Гель-фильтрация декстран

Еще одна особенность хроматографии макромолекул связана с проблемой доступности всего объема неподвижной фазы внутри гранул. Ограничение такой доступности вследствие статистического разброса размеров пор пространственной сеткн гранул используется для фракционирования макромолекул по размерам в методе гель-фильтрации, одиако в других вариантах хроматографии ограничение доступности не только уменьшает емкость системы, но и существенно затрудняет установление равновесия в неподвижной фазе. В этом плане обычные микропористые обменники на основе силикагеля, стекла п полистирола существенно уступают крупнопористым матрицам из целлюлозы и даже декстрана. К сожалению, матрицы двух последних типов легко деформируются и потому непригодны для хроматографии при повышенном давлении. Правда, в последние годы путем специальной обработки удалось получить крупнопористые, пригодные для фракционирования белков матрицы и из перечисленных выше жестких материалов их марки и характеристики приведены ниже. [c.47]

Проверку качества набивки колонки с апиопообменнпком нельзя вести с помощью голубого декстрана, как рекомендовалось для гель-фильтрации, так как голубой декстран на нем сорбируется. Его следует заменить раствором щелочного красителя, например малахитового зеленого. Для катиоиообменников рекомендуется использовать кислый краситель (например, кислый оранжевый II). [c.281]

Для Э. X. используют макропористые неорг. или полимерные сорбенты. Для Э. х. полярных полимеров неорг. сорбенты (силикагели и макропористые стекла) модифицируют кремнийорг. радикалами, а дги Э. х. гидрофильных полимеров -гидрофильными фуппами. Среди полимерных сорбентов наиб. распространены стирол-дивинилбензольные (для Э.х. высокополимеров и олигомеров). Для гель-фильтрации биополимеров, превде всего белков, используют гидрофильные полимерные сорбенты (сефадексы - декстраны с поперечными сшивками, а также полиакриламидные гели) или модифицированные полисахаридами макропористые силикагели. [c.411]

Диализ [121] и ультрафильтрация [122] основаны на применении в качестве полупроницаемого барьера тонкой мембраны (например, из ацетата целлюлозы — целлофана), имеющей поры диаметром 1—10 нм (чаще всего 5 нм). Малые молекулы такая мембрана пропускает, а крупные задерживает. Диализ определяется диффузией, и его можно ускорить перемешиванием раствора, а скорость фильтрования зависит от разности давлений по разные стороны мембраны. Более сложный характер имеет гель-фильтрация [123]. Колонку наполняют материалом типа декстрана с большим числом поперечных сшивок (сефадекс ) . обычно он имеет вид спрессованных мягких шариков. Шарик представляет собой трехмерную сеть из углеводных цепей (рис. 2-18). Пространство между цепями (оно зависит от числа сшивок, образующихся в геле при его химической обработке) недостаточно для проникновения туда крупных молекул, но в нем вполне могут задерживаться малые молекулы. При пропускании через такую колонку смеси разных моле- [c.162]

Для разделения и концентрирования ферментных белков часто используют метод гель-фильтрации с применением сефадексов—полимерных цепей полисахарида декстрана, соединенных через определенные промежутки поперечными связями и образующих своеобразные молекулярные сита, способные разделять белки в соответствии с их молекулярной массой [48, 49]. [c.170]

При гель-фильтрации наиболее употребительны два типа гелей гели, полученные путем ферментирования декстрана (сефадексы), и синтетические гели акриламида (биогели). Акриламидные гели обладают низкой адсорбционной способностью, поэтому при равной разрешающей способности для них характерен больший выход фракционируемого вещества, чем для гелей декстрана. [c.37]

Для тонкослойной гель-фильтрации слой носителя готовят из самых мелких гранул геля. Из препаратов, имеющихся в продаже, применяются гели декстрана марки сефадекс сверхтонкий или полиакриламидные биогели марки —400 меш . В описанных в литературе методиках тонкослойной гель-хроматографии в основном [c.238]

Гель-хроматография (гель-фильтрация, или ситовая хроматография) — метод разделения, очистки и анализа веществ, основанный на различии в размерах или массе молекул. В качестве стационарной фазы используют различные гели с трехмерной сетчатой структурой декстраны (полисахариды), полиакри ламиды, пористые силикагели, цеолиты и др. При разделении смеси небольшие молекулы диффундируют через поры набухшего в растворителе геля, а крупные молекулы проходят через пространство между частицами геля. При промывании геля растворителем в первую очередь перемещаются крупные молекулы, а затем уже мелкие, т. е. компоненты смеси элюируют в порядке уменьшения их молекулярной массы. Гель действует как молекулярное сито. Аппаратурная простота метода и мягкие условия разделения способствовали особенно широкому применению гель-хроматографии в биохимических исследованиях. Основное назначение гель-хроматографии — разделение высокомолекулярных веществ. С ее помощью выделены и очищены многие ферменты, пептидные гормоны, нуклеиновые кислоты. [c.498]

Все применяемые в гель-хроматографии наполнители колонок традиционно делят на мягкие, полужесткие и жесткие гели [101]. Емкость геля может быть охарактеризована отношением У /У , которое лежит в диапазоне от 0,5 для жестких гелей до 2-3 для мягких гелей. Для мягких гелей характерна, с одной стороны, высокая эффективность и емкость при низких скоростях потока, с другой — высокая степень набухаемости в водных средах и увеличение объема пор при набухании. Соответственно повышение скорости подвижной фазы вызывает деформацию мяг-Ю1Х гелей. Они сжимаются, снижается их емкость. Из коммерческих мягких гелей для гель-фильтрации чаще всего применяют декстрановые гели, названные сефадек-сами. Сефадексы — гранулированные поперечно-сшитые декстраны (полисахариды), имеющие в набухшем состоянии гелевую структуру, обладают сильными гидрофильными свойствами. Неионообменные сефадексы содержат все же небольшое количество гидроксильных групп, определяющих адсорбционную емкость сефадексов порядка [c.209]

Молекулярно-ситовая хроматография. При данном виде хроматографии используется способность материалов с контролируемой пористостью сортировать и разделять компоненты смеси в соответствии с размерами и формой их молекул. Для осуществления процесса гель-хроматографии используются гели поперечно-емкостного декстрана (сефадексы и сефакрилы), поперечно-сшитые полиакриламидные гранулы (биогели), агарозные гели с выраженными в них цепями акриламидного полимера (ультрагели) и более жесткие поперечно-сшитые агарозы (СЬ-агарозы и сефакрилы-8), с помощью которых можно быстро разделить макромолекулы в соответствии с их размером. Степень удерживания растворенного вещества на колонке зависит от его способности проникать в поры геля. Поэтому при гель-фильтрации сначала выходят высокомолекулярные вещества, а затем вешества в порядке убывания их моле- [c.55]

В гель- проникающей хроматографии с органическими растворителями гораздо шире используются более высокие скорости потока в колонке (этот вопрос обсуждается в заключении этой главы). Это возможно, поскольку полистироловые смолы, используемые в работе с органическими растворителями, имеют гораздо более жесткий скелет и обладают гораздо лучшими механическими свойствами, чем декстра-новые зерна, применяемые в гель-фильтрации. [c.598]

Обессоливание. В разделе, посвященном ионному обмену, уже отмечалось, что при анализе биохимических проб для сохранения активности ферментов или для проведения некоторых разделений часто используют буферные растворы. В результате выделения получают водный раствор искомых соединений, а также электролиты, которые входят в состав различных буферных растворов. Если работают с декстрано-вым гелем, который будет исключать молекулы пробы, то обессоливание раствора пробы можно выполнить посредством гель-фильтрации. Для этого нужно только ввести в колонку солевые растворы пробы, а элюирование проводить чистой водой. Относительно небольшие [c.598]

В 1959 г. Флодин и Порат [30] получили продукт взаимодействия растворимого декстрана с эпихлор-гидрином этот продукт оказался универсальным гелем, который вскоре начали вырабатывать в промышленных масштабах и выпускать в продажу под торгов-вым названием сефадекс . Следствием этого открытия явилось быстрое и повсеместное распространение хроматографического метода разделения по молекулярному весу, известного теперь под названием гель-фильтрации. Первые образцы геля обладали низкой [c.24]

Создание метода гель-фильтрации на гелях сшитого декстрана (сефадекс) дало в руки исследователей новый принцип разделения водорастворимых соединений — фракционирование по величине молекул [1]. Область применения гелей сефадексов охватывает веш ества с молекулярным весом от 100 до 300 000. По-видимому, полиакриламидные гели, введенные в употребление Хьертеном. и Мосбахом [2], обладают аналогичными свойствами. Дальнейшее расширение возможностей метода связано с созданием сферических гелей агарозы различной пористости [3] (см. разд. 5.7.1). В настоящее время гель-фильтрация находит широкое применение, особенно в различных областях биохимии (см. обзор Детермана [4]). [c.256]

Поскольку при элюировании фронт растворителя неразличим, скорость движения растворителя определяют и регулируют с помощью соединений-маркеров. Для этой цели служат окрашенные белки природного происхождения, например гемоглобин и цитохром с [9] или же белки с флуоресцентной меткой, присоединенной, например, с помощью флуоресцеинизотиоцианата [8]. Однако наиболее подходящими и хорошо различимыми маркерами являются, по-видимому, бычий сывороточный альбумин и альбумин человека, окрашенные амидо-черным В [14]. Декстра-новый синий, применяемый в гель-фильтрации на колонках для определения свободного объема, является плохим маркером, поскольку при фракционировании он имеет обыкновение давать хвосты . В зависимости от скорости движения маркеров регулируют угол наклона пластинки, задавая тем самым скорость движения элюента. При работе на сефадексе 0-200 скорость веществ, мигрирующих со свободным объемом (т. е. не проникающих в гранулы геля), не должна превышать 2 см/ч на гелях сефадекса с более высокой степенью сшивки скорость может быть несколько больше. Указать заранее оптимальный угол наклона для данного типа геля невозможно, поскольку он зависит от многих факторов, например от свойств партии геля и консистенции суспензии. Пробег для веществ, мигрирующих со свободным объемом, должен составлять не менее 15 см. При большем пробеге (до 30—40 см) наблюдается лучшее разрешение и вместе с тем не происходит заметного размывания зон. [c.260]

Для разделения сложных смесей органических веществ и отделения их от неорганических веществ пользуются также так называемой гель-фильтрацией, например, ные полисахарида декстрана [c.15]

В последние годы для разделения сложных смесей органических веществ и отделения их от неорганических веществ пользуются так называемой гель-фильтрацией, например, на сефадексах. Сефадек-сы — производные полисахарида декстрана, между цепями которого имеются поперечные связи. Сефадексы набухают в воде и водных растворах, образуя гель. При фильтровании через такой гель крупные молекулы не проникают в мелкие поры сефадекса и при промывании не задерживаются им. Мелкие люлекулы проникают в поры н выходят позднее крупных, мелкие неорганические люлекулы удер/киваются сефадексом особенно долго. Подбирая сефадексы [c.15]

Это совершенно своеобразный вид хроматографии, основанный на использовании различия в размерах молекул. Его называют также гель-фильтрацией или ситовой хроматографией. Неподвижной фазой в гель-хроматографии является растворитель, находящийся в порах геля, а подвижной — сам растворитель, т. е. и подвижную и неподвижную фазы составляет одно и то же вещество или одна и та же смесь вещества. Гель готовят на основе, например, декстрана, полиакриламида или других природных и синтетических соединений. [c.350]

Применяемые на практике гели обычно подразделяют на мягкие, полужесткие и жесткие. Мягкими гелями являются высокомолекулярные органические соединения с незначительным число поперечных связей. Фактор емкости, равный отношению объема растворителя внутри геля к его объему вне геля, у них равен 3. При набухании они значительно увеличивают собственный объем. Это сефадексы или декстрано-вые гели, агарочные гели, крахмал и др. Они применяются для разделения смесей низкомолекулярных веществ, часто в тонкослойном варианте. Хроматографирование на мягких гелях называют гель-фильтрацией. [c.351]

В полной мере этот эффект начали использовать после 1959 г., когда Порат и Флодин, [44] опубликовали работу, посвященную разделению соединений на гелях сшитого декстрана, и описали быстрый и простой метод фракционирования водорастворимых веществ (этим утверждением начиналась их статья). Они назвали предложенный метод гель-фильтрацией. В то же время фирма РЬагтас1а (Упсала, Швеция) наладила выпуск сефадекса — сшитого декстрана. И это, по-видимому, и явилось основной причиной быстрого развития и широкого распространения метода, который вскоре был освоен и начал применяться почти во всех отраслях биохимии. В настоящее время, когда со дня первой публикации прошло более 20 лет, [c.339]

Большинство работ по гель-фильтрации было проведено при использовании мягких наполнителей, таких, как гель декстрана — сефадекс. Эти мягкие гели не пригодны для высокоэффективной жидкостной хроматографии, так как слой наполнителя быстро оседает при давлениях порядка 0,6—0,8 ат. [c.32]

Декстраны, особенно в области небольших молекулярных весов, иногда склонны кристаллизоваться [7]. Образцы частично кристаллического декстрана неудовлетворительно фракционируются с помощью осаждения или экстракции из-за изменившейся растворимости. Однако можно ожидать, что метод гель-фильтрации применим и в этих случаях. [c.273]

Ниже изложены экспериментальные условия гель-фильтрации и некоторые результаты, полученные при фракционировании декстрана (см. также стр. 280). [c.273]

Гранатом и Флодином [10]. Определены предельные размеры молекул, которые можно фракционировать на сефадексах 0-25 — 0-75 (И ,. -= 2,3—8,7). Эффективность метода гель-фильтрации иллюстрируется разделением смеси двух фракций декстрана (рис. 2). [c.276]

На рис. 5 приведены интегральные кривые распределения по молекулярным весам для образца клинического декстрана реомакродекс (Л/ц, == 38 ООО, М,1 = 22 400, [т]] = 0,187), вычисленные по [т]] фракций, полученных при фракционной экстракции и при гель-фильтрации на дек-страновых гелях с ] г = 11,2 15,8 и 20,5 (0-200). Объем слоя геля сефадекса 0-200 был равен 3000 мл, а других сефадексов — только 1700 мл. Во всех случаях использовался раствор 6 г декстрана в 150 мл. [c.278]

Для гель-фильтрации используются так называемые молекулярные сита — инертные гидратированные полисахаридные материалы, представляющие собой пористые гранулы. Их получают на основе декстрана (сефадекс — бактериальный полисахарид), агарозы (из некоторых морских водорослей) или полимеризованных акриламид-ных гелей (акрилекс). [c.58]

Колонку для разделения веществ заполняют гелем, полученным при гидратировании сефадекса 0-200 изотоническим раствором хлористого натрия. Слой последнего всегда должен находиться над гелем, чтобы он не высыхал. На поверхность геля наносят 2-3 капли раствора, представляющего собой смесь трех веществ голубого декстрана (ММ 10 ), рибофлавина (ММ З-Ю ) и гемоглобина (ММ 64,6-103). Раствор для фракционирования должен сначала впитаться гелем. Затем в колонку дважды вносят по 2 мл изотонического раствора хлористого натрия. После этого подключают капельницу с изотоническим раствором хлористого натрия, предназначенным для элюирования разделяемых веществ. При разделении смеси для гель-фильтрации необходимо следить, чтобы в колонке был ток жидкости, т.е, открьгг за- [c.58]

Гель-фильтрация — метод молекулярного просеивания молекул через набухшие гранулы сефадекса (трехмерные полисахаридные цепи декстра-на, имеющие поры). Скорость прохождения белков через колонку, заполненную сефадексом, будет зависеть от их молекулярной массы чем меньше масса молекул, тем легче они проникают внутрь гранул и дольше там задерживаются, чем больше масса, тем быстрее они элюируются с колонки. [c.30]

Выпускаемые фирмой Pharma ia hemi als сефадексы — гели, полученные на основе декстрана, — впервые были введены в практику Поратом и Флодином 1[125] и вскоре получили общее признание в качестве материалов для гель-фильтрации, с помощью которых можно быстро разделить макромолекулы в со- [c.197]

Более просто молекулярную массу белка можно определить методом гель-филь-трации, или молекулярного просеивания. Этот метод основан на применении специальных полимерных веш еств, набухшие зерна (гранулы) которых имеют поры определенного размера. Часто используют сефадекс, гранулы которого построены из трехмерной сети полисахаридных цепей декстрана. Небольшие молекулы растворенных веш еств легко диффундируют внутрь зерен сефадекса, в то время как диффузия крупных молекул затруднена. Это явление лежит в основе разделения веш еств (молекулярного просеивания) методом гель-фильтрации. [c.44]

Сефакрил (фирма РЬагтас1а). Зернистый гель, получаемый ковалентным сшиванием аллил-декстрана N, N -мeтилeн6и aкpилaмидoм. Поперечное сшивание обеспечивает высокую химическую и термическую устойчивость и механическую прочность. Гель может быть использован в водных буферных системах при pH 2 н- 11, в ДСН, 8 М мочевине и 6 М гуанидингидрохлориде и ряде органических растворителей, хотя последние могут вызывать небольшое уменьшение объема геля по сравнению с объемом в воде. Структура геля не меняется при нагревании, гель можно неоднократно автоклавировать при 120°С и pH 7. Поставляется в набухшем состоянии. Благодаря жесткой структуре гель может выдерживать высокое рабочее давление (до 150-300 см Н2О), что позволяет использовать высокие скорости фильтрации (до 25-40 см/ч), которые и рекомендуются при колоночной хроматографии. Для фракционирования со средним уровнем разрешения рекомендуется скорость фильтрации 10 см/ч для высокого разрешения следует использовать более низкие скорости фильтрации. [c.444]

Сефадекс состоит из молекул декстрана, образующих сетчатую структуру, в сухом состоянии он представляет собой тонкий порошок, сильно набухающий в воде и образующий при этом полупрозрачный гель, которым заполняют хроматографическую колонку, подобно тому, как это делают в случае окиси алюминия. Полярные свойства следует отнести почти исключительно на счет содержания гидроксильных групп. Увеличение степени сетчатости приводит к уменьшению пористости трехмерной решетки, в результате чего поглотительная способность зависит от размера молекул. Молекулы меньших размеров поглощаются в большей степени и поэтому при фильтрации через гель движутся медленнее больших молекул. [c.409]

Сальватор и др. [117] сделали критический обзор методов очистки тиреоглобулина и предложили улучшенные методы получения практически гомогенного тиреоглобулина с выходом 60—70%. Эти авторы рекомендуют одноэтапный процесс очистки с использованием или фильтрации на геле (агара или декстрана) или ультрацентрифугирования в градиенте плотности. Первый метод целесообразно использовать для получения больших количеств белка. [c.230]