Антигены диализуемые

Объединяют первые 5—6 фракций с самым высоким содержанием белка. Концентрируют до 15—20 мг/мл. Определяют содержание белка. Методом электрофореза определяют состав полученного препарата IgG. Диализуют против боратного буфера pH 8,4 в течение ночи при 4°С и хранят при —20°С. Здоровый кролик дает 100—200 мг IgG. Таким же образом можно получить поликлональные антитела к другим белковым антигенам. [c.309]

Для определения положения равновесия между свободными антителом и антигеном и их комплексом или между антителом и гаптеном и их комплексом использовали различные методы. Среди них — метод равновесного диализа (I), прямой анализ преципитатов и надосадочной жидкости (II), электрофорез и ультрацентрифугирование (III) и метод рассеяния света (IV). Эти эксперименты подробно описаны в цитированных работах. Здесь мы можем только сказать, что все это методы определения или расчета концентраций свободных антител, свободных антигенов, свободных гаптенов и их комплексов в состоянии равновесия. На основе таких измерений можно вычислить константу равновесия К и AF°. Если эти измерения произвести при нескольких значениях температур, можно определить также величины ДЯ° и А5°. [c.166]

Все четыре экстракта объединяют и фракционируют осаждением ацетоном. Водный раствор охлаждают до О—2°, тш,ательно перемешивают и медленно прибавляют охлажденный до —10° ацетон, нока его концентрация не составит 50% (по объему). Некоторое количество веш,ества при этом осаждается, и его удаляют центрифугированием. Затем концентрацию ацетона увеличивают до 66%, при этом осаждается основная масса вещества с антигенными свойствами. Осадок снова растворяют в воде и повторно обрабатывают ацетоном, причем небольшое количество вещества снова удаляют, когда концентрация ацетона достигает 50% остальное количество антигена осаждается при увеличении концентрации ацетона до 60%. Растворение в воде и осаждение ацетоном повторяют еще раз, полученную при этом фракцию, осаждающуюся при увеличении концентраций ацетона от 50 до 60%, растворяют в воде, диализуют на холоду против дистиллированной воды и лиофилизуют (см. стр. 302). Выход вещества 10% от начального (сухого) веса подвергнутых экстракции бактерий. [c.324]

Нанесите на колонку экстракт, содержащий гибридный белок, при 4 С для уменьшения протеолиза. Промойте колонку буфером PBS (его состав указан в сноске к табл. 5.2) в объеме, равном объему колонки, при 4°С. Все последующие стадии проводите при комнатной температуре. Промывайте колонку буфером BBS-твин (состав указан в сноске к табл. 5.2) до тех пор, пока в элюирующем растворе не останется белка. Уравновесьте колонку буфером PBS. Проведите элюцию раствором, содержащим 4 М гуанидин-НС1, 10 мМ трис-НС1 (pH 8,0), соберите пик и диализуйте его против нескольких смен буфера PBS. Основная часть белка выпадает в осадок и может быть собрана с помощью центрифугирования. Для проведения иммунизации ресуспендируйте преципитат в небольшом объеме PBS и далее следуйте методике, приведенной в разд. 5.4. Сразу же после использования снова уравновесьте колонку PBS. При работе возможно использование и других элюирующих растворов, но более слабые элюенты не смогут разрушить прочные связи комплексов антиген—антитело, и в результате емкость колонки уменьшится, так как большое число участков аффинного связывания окажется занятым. [c.158]

Большие возможности совершенствования промышленной биотехнологии заключены в развитии и интенсификации не только основной стадии — ферментации, но и последующих этапов разделения, очистки и получения товарных форм препаратов. Здесь прогресс крупнотоннажного микробиологического синтеза связан с грамотным применением и модификацией известных процессов химической технологии, таких, как разделение суспензий, выпарка, сушка, ионный обмен, кристаллизация, экстракция и особенно мембранные методы ультрафильтрации, обратного осмоса, диализа и т. п. Отметим, однако, что биотехнология должна и уже начала развивать свои специфические методы выделения биологически активных веществ, основанные на биологических взаимодействиях. Например, чрезвычайно перспективна хроматография культуральных жидкостей на носителях, несущих антитела к имеющемуся в растворе антигену, что позволяет выделить чистый биопрепарат из растворов практически любой концентрации и сложности. [c.139]

Чу с сотрудниками разработали методы выделения, очистки и количественного определения антигена предстательной железы. Этот> антиген выделяли из семенной жидкости или ткани предстательной железы человека. Грубые экстракты тканей обрабатывали сульфатом аммония и преципитируемый материал растворяли, диализовали и далее очищали путем колоночной хроматографии (ДЭАЭ и сефадекс). Фракции с мол. массой 26—37 кД, содержащие антиген предстательной железы, кон- [c.152]

Приготавливают раствор белка (250 мг в 5 мл фосфатного буфера, pH 7,0). Это может быть белковый антиген, или, если его мало, смесь антигена с сывороточным альбумином. Диализуют раствор против фосфатного буфера и проверяют pH. [c.97]

Антиген и антитела смешивают в одной пробирке при этом равновесие достигается быстрее, чем при равновесном диализе. Отделение свободных антител занимает всего лишь около минуты, что позволяет проводить также и кинетические измерения. [c.33]

Равновесный диализ щироко используется для измерения сродства ферментов к субстратам и ингибиторам, для изучения связывания лекарственных препаратов с сывороточными белками и для изучения связывания антигенов с антителами. Чтобы максимально использовать возможности равновесного диализа, желательно работать с малыми объемами и мембранами сравнительно большой площади фильтрующей поверхности. На рис. 13.4 показана скорость достижения равновесия в типичном опыте по равновесному диализу. Чтобы свести [c.355]

Рис. 4.7. Результаты, полученные методом связывания комплемента, с одной стороны, и методом двойной диффузии, с другой стороны, для сравнения антиген ности р-амилаз, экстрагируемых из непроросшего и пророс него зерна ячменя. В двух упомянутых методах использована одна н та же моноспецифическая иммунная сыворотка р-амилазы ячменя. Оба экстракта подвергли диализу и разбавили >1.0 получения одинаковой их активности.

В ряду с осмотическими процессами находится диализ, когда происходит непрерывная диффузия малых молекул в циркулирующий растворитель с удерживанием больших молекул. При этом отсутствует выраженный перенос растворителя против градиента концентрации. Диализ применяют, например, при очистке антигенных препаратов, представляющих собой протеины, гликопротеины или более сложные комплексы. С помощью диализа через раличные мембраны освобождаются от неорганических солей. [c.391]

При групповом разделении методом гель-фильтрации удается в значительной мере избежать разбавления, если учитывать объемные соотношения, подробно рассмотренные в разделе Обессоливание . При очистке суспензии вируса (выделенного из столовой свеклы) от сопутствующих пигментов путем гель-фильтрации на 4—6-кратном (по отнощению к объему образца) объеме сефадекса 0-75 разделение составляло лишь 20—30% [14]. Свободные от белков катехоламины — адреналин и норадреналин — были выделены без разбавления из 20 мл сыворотки (27% объема колонки) гель-фильтрацией на сефадексе 0-25 (2X25 сж, 78 мл) [15]. Кислюк [16] показал, что с помощью гель-фильтрации на сефадексе 0-50 удается гораздо легче отделить фермент от его кофакторов, чем с помощью диализа. Таким путем удается получить кофакторы в сравнительно небольшом объеме и изучить эффект их вторичного присоединения к ферменту. После гель-фильтрации был выделен совершенно неактивный белок, активность которого вновь восстанавливалась (до 86% исходной) после добавления низкомолекулярной фракции. При диализе активность фермента снижалась только до 38% [16]. Групповое разделение гель-фильтрацией оказалось чрезвычайно удобным методом отделения низкомолекулярных антигенов от антител. Диссоциацию комплекса антиген — антитело часто осуществляют, добавляя избыток гаптена, который затем можно легко отделить от белка гель-фильтрацией [17]. В бактериологии гель-фильтрация на сефадексе 0-75 или биогеле Р-100 может служить для удобного выделения экстрацеллюлярных токсинов. Перед засевом культуральную среду освобождают от высокомолекулярных примесей гель-фильтрацией. Затем на той же колонке после удаления бактерий можно вновь отделить высокомолекулярные токсины от культуральной среды [18]. [c.142]

Для люминесцентной метки белков применяют флуорохромы изоцианат и изотиоцианат флуоресцеина, некоторые производные родамина, в том числе изоцианат тетраметилродамина, хлорид диметил-нафтил-ами-но-сульфокислоты и ядерный красный прочный. Наиболее широко используется изоцианат флуоресцеина. Его растворяют в смеси диоксана с ацетоном и в таком виде соединяют с белком (обычно глобулиновой фракцией в количестве 5 мг флуорохрома на 100 мг белка) при температуре О—5° С, перемешивая в течение 18 часов. Полученный коньюгат белка с флуоресцеином освобождают от несвязавшегося красителя сначала с помощью диализа против забуференного при рН=9,0 физиологического раствора. Дальнейшая очистка от избыточного красителя производится переосаж-дением белка сульфатом аммония (4—5 раз), пока надосадочная жидкость не перестает люминесцировать. Препараты (мазки, суспензии, замороженные срезы), как фиксированные ацетоном, так и нефиксированные, приводят в соприкосновение с люминесцентно-меченым белком в течение 30 минут, промывают в физиологическом растворе (рН=7ч-7,5) и заключают в забу-ференный глицерин. Исследовать такие препараты лучше при ультрафиолетовом возбуждении. Соответствующие антигены при этом люминесцируют очень ярко светло-зеленым светом. Этот метод позволяет определять внутриклеточную локализацию чужеродных полисахаридов и белков, ферментов и гормонов, устанавливать антигенное родство тканей и клеток, быстро идентифицировать под микроскопом бактерии й вирусы. [c.317]

Применение ионитов в других областях биологии дает некоторые йерспективы использования их в промышленности для улучшения процессов или качества продукта. С помощью ионитов удается осадить коллоидные. примеси из растворов бактериальных антигенов и токсоидов. Таким способом с изменением ионной силы или pH растворов при деионизации или реакциях ионного обмена очищены антиген стафилококка и тетанус или токсоид дифтерии [681. Для замещения высоких концентраций сульфата аммония физиологическими концентрациями. хлорида натрия при изготовлении антитоксина дифтерии использовалась комбинация диализа и ионообмена со смесью ионитов в натриевой и хлоридной формах [17]. С помощью ионитов определены требования к содержанию ионов металлов для роста бактерий [c.622]

При температурах выше 68° фенол и вода смешиваются в любых соотношениях [14 J. При охлаждении гомогенная смесь разделяется на два слоя верхнюю водную фазу, насыш енную фенолом, и нижнюю фенольную, насыщенную водой. Так, при 15° вода содержит 8,2% фенола, а в феноле растворено 37,4% воды. Если грамотрицателъные бактерии обрабатывают гомогенной смесью равных объемов фенола и воды при 65—68° [9], клетки быстрее разрушаются и значительная часть (до 40%) бактериальных веществ переходит в раствор. После охлаждения до 5—10° и центрифугирования получаются три фракции водный слой, фенольный слой и нерастворимый ни в воде, ни в феноле остаток (методика В в работе [9]). Водная фаза после диализа содержит бактериальный липополисахарид (О-антиген, эндотоксин [И, 12[), свободный от белка, и нуклеиновую кислоту. Липополисахарид и нуклеиновую кислоту можно разделить различными способами, например осаждением спиртом [9, 15, 16] (см. также стр. 285), ультрацентрифугированием [15], избирательным осаждением нуклеиновых кислот катионными детергентами, например цетилтриметиламмоний бромидом (цетавлон) [17, 17а], или комбинацией этих способов. [c.327]

Для получения информации о связи химического строения с иммунологической специфичностью в системах углевод — антиуглевод применяют следующие типы иммунологических исследований а) количественное осаждение близкородственных полисахаридов гомологичными антисыворотками с последующим построением кривых осаждения [9, 10] б) количественное осаждение гетерологичными или перекрестно реагирующими антисыворотками [11 — 13] в) ингибирование осаждения в гомологичных или перекрестно реагирующих системах олигосахаридами или простыми сахарами [6—8, 11] г) специфическое связывание олигосахаридов с антителом, определяемое методом равновесного диализа [14] д) связывание комплемента и ингибирование связывания комплемента [15, 16] е) получение искусственных антигенов с углеводными детер-минантными группами конденсацией простых сахаров известного строения с белками через азофенильную группу и сравнение специфичности появляющихся антител с известными изменениями в структуре введенных групп [17, 18] или использование, гаптенного ингибирования для выяснения специфичности антисыворотки [19—22]. [c.431]

Реакция антиген — антитело не происходит, если взаимодействующие белки подвергнуты денатурации. Поэтому можно считать, что взаимодействие между ними зависит от точной комплемептарности молекулярных поверхностей двух нативных белков. Эффективный метод исследования специфичности таких взаимодействий был разработан Ланд-штейнером, который получал антигены путем спаривания белков с многочисленными диазотированными производными анилина. Он обнаружил, что специфичность антител, создаваемая такими сопряженными антигенами, определяется в основном заместителями (гаптенами). Так как антитело будет также взаимодействовать с гаптенами, присоединенными к малым молекулам, равновесие при ассоциации может быть определено при диализе [1007]. Типичные данные такого рода были получены Карушем [1099], который изучал антитела к сопряженному белку, несущему D-изомер гаптеновой группы [c.340]

Из-за своих белковоподобных свойств описываемый продукт получил название протеиноида. Протеиноид не проявляет никаких антигенных свойств в опытах на морских свинках и кроликах, а также в опытах с использованием полосок миометрия, но это может быть связано с низким молекулярным весом и гетерогенностью продукта. Степень разветвленности полимера не исследовалась. Во многих случаях протеиноид гидролизуется кислотой или щелочью не полностью. Крупные молекулы протеиноида не диффундируют через коллодиевьге мембраны при диализе. Изо-электрическая точка протеиноидов, полученных из смесей, содержащих избыток глутаминовой и аспарагиновой кислот, лежит в области 2,8, а изоэлектрическая точка лизиновых протеиноидов — в области 8,4. [c.202]

Вначале активная фракция, содержащая Ви-антиген, осаждается спиртом (концентация 27—71%) после насыщения экстракта хлористым натрием. Полученный осадок после диализа переосаждается при тех же концентрациях спирта после под-кисления до pH 3,5—3,8. Наконец, третье осаждение производится в более узком интервале концентраций спирта (27, 46, 52%) после кислотного гидролиза, разрушающего остатки 0-антигена. [c.574]

Реакцию низкомолекулярного гаптена с антителами можно оценить с помощью прямых реакций, сргди которых наибольшее применение получил метод равновесного диализа (см. гл. 12). Полученные в эксперименте данные позволяют рассчитать константу равновесия (Д) в системе гаптен-антитело (см. гл. 4 и 12). Если определять величины константы равновесия при реакции антител к определенному конъюгированному антигену с рядом сходных по строению гаптенов, можно оценить вклад каждого радикала в структуру детерминантной группы. При этом удобно сопоставлять сродство к антителу какого-то аналога детерминантной группы со сродством наиболее близкого к ней по строению гаптена ре-ференс-гаптен). Таким способом получают относительную величину константы связывания Кот) Дотн= = Кх/Кр.г, где Кх — константа связывания исследуемого аналога, Кр.г — константа связывания референс-гаптена. [c.24]

Для элюирования антигенов клеточной поверхности мы в нашей практике обычно используем 50 мМ H I-диэтиламиновый буфер, pH 11,5, содержащий 0,5% дезоксихолата, и сразу же после элюирования нейтрализуем элюат глицином. Затем определяем поглощение при 280 нм и измеряем антигенную активность препарата. Выход препарата обычно составляет около 50% от количества антигена, нанесенного на колонку. Фракции элюата концентрируем ультрафильтрацией и, если необходимо, освобождаем от дезоксихолата с помощью диализа. Однажды при очистке Т-лимфоцитарного антигена, названного MR ОХ-34, мы не смогли определить в элюате ни антигенной активности, ни даже поглощения при 280 нм. При этом в экстракте, элюированном с колонки после нанесения антигена, антигенной активности тоже не было. Мы попробовали провести элюцию 0,5 М пропионовой кислотой без детергента и добились успеха, причем с хорошим выходом антигенной активности (А. F. Williams, неопубликованные данные). То же самое было в случае с крысиным антигеном D4(W3/25). Элюирование щелочным буфером дало неудовлетворительные результаты, но пригодным оказался 0,1 М H l-глициновый буфер, pH 2,5 [30]. При этом с колонки элюировался белок с нужной мол. массой,, однако его антигенная активность частично была потеряна. Критериями очистки в данном случае служил сам факт утраты антигенной активности исходного экстракта после нанесения на колонку, а также элюирование из нее белка с известной мол. массой. [c.179]

Наиболее чистые (по данным электрофореза) фракции, содержащие антигенную активность, объединяют, концентрируют и диализуют против 0,1 М ЫН4НСОз, чтобы удалить дезоксихолат до биохимического анализа. При электрофорезе чистый антиген мигрирует в виде слегка размытой полосы (рис. 5.9), что, по-видимому, вызвано высоким содержанием углеводов. [c.193]

Препарат мембран (разд. II, Б) разводят в 1 мл буфера T P и добавляют 1 мл 10%-ного тритона Х-100. После инкубации в течение 15 мин раствор осветляют в настольной центрифуге (Eppendorf) центрифугированием в течение 10 мин при 4°С. Колонку с иммобилизованными на сефарозе моноклональными антителами 9.178 уравновешивают ТСР-ТХ, а затем в колонку вносят солюбилизированные мембранные белки при скорости потока 0,2 мл/мин. После этого колонку промывают десятью объемами ТСР-ТХ до тех пор, пока элюат не будет содержать радиоактивной метки. Н-2К -антиген элюируют с колонки, используя ТСР-ТХ с 1 М Na l. Фракции, обладающие наибольшей радиоактивностью, объединяют и диализуют в течение ночи против ТСР-ТХ. С колонки элюируется около 70 7о связанной с ней радиоактивности. [c.153]

В 34 главах изложены методы определения, выделения и очистки антител (включая дансилироваиие, двумерную хроматографию, изоэлектрофокусирование, электрофорез в полиакриламидном геле и изотахофорез) методы определения констант равновесия (равновесный диализ, равновесная фильтрация и седиментация) способы маркировки реагентов изотопами и флуоресцентными красителями и определение компонентов клеточной поверхности меры предосторожности при работе в изотопной лаборатории методы химической модификации белков, гаптенов и нерастворимых носителей приемы получения аитн-сывороток к аллотипам и антигенам гистосовместимости и получения антител доминирующего клонотипа методы оценки гистосовместимости и реакций в смешанной культуре лимфоцитов методы разделения клеток на гелях, несу- [c.7]

Недостатки метода столь же многочисленны. Во-первых, приемлемые размеры антигенных частиц ограничены снизу наименьшим размером пор, еще пропускающих антитела, а сверху — необходимостью обеспечить нужную плотность эпитопов и при этом избежать блокирования фильтра. Во-вторых, метод не годится для измерения малых аффинностей — по той же самой причине, что большое количество антигена может блокировать фильтр. В-третьих, поливалентность крупных антигенных частиц при равновесной фильтрации порождает те же проблемы, что и при равновесном диализе. В-четвертых, метод основывается на сравнении титров антител и, следовательно, не может претендовать на точность, присущую химическим измерениям. В-пятых, он требует специальных приемов для раздельного определения количества и качества антител. [c.39]

Фактор, ингибирующий миграцию макрофагов, появляется в среде через 6—8 часов контакта лимфоцитов с антигеном и продолжает продуцироваться в течение 4 дней (Thor а. oth., Svej ar а. oth., 1968). Показано, что появление фактора, ингибирующего миграцию макрофагов, в среде блокируется ингибиторами белкового синтеза. Отсюда следует, что фактор синтезируется в клетках de novo, а не просто освобождается при контакте с антигеном. Известны некоторые биохимические характеристики фактора, ингибирующего миграцию макрофагов. Фактор не диализуется и выдерживает нагревание при 56° в течение 30 минут. На него не оказывают действия РНК аза и ДНК аза, но он разрушается протеолитическими ферментами. Молекулярный вес фактора, ингибирующего миграцию макрофагов, составляет 60 ООО — 80 ООО. При изучении в электрофорезе показано, что фактор, ингибирующий миграцию макрофагов, содержит альбумин и а-глобулин. [c.140]

Е. granulosis, получали центрифугированием 15 мин при 200 g с последующим диализом (в течение ночи) против карбонатного буфера, pH 9,6. Перед использованием все препараты антигенов подвергали ультрацентрифугированию при 100000 g (2 ч при 4 °С). [c.369]

Еще более высокой избирательностью отличается постановка эксперимента в работе Эрлиха и соавторов. Они ввели еще одну ступень отбора антигенов. На ДБМ-бумагу из геля переводили не все белки, а преимущественно специфические антигены. С этой целью к диазобумаге предварительно присоединяли антитела к этим антигенам, точнее их фрагменты, содержащие оба центра связывания антигенов, но лишенные неизменной части F - В гл. 1 такие фрагменты были обозначены Р(авог Для их получения частично очищенную антисыворотку диализом переводили в 0,1 М Hj OONa (pH 4,3) и в этом растворе обрабатывали пепсином (0,4 мг/мл) в течение 8 ч при 37°. Ог-резанные таким образом фрагменты F задерживали на им- [c.131]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология