антителам, которые перемещаются из противоположной лунки к катоду. Использование этого явления позволяет быстро получить линии преципитации между лунками с антигенами и антителами при условии, что они внесены в соответствующих пропорциях. Встречный ИЭФ — очень чувствительный и быстрый метод определения как антигенов, так и антител 16]. Он широко применяется для выявления инфекционных антигенов в физиологических жидкостях (например, антигенов вируса гепатита В), изменений концентрации сывороточных белков (например, а-фетопро-теина), а также для тестирования антител к целому ряду антигенов, мигрирующих к аноду. Чувствительность метода достигает 400 нг/мл. [c.228]

Химические методы. С помощью высаливания сернокислым аммонием и дифференциальным центрифугированием в высоко-очищенном состоянии был получен целый ряд растительных вирусов. Однако получить этим методом в чистом виде вирусы животных не удается. В настоящее время метод высаливания сернокислым аммонием был использован для лредварнтельного концентрирования вирусов ящура, полиомиелита, реовируса, гриппа, болезни Ньюкасла и др. Кокс с сотр. [267] в 1947 г. успешно применили для концентрирования вируса гриппа метод преципитации метанолом. В дальнейшем этот метод был использован также для предварительного концентрирования вирусов гриппа, паротита, полиомы, ящура, болезни Тешена и др. [c.42]

Этот микрометод очень полезоп при исследовании небольших сферических вирусов растений. При этом в агаре па предметном стекле вырезают ряд лунок, а также канавку для антисыворотки. Готовят ряд двукратных разведений антигена и помеш а10т небольшие пробы антигена (около 7 мкл) в лунки. С помош ьго этого метода можно определить около 0,02 мкг ВН МТ путем визуальной оценки полос преципитации. При использовании меченного ВЖМТ и последуюш ей радиоавтографии мы смогли определить >тот вирус даже в количестве 0,002 мкг. [c.29]

Серологическое и аллергологическое исследования. При шистосомозах иммунодиагностика дополняет микроскопическое исследование, но в качестве самостоятельных методов диагностики ее применять не рекомендуется. Практическое значение имеют РИФ, РСК, ИФА, РП, РГА, а также внутрикожная проба, реакция флоккуляции на предметном стекле, реакция кольцепреципитации, реакция преципитации вокруг яйца шистосомы, реакция агглютинации церкариев, реакция иммобилизации мирацидиев и др. Для исследования необходимы гепаринизированная кровь (не менее 1 мл) и 4 пробы сыворотки крови по 1 мл каждая. Кровь из пальца набирают в обработанную гепарином стеклянную трубку или помещают на фильтровальную бумагу, предварительно обработанную консервантами для предупреждения роста плесневых грибов (например, раствором тиомерсала 1 10 000) и высушенную. Полоски фильтровальной бумаги с каплями крови определенного объема тщательно высушивают при 56 °С и выше. В дальнейшем участок фильтровальной бумаги с каплей крови вырезают, погружают в буферный раствор (pH 7,2) и оставляют на несколько часов при [c.393]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология