Электрофорез с изменением заряда

Изоэлектрическая точка. В процессе титрования белка от предельно кислой до предельно основной формы должно существовать значение pH, при котором средний заряд белка равен нулю. Это значение pH носит название изоэлектрической точки. При значении pH, равном изоэлектрической точке, данный белок не перемещается в электрическом поле (см. ниже об электрофорезе). Изоэлектрическую точку можно приближенно определить, зная аминокислотный состав белка. Поскольку средний заряд белка зависит от концентрации соли (эта зависимость обусловлена способностью белков связывать ионы, а также изменением р а при изменении ионной силы), изоэлектрическая точка зависит от присутствия в растворе посторонних веществ, в частности от природы и концентрации буфера. В то же время она не зависит от концентрации белка. Изоэлектрические точки большинства белков близки к 7, что обусловлено приблизительно одинаковым содержанием в молекуле белка кислых и основных остатков. Однако существуют и такие белки, у которых изоэлектрические точки существенно отличны от 7. Так, например, пепсин — протеолитический фермент, функционирующий в сильно кислой среде желудка,— имеет изоэлектрическую точку, близкую к 1, а изоэлектрические точки протаминов близки к 12. [c.72]

Аномальные гемоглобины, различающиеся по форме, химическому составу и величине заряда, были вьщелены при помощи электрофореза и хроматографии. Передающиеся по наследству изменения чаще всего являются результатом мутации единственного триплета, приводящей к замене одной какой-либо аминокислоты в полипептидных цепях молекулы гемоглобина на другую. В большинстве случаев происходит замена кислой аминокислоты на основную 1ши нейтральную (табл. 2.1). Поскольку это замещение осуществляется в обеих полипептидных цепях одной из пар (а 1ШИ 3), образовавшийся аномальный гемоглобин будет отличаться от нормального величиной заряда и соответственно электрофоретической подвижностью. [c.82]

В растворах высокомолекулярных веществ при изменении температуры или pH или при введении низкомолекулярных веществ иногда наблюдается так называемая коацервация. Это явление, присущее только неравновесным системам, заключается в разделении системы на две фазы, из которых одна представляет собой раствор высокомолекулярного вещества в растворителе, а другая — раствор растворителя в высокомолекулярном веществе. Раствор, более богатый высокомолекулярным веществом, обычно выделяется в виде мельчайших капелек, которые в дальнейшем могут образовать сплошной слой. Когда растворителем является полярная жидкость, например вода, капельки могут при определенных условиях приобретать заряд, что доказывается их способностью к электрофорезу. [c.365]

Знак заряда коллоидных частиц может быть установлен на опыте, так как под действием постоянного электрического тока положительные коллоиды передвигаются к катоду, а отрицательные — к аноду. При изучении этого явления (называемого электрофорезом) исследуемый гидрозоль помещают в нижнюю часть снабженной кранами и-об-разной трубки (рис. Х-65), затем закрывают оба крана, промывают верхнюю часть прибора, заполняют ее водой и опускают в нее электроды. После открывания обоих кранов и включения постоянного тока в трубке начинает происходить электрофорез. Передвижение коллоидных частиц от одного полюса к другому особенно легко наблюдать в случае цветных золей непосредственно по изменению уровня окрашенного слоя жидкости в обоих коленах трубки. [c.609]

Получающиеся при этом частицы белка несут одновременно положительный и отрицательный заряд и называются а м ф и о н а м и. Практически амфионы ведут себя подобно электронейтральньш частицам, так как суммарный заряд их равен нулю. Действительно, в электрическом поле, т. е. при пропускании через раствор постоянного электрического тока, амфионы не передвигаются ни к катоду, ни к аноду. Белковые частицы в растворе могут, однако, менять свой заряд в зависимости от pH среды вкислой среде белок при электрофорезе передвигается к катоду, в щелочной среде — к аноду. / Таким образом, мы убеждаемся в возможности перезарядки част щ белка при изменении реакции раствора. [c.21]

Значение pH раствора полиамфолита, при котором средний суммарный заряд на цепи равен нулю, называется изоэлектрической точкой (ИЭТ). Величина ИЭТ не зависит от концентрации полиамфолита и является важной константой полиамфолита. На различии в ИЭТ основано фракционирование смесей белков, например, методом электрофореза. При определении ИЭТ учитывается суммарный заряд макромолекул, обусловленный не только диссоциацией кислотных и основных групп полиамфолита, но и специфическим связыванием посторонних ионов из раствора. ИЭТ определяется с помощью электрокинетических методов (в частности, электрофореза) либо косвенным путем по изменению свойств, связанных с зарядом макромолекул. Значения степени набухания, растворимости полиамфолитов, осмотического давления и вязкости их растворов в ИЭТ проходят через минимум. Вязкость в ИЭТ минимальна (рис. IV. 7), поскольку вследствие взаимного притяжения присутствующих в равном количестве противоположно заряженных групп полимерная цепь принимает относительно свернутую конформацию. При удалении от ИЭТ цепь полиамфолита приобретает суммарный положительный (в кислой области pH) или отрицательный (в щелочной области pH) заряд [c.127]

Здесь для сравнения приведены две другие аномальные формы гемоглобина, С и О.) Можно видеть, что гемоглобин 5 отличается от гемоглобина А лишь тем, что в одной из цепей один из остатков глутаминовой кислоты замещен в нем на валин. Благодаря этому замещению возникает различие в один заряд на одну половину молекулы. Почему это различие приводит к столь большому различию растворимостей, наблюдаемому в эксперименте, пока не ясно. В гемоглобине С тот же остаток глутаминовой кислоты замещен положительно заряженным остатком лизина. Таким образом, в трипсиновом гидролизате НЬС имеется пептид, обладающий противоположным зарядом по сравнению с соответствующим пептидом в гидролизате НЬА. Гены, определяющие гемоглобины А, 5 и С, аллельны между собой. Что касается гемоглобина О, то генетики установили, что он неаллелен с остальными тремя. Интересно, что в НЬО замещен аминокислотный остаток, соседний с тем, который замещается в гемоглобинах 5 и С. С помощью электрофореза, чувствительного в первую очередь к различиям в зарядах, был обнаружен также ряд других аномальных гемоглобинов. Детально описать ЭТИ различия можно будет лишь после того, как будет установлена последовательность аминокислот в каждом из исследуемых гемоглобинов. Замещение одной аминокислоты на другую может и не привести к изменению функции гемоглобина, т. е. иметь лишь генетическое, а не физиологическое значение. По-видимому, в случае НЬО дело обстоит именно так. [c.224]

Практически тем или иным путем получали продукты частичного замещения по изучаемым функциональным группам. С вступлением каждой новой группы зар.яд скачкообразно изменяется на 1, в других случаях на 2. Это изменение заряда позволяет разделить продукты замещения электрофорезом на бумаге. Число разделенных производных равно числу свободных функциональных групп в исследуемом веществе. [c.407]

Мы не можем сделать никаких выводов на основании соотношения патологических (16) и бессимптомных (43) замещений, поскольку первые выявлены по патологии, а последние— обычным методом электрофореза. Мы, например, не знаем, сколько нейтральных замещений на поверхности или внутри молекулы остались необнаруженными, поскольку они не сопровождаются заметными физиологическими изменениями. И наоборот, вряд ли можно считать, что все 43 случая изменения заряда на поверхности совершенно нейтральны. Большинство из них ни разу не наблюдали в гомозиготном состоянии. Главное состоит в том, что замещения отдельных аминокислот, заряженных или незаряженных, на поверхности или внутри молекулы вызывают целый диапазон эффектов — от, по-видимому, нейтральных до явно патологических, — и ширина этого диапазона никак не противоречит неоклассической гипотезе. [c.203]

ЭИЗ — электрофорез с изменением заряда [c.11]

Сила Ря возникает в результате воздействия внешнего электрического поля на ионы диффузного слоя, приводящего к увлечению жидкости вблизи поверхности частицы в направлении, противоположном направлению действия силы Образующийся при этом гидродинамический поток снижает скорость электрофореза частицы. Сила возникает в результате поляризации, т. е. нарушения симметричного строения ДЭС при действии внешнего электрического поля, и проявляется в изменении скорости движения частицы. Так, если вне электрического поля ДЭС имеет симметричное строение, то во внешнем поле у противоположных полюсов поляризованной частицы накапливаются поляризационные заряды противоположного знака—мицелла приобретает свойства диполя. Эффект релаксации заключается в действии электрического поля поляризационных зарядов на поверхностный заряд частицы и ионы внешней обкладки ДЭС. [c.75]

Следует заметить, что при выводе уравнений (VII, 42) и ХУИ,44) был сделан ряд упрощений и не вполне обоснованных допущений. Прежде всего, как уже было указано при рассмотрении строения двойного электрического слоя, схему, из которой мы исходили, нельзя считать удовлетворительной. Двойной электрический слой, согласно новейшим представлениям, надо представлять не плоскопараллельным конденсатором, а конденсатором, одна из обкладок которого состоит из диффузно распределенных ионов. Часть этих ионов находится в приповерхностном слое и отстоит от твердой поверхности на меньшем расстоянии, чем плоскость скольжения. В результате этого электрокинетический потенциал соответствует не всему заряду на поверхности стенки, а разности между общим поверхностным зарядом и зарядом всех противоионов, находящихся в приповерхностном слое. Поведение такого слоя при электрофорезе или электроосмосе следует представлять себе так, как это показано на рис. VII, 19 6. Правда, такое представление о двойном электрическом слое не обесценивает приведенный вывод, так как этот слой по-прежнему можно рассматривать как электрический конденсатор. Возникает лишь вопрос о том, насколько допустимо при количественных выводах приравнивать расстояние /, на котором происходит изменение скорости течения жидкости в двойном слое, к усредненному расстоянию между обеими обкладками электрического конденсатора с размытой внешней обкладкой. [c.201]

Методика диагонального электрофореза аналогична процедуре, проиллюстрированной на фиг. 22. Неполный гидролизат, содержащий пептиды с метионином, подвергают электрофорезу. После окрашивания контрольной полоски вырезают аналитическую электрофореграмму, смачивают ее 0,1 М раствором иодацетамида в пири-дин-ацетатном буферном растворе с pH 3,5 [пиридин—уксусная кислота—вода (1 10 90)]. Смачивание производят осторожно распылителем или пипеткой. Необходимо, чтобы бумага пропиталась полностью, но не содержала избытка влаги. Влажную полоску на 14—16 ч помещают в эксикатор при комнатной температуре, На дно эксикатора наливают буферный раствор pH 3,5 для создания соответствующей атмосферы. Необходимо следить, чтобы в эксикаторе части бумажной полоски не соприкасались друг с другом. После инкубации электрофореграмму высушивают на воздухе и избыток иодацетамида удаляют отмыванием в ацетоне, 3—4 раза погружая в него полоску. Сухую полоску пришивают к новому листу фильтровальной бумаги и подвергают электрофорезу, используя тот же самый буферный раствор, который применялся при первом электрофорезе, но проводя разделение под прямым углом к первоначальному направлению. Пептиды, содержащие метионин, благодаря изменению суммарного заряда на -]-1 единицу сместятся в сторону катода от диагонали, по которой располагаются другие пептиды. [c.109]

Исследован механизм формирования поверхностного заряда коллоидных частиц в водных дисперсиях. Показано, что существенную роль играют химические реакции, протекающие на поверхности раздела, с дисперсионной средой и ПАВ. Показана взаимосвязь электрокинетических явлений — электрофореза, диффузиофореза, апериодического дрейфа с механизмом формирования ДЭС коллоидных частиц, его поляризацией, характером изменения в условиях действия электрического поля и градиента онцентрации электролита. [c.254]

Многочисленные исследования показали, что электрокинетические эффекты очень чувствительны к присутствию электролитов в дисперсионной среде в большинстве случаев электролиты при заметном содержании уменьшают интенсивность их проявления (скорость электрофореза или электроосмоса, величину потенциалов и токов протекания и седиментации), а иногда введение электролитов приводит к изменению направления движения фаз (течения тока) или знака возникающих потенциалов (так называемая перезарядка поверхности — изменение знака ее заряда см. 6). Квинке первым высказал предположение о том, что возникновение электрокинетических явлений связано с пространственным разделением зарядов вблизи поверхности раздела фаз. Идеи Квинке развил Гельмгольц, который дал первые модельные представления о пространственном разделении зарядов вблизи поверхности и использовал их для количественного описания наблю- [c.174]

Электрохимические методы. По направлению движения частиц при электролизе или электрофорезе и изменению этого движения с изменением состава раствора можно судить о заряде ионов и коллоидных частиц. С ростом pH раствора катионы гидролизируются, [c.102]

Наличие изоферментов может быть обусловлено также генетическими вариациями в гетерозиготах. Так, если генетически детерминированный вариант определенного белка несет на один положительный или отрицательный заряд больше (или меньше), чем стандартный фермент, то при электрофорезе соответствующей белковой фракции у гете-розигот будет обнаружен новый изофермент. Следует отметить, что электрофоретический метод, часто используемый для выявления изоферментов, не позволяет обнаружить генетические варианты, в которых замещения аминокислот не приводят к изменению заряда молекулы. [c.68]

Одну из таких методик называют электрофорезом с изменением заряда (ЭИЗ) (Helenius, Simons, 1977). В этом случае молекулы белков подвергают электрофорезу в нейтральных детергентах или неденатурирующих смесях нейтральных и заряженных детергентов. Молекулы, способные связать детергент благодаря гидрофобным взаимодействиям, по-разному мигрируют в смесях катионных, анионных и нейтральных детергентов молекулы же, вовсе не связывающие детергенты или связывающие их ие гидрофобными, а электростатическими силами, мигрируют в смесях всех трех или по крайней мере двух типов одинаково. [c.85]

Вначале при разработке метода ЭИЗ электрофоретическому разделению подвергали очищенные и гомогенные белкн или же белковые смесн, а затем для ориентировочной локализации молекул с разным зарядом применяли иммунодиффузию. Перед электрофорезом с изменением заряда ие рекомендуется проводить ДСН-ПАГЭ, поскольку при этом белки могут подвергаться денатурации с обнажением внутренних гидрофобных областей. Чтобы повысить разрешающую способность электрофоретического анализа, мы сначала проводили ЭИЗ, а затем, вырезав нужные участки геля, элюировали белки и подвергали их иммунопреципитации и ДСН-ПАГЭ. Иными словами, мы сочетали фракционирование нативных образцов по гидрофобно-сти в ЭИЗ с иммунопреципитацией и разделением по величине молекул в ДСН-ПАГЭ, что позволяет отнести всю процедуру к методам двумерного электрофоретического разделения. [c.85]

Метод электрофореза широко применяют в клинике для анализа белков плазмы и сыворотки крови. Концентрация белков плазмы составляет 60—80 г/л. Сыворотка крови представляет собой плазму, лишенную фибриногена. При заболеваниях может изменяться как общее количество белков плазмы, так и содержание отдельных белков или белковых фракций без изменения общего количества белка. При некоторых заболеваниях, например при воспалении почек, циррозе печени и др., наблюдается уменьшение содержания белков плазмы (за счет снижения количества альбуминов). Напротив, острые инфекционные заболевания, возникновение некоторых злокачественных новообразований сопровождаются повышенным содержанием белков в крови, чаще всего глобулиновой фракции. Поэтому анализ белков сыворотки крови имеет большое диагностическое значение и позволяет наблюдать за ходом лечения. Суммарный заряд белковой молекулы изменяется в зависимости от pH и при определенном значении pH (изоэлектриче-ская точка) равен нулю. Белок в изоэлектрическом состоянии при электрофорезе не передвигается ни к катоду, ни к аноду, наименее устойчив в растворе и при стоянии выпадает в осадок. [c.31]

Электрофорез, электролиз, электрохимическое выделение. Годлевский показал, что при электролизе водных растворов, на-сыш енных радоном, RaB выделяется на катоде. В присутствии различных электролитов, а также отрицательно и положительно заряженных коллоидов наблюдалось изменение знака заряда RaB, что объяснялось перезарядкой частиц гидрозоля RaB. Однако эти явления можно объяснить и с точки зрения ионного состояния RaB так, например, добавление цитрата калия приводит к образованию комплексов, а добавление отрицательно заряженных коллоидов (Pt, Au, AsjSg) могло изменить знак заряда RaB за счет адсорбции его ионов на этих коллоидах. [c.127]

Электрофорез с изменением заряда. Клеткн (илн другие образцы) солюбилизируют в буфере с NP-40 для ЭИЗ следующего состава 0,5% NP-40, 0,1 М Na l в 0,05 М NaOH-глици-иовом буфере с pH 9,0 смесь оставляют на 10 мин прн 0°С, затем центрифугируют для отделения ядер. Каждый солюбилизированный образец делят на три части. К первой из них добавляют 0,25 объема 2,5%-иого дезоксихолата натрия в буфере для ЭИЗ с NP-40, ко второй — 0,25 объема буфера для ЭИЗ с NP-40, а к третьей — 0,25 объема 0,5% ного бромистого цетил-трнметиламмония (БЦТА) в буфере для ЭИЗ с NP-40. После этого образцы оставляют для уравновешивания на 1—4 ч при 4 С. [c.85]

Влияние ионов на электрокинетические явления. Влияние электролитов на электрокинетические явления можно проще всего охарактеризовать теми изменениями, которые претерпевает -потенциал при их добавлении. Как правило, измерения электрофореза, электроосмоса и потенциалов течения приводят в этом отношении к одинаковым результатам. В общем -потенциал становится более положительным в кислых растворах, т. е. в присутствии ионов водорода, и более отрицательным в щелочных растворах, т. е. в присутствии ионов гидроксила. Если поддерживать pH раствора постоянным, то можно наблюдать, как влияет на электрокинетический потенциал добавфние солей. Наиболее заметное действие оказывают ионы со знаком заряда, [c.709]

Рис, 3. Разделение поверхностных иммуноглобулинов клеток селезенки в электрофорезе с изменением заряда. Белки мечены помощью лактопероксч-дазы. Лизаты иодированных клеток селезенки уравновешивали и разделяли (см. текст) в ЦТАБ с ЫР-40 (Л), только в ЫР-40 (5) и в дезоксихолате с ЫР-40 (В). Пластинки после электрофореза элюировали, выделяли на иммуносорбенте и разделяли с помощью ДСН-ПАГЭ. На рисунке показаны соответствующие участки геля. Мю- и дельта-цепн (вверху и внизу соответственно) изменяют свою подвижность в двух смесях заряженных детергентов противоположным образом, что существенно для нх идентификации. [c.87]

Зависимость суммарного заряда на полипептиде или белке от изменения pH среды можно использовать для разделения этих молекул с помощью электрофореза. Если смесь полипептидов в водном буферном растворе с известным значением pH подвергнуть воздействии сильного электрического поля, то молекулы с общим положительным или отрицательным зарядом будут перемен аться в противоположных направлениях, в то время как молекулы с нулевым зарядом при выбранном pH останутся ненодвижными. Сложную смесь белков можно раз-де. шть на компоненты, осуществляя электрофорез па бумаге, пропитанной буфером, или в гель-нроводящей пленке. Подвижность состав[1ых частей смеси или паправлспие их перемещения П[)и э. ектрофорезе зависят от значения pH, при котором проводится процесс. [c.300]

Метод обладает большой разрешающей способностью в связи с тем, что разделерше белковых смесей идет не только по заряду, но и по размерам и форме частиц. Электрофорез в полиакриламидном геле имеет ряд преимуществ химическая стабильность и инертность геля, возможность получения гелей с заданной величиной пор, отсутствие адсорбции и электроосмоса, устойчивость к растворителям, изменениям температуры и pH. [c.94]

Заряженные частицы перемещаются в растворе под влиянием электрического поля с различной скоростью. Уже в первой половине нашего столетия для этого явления было введено понятие "электрофорез" или "электрический перенос". Различие скоростей перемещения может быть обусловлено двумя причинами (а) различные молекулы несут на себе различные заряды и поэтому при наложении электрического поля могут ускоряться в различной степени (б) их перемещению препятствует различающееся по величине сопротивление трения. В простейшем случае разделительная среда (раствор электролита) находится в трубке. Из-за отвода Джоулева тепла на практике зачастую наблюдается искажение зон за счет различных плотностей электролита и конвекционных потоков. В случае классического электрофореза применяются гели или полоски бумаги, пропитанные электролитами для того, чтобы уменьшить помехи, вызванные конвекцией, а также чтобы увеличить сопротивление трения макро-молекул с незначительными различиями в зарядах и тем самым усилить эффект разделения. Использование полиакриламидного гель-электрофореза (ПААГ-электрофореза) позволяет проводить эффективное разделение молекул ДНК и белков. Благодаря изменению степени сшивания геля может быть оптимизирована производительность разделения. При использовании гель-электрофореза белков, денатурированных додецилсульфатом натрия (ДДСН), возможно непосредственное определение их молекулярной массы. Разделение в этом случае основано исключительно на затруднении миграции пробы через гель (без геля все денатурированные додецилсульфатом натрия белки перемещаются с одинаковой скоростью). [c.5]

Заряженные частицы движутся в электрическом поле со скоростью, которая зависит от напряженности поля, от величины заряда каждой частицы, а также от ее формы и размеров (от которых зависит гидродинамическое сопротивление, оказываемое средой). Эти свойства могут быть использованы для разделения либо част1Щ с одинаковым зарядом, но различающихся размерами, либо частиц одинаковых размеров с различными зарядами. Область применения метода может быть расширена в случае необходимости путем изменения величины заряда мигрирующих частиц, изменением pH буфера, в котором проводится разделение (например, для аминокислот, оптимальное разделение которых зависит от pH), или путем образования комплексов (например, добавление борной кислоты к смеси сахаров). Термины электрофорез и ионофорез лучше всего использовать по отношению к разделению соответственно коллоидных и ионных частиц. [c.26]

Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что существует взаимосвязь электрокинетических явлений — электрофореза, диффузиофореза, апериодического электродиффузиофореза — с механизмом формирования ДЭС коллоидных частиц, его поляризацией, характером изменения в условиях действия электрического поля и градиента концентрации электролита. Эти исследования имеют значения для решения проблемы устойчивости дисперсных систем, а также лежат в основе изучения электрофоретических, диффузиофоретических и элект-родиффузиофоретических покрытий, очистки воды от дисперсий электрокоагуляцией, обессоливания жидкости на неорганических мембранах. Особенно актуально изучение механизма формирования поверхностного заряда и структур ДЭС для технологий с использованием ионогенных ПАВ, которые, как показали исследования, оказывают существенное влияние на изучаемые процессы. Дальнейшее развитие работ в этой области должно быть направлено на проведение комплексных электроповерхностных исследований. Они важны для создания теории неравновесного ДЭС и открывают возможности для управления указанными технологическими процессами. [c.137]

Лахс изучал перезарядку частиц радиоактивных изотопов в зависимости от диэлектрической постоянной растворителя (D). При электрофорезе активного налета (RaA+RaB + Ra ), образующегося в результате распада радона, в различных растворителях наблюдалось изменение знака заряда этих частиц, что и привело автора к заключению о коллоидном состоянии радиоактивных изотопов. В качестве растворителей были взяты вода (Z>=80), спирт (D = 26), этиловый эфир (Д=4), бензол D = 2.3). [c.41]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология