Особенности работы с мембранными ферментами

Метод моделирования и получения искусственных мембран основан на получении и исследовании моно- и бимолекулярных липидных слоев, везикул, липосом и протеолипосом. Сущ ествует два основных типа искусственных мембран классические плоские и сферические мембраны различного размера. Для получения искусственных мембран используют различные фосфатиды, нейтральные глицериды, смеси липидов биологического происхождения, добавляя к ним холестерин, а-токоферол и другие минорные добавки. Потенциальная ценность искусственных мембран для исследований зависит от возможности включения в них природных белков, в особенности тех, которые обладают транспортными свойствами. Липосомы, со-стоящ ие из белков и липидов, стали получать в 60-е гг. термин протеолипосомы был введен В. П. Скулачевым. В настоящее время разработан целый ряд методов приготовления различных типов липосом и протеолипосом, а также их стандартизации по размерам, структуре, гомогенности, стабильности и другим характеристикам. Липосомы используют для доставки в клетку лекарственных и химических соединений, стабилизации ферментов в инженерной энзимологии, введения в клеточные мембраны молекул зондов, модифицирующих и моделирующих их поверхность. Большой интерес для генной инженерии и медицины представляют работы по введению в клетки при помощи липосом нуклеиновых кислот и вирусов. В липосомы включают митохондриальные компоненты и изучают на таких модельных системах процессы генерации энергии в клетках. Ультра-тонкие искусственные мембранные структуры — полислои Лен-гмюра—Бложе (ПЛБ) — применяют для получения био- и иммуносенсоров. Создаются ПЛБ с иммобилизованными ферментами и компонентами иммунологических систем. При использовании смешанных липид-белковых пленок ПЛБ получают информацию о функционировании белков и о липид-белковых взаимодействиях в мембране. Результаты изучения физических характеристик, проводимости, проницаемости и других свойств искусственных липидных мембран имеют большое зна- [c.216]

Участие компонентов биомембран в осуществлении и регулировании метаболических процессов в клетке. Общая характеристика процессов передачи информации в клетке. Понятие о первичных и вторичных мессенджерах. Классификация, особенности структурно-функциональной организации мембранных белков-рецепторов. Характеристика аденилатциклазного и фосфо-инозитидного пути передачи сигнала в клетку. Роль ионов в осуществлении метаболических процессов с участием мембран. Адсорбционный тип регуляции метаболизма. Понятие о метаболоне, физиологическое значение его образования. Пространствен-но-структурная организация ферментных систем клетки (на примере гликолитического комплекса и цикла Кребса), Экспериментальные исследования взаимодействия ферментов гликолиза с различными структурными компонентами клетки. Модели структуры гликолитического комплекса в скелетных мышцах и на внутренней поверхности мембран эритроцитов. Эстафетный механизм работы ферментов в клетке. Механизмы регулирования функциональной активности векторных ферментов биомембран. Пути нейрогуморальной регуляции функций клеток. [c.284]

Большинство работ по изучению биосинтеза природных соединений проводилось на целых растениях и интактных микробных клетках. Такой подход обычно применим для ряда простых предшественников, которые легко преодолевают барьер клеточных стенок однако иногда, особенно в случае сложных предшественников, например олигопептидов, проницаемость клеточных мембран может стать серьезным ограничением. Даже если этот фактор ие стал лимитирующим, сложные промежуточные соединения внутри клетки могут подвергаться действию других ферментов, помимо ферментов, участвующих в исследуемом биосинтетическом пути. В этой связи понятно, что дальнейший прогресс в изучении биосинтеза невозможен без привлечения специальных биохимических методов, в особенности техники работы в бесклеточных системах и с фракционированными ферментами. В последние годы в этом направлении наметились определенные сдвиги [15]. [c.349]

Вся совокупность имеющихся в настоящее время данных убеждает в том, что биоэлектрогенез у высших растений является столь же важным физиологическим отправлением, как и у животных. Чем глубже мы познаем особенности генерации потенциалов покоя и потенциалов действия в растительном организме, тем яснее становится их значительная роль в осуществлении многих процессов, протекающих на мембранном, клеточном и тканевом уровнях, — работе мембраносвязанных ферментов, ионном и молекулярном мембранном транспорте, осуществлении регуляторных связей и др. Поэтому раскрытие механизмов биолектрогенеза несомненно существенно для познания таких важных комплексных физиологических свойств высших растений, как устойчивость к неблагоприятным внешним факторам, адаптация к меняющимся условиям среды, способность ассимилировать питательные вещества и т.д. [c.191]

ОСОБЕННОСТИ РАБОТЫ С МЕМБРАННЫМИ ФЕРМЕНТАМИ [c.92]

Мышечная работа вызывает изменение содержания в крови белков и продуктов их распада. Отмечается увеличение содержания белков в плазме крови (в частности, белков-ферментов) за счет их выхода из работающих мышц, а также изменяется соотношение между различными белками крови, увеличивается количество продуктов белкового распада — аминокислот, поступающих из мышечных клеток и печени, аммиака, мочевины. Изменения белкового обмена зависят от длительности работы. Так, при кратковременной работе выход белков из тканей в кровь незначителен, а при длительной работе, когда проницаемость клеточных мембран сильно изменяется, белок может проникать через клеточные мембраны почек и появляться в моче. Уровень аммиака особенно возрастает в случае, когда не устанавливается устойчивое состояние метаболизма, а также при длительной утомительной мышечной нагрузке. Длительная работа приводит также к увеличению содержания в крови мочевины. [c.344]

В результате применения указанного подхода получили научное обоснование и объяснение ряд особенностей строения, функционирования и происхождения известных биоструктур. Так, при рассмотрении механизма передачи энергии по ССИВС авторы приходят к выводу об эффективности существования и преимуществах естественного отбора дуплицированных систем сопряженных связей, обладающих вращательной симметрией структур и оптической активностью составляющих их компонентов, а при рассмотрении возможного механизма действия ферментов с учетом принципа дупликации работающих структур ими объяснена причина известного явления половинной реакционной способности от общего числа активных центров ферментов. При построении модели биологических мембран обосновано происхождение их многоуровневого зонно-блочного строения с периодической повторяемостью блоков, с образованием каналов йереноса электронов и синхронного сдвига протонов по системам сопряженных ионно-водородных связей и с колебательным режимом их работы, согласующегося с известными свойствами мембран и рядом других фактов. Эффективным оказалось применение указанного подхода и при рассмотрении происхождения структурных особенностей и функционирования мультиферментных комплексов и метаболонов, объединяющих разные ферменты метаболических путей со структурными элементами клетки, в случае процессов гликолиза и цикла трикарбоновых кислот. Все это описано в работе хорошо, убедительно и представляет самостоятельную ценность. Очевидна также перспективность применения такого подхода для изучения связи особенностей строения и функционирования с происхождением и других типов надмолекулярных структур биообъектов и их эволюционных предшественников. [c.5]

До сих пор мы говорили лишь об одном возможном механизме ионного транспорта, опосредованного переносчиками. Необходимо, однако, помнить о том, что суш,ествуют и многие другие способы переноса веш,еств через мембрану. На рис. 6.11 приведены некоторые важнейшие виды транспортных механизмов, обнаруженные в биологических мембранах. В левой части рисунка изображены простейшие способы переноса — пассивная диффузия ионов (1) и массовый поток жидкости (2). Далее следует пассивная диффузия, опосредованная переносчиком,— либо в одном направлении (3), либо в обоих (4). Весьма распространена такая пассивная диффузия, при которой перенос какого-либо вещества сопряжен с транспортом другого вещества так, во многих клетках осуществляется сопряженный перенос сахаров и аминокислот с Ма+ по градиенту концентрации этого иона (5). Наконец, существуют такие системы транспорта, для работы которых требуется энергия. К ним относятся насосы того типа, который мы только что рассмотрели (6) (источником энергии для работы таких насосов служат макроэргические фосфаты), и протонный насос (7), действующий во внутренней мембране митохондрий (см. гл. 4). Поставщиками энергии для работы протонного насоса служат дыхательные ферменты. Все эти механизмы действуют в биологических мембранах, но, кроме того, некоторые из них были воспроизведены и на искусственных мембранах, составленных из различных органических веществ. Это обстоятельство, открывающее широкие возможности для экспериментального анализа, свидетельствует о том, что особенности процессов переноса в значительной степени определяются свойствами органических молекул и макромолекулярных комплексов, образующих монослои или очень тонкие мембраны. [c.146]

Вторичный активный транспорт ионов. Помимо ионных насосов, рассмотренных выше, известны сходные системы, в которых накопление веществ сопряжено не с гидролизом АТФ, а с работой окислительно-восстановительных ферментов или фотосинтезом. Транспорт веществ в этом случае является вторичным, опосредованным мембранным потенциалом и/или градиентом концентрации ионов при наличии в мембране специфических переносчиков. Такой механизм переноса получил название вторичного активного транспорта. Наиболее детально этот механизм рассмотрен Питером Митчелом (1966 г.) в хемиосмотической теории окислительного фосфорилирования. В плазматических и субклеточных мембранах живых клеток возможно одновременное функционирование первичного и вторичного активного транспорта. Примером может служить внутренняя мембрана митохондрий. Ингибирование АТФазы в ней не лишает частицу способности накапливать вещества за счет вторичного активного транспорта. Такой способ накопления особенно важен для тех метаболитов, насосы для которых отсутствуют (сахара, аминокислоты). [c.46]

Особенностью наружных сегментов палочек сетчатки является то, что в покое (в темноте) потенциал на их цитоплазматической мембране имеет натриевую природу, в отличие от потенциалов покоя нервных и многих других клеток. Это связано с тем, что в состоянии покоя коэффициент проницаемости для натрия значительно превышает значения таких коэффициентов для других ионов (ср. уравнение 8.18). Благодаря этому по электрохимическому градиенту внутрь движется постоянный поток ионов натрия. Натрий, накапливается в цитоплазме наружного сегмента, а затем через ножку, соединяющую его с внутренним сегментом, пассивно диффундирует во внутренний сегмент. Здесь ионы натрия попадают в целую энергетическую фабрику (скопление митохондрий изображено на рис. 106), где, используя поставляемую митохондриями АТФ, работает фермент АТФ-аза, активно выкачивающий натрий во внешнюю среду. Когда из родопсина под действием света образуется метародопсин II, проницаемость цитоплазматической мембраны для натрия резко снижается, а для [c.250]

Влияют ли липиды на свойства мембранных белков Например, будет ли мембранный белок функционировать в любом бислое или для его работы необходим особый липидный состав Совершенно очевидно, что функционирование некоторых ферментов связано с текучестью мембран. Это особенно легко понять в случае реакций, для протекания которых субстраты или ферменты должны диффундировать в мембране по направлению друг к другу. Имеющиеся данные пока не позволяют ответить на вопрос, различают ли белки бислои с одинаковой температурой перехода, но с разным липидным составом. Отметим, однако, что некоторые белки претерпевают существенные изменения, когда температура при своем изменении проходит область фазового перехода в липидах. [c.231]

Гидролазы. В данной таблице представлены 7 ферментов этого класса, четыре из которых относятся к подклассу гид-ролаз ангидридов кислот (3.6.). Представляется удивительным, что практически ни для одного из ферментов обширнейшего подкласса пептигидролаз (3.4) флип-флоп -механизм не показан [1]. Одним из первых ферментов, для которых был предложен этот механизм катализа, является относящаяся к классу гидролаз щелочная фосфатаза. Однако в настоящее время именно для этого фермента возможность работы по флип-флоп -механизму усиленно оспаривается [36] Особенностью неорганической пирофосфатазы (3.6.1.1.) является обнаружение флип-флоп -механизма фосфорилирования субъединиц в некаталитическом центре [35]. Важным мембранным ферментом, в котором реализуется флип-флоп -механизм, или по терминологии авторов, попеременности мест связывания [50], является Н-АТФ-аза, осуществляющая преобразование энергии цепи переноса электронов в энергию макроэргических связей молекул АТР. Этот же механизм оказался применим и к другим мембранным АТР-азам — Ка, К и Са-зависимым [47, 62, 74, 135, 150], подробно рассмотренным также в обзоре [4]. [c.138]

Ма /К -АТФ-аза была открыта в 1957 г. Й. Скоу во фракции плазматических мембран нервов краба, впоследствии она была обнаружена во всех исследованных клетках животных, особенно велико ее содержание в органах, осуществляющих интенсивный солевой обмен (почки) или выполняющих электрическую работу (мозг, нервы). Ма УК. -АТФ-аза представляет собой олигомерный белок, состоящий из субъединиц двух типов а и р, входящих в состав фермента в эквимолярных количествах (рис. 3.3). Большая субъединица а (-112 кДа) формирует каталитически активный центр, осуществляющий гидролиз АТФ меньшая р-субъединица (-45 кДа) гликозили-рована, при этом углеводные цепи экспонированы на наружной стороне мембраны. [c.58]

Митохотгдриями, или хондриосомами, называются органоиды клетки эукариотов, представляющие собой мембранные внутриклеточные образования. Форма и размеры их различны — от овальных и грущевидных телец до нитевидных или ветвистых. Наиболее полно митохондрии изучены у дрожжей и дрожжеподобных грибов в работах М. Н. Мейселя с сотр. [175, 176], в которых показано, что они не отличаются от митохондрий высших организмов. По своему назначению митохондрии представляют собой центры сосредоточения ферментов энергетического обмена. М. Н. Мейсель обнаружил [175], что клетки дрожжей при брожении содержат меньшее число митохондрий, которые гипертрофированы (бродильный тип клеток). Аналогичная картина наблюдается и в аэробных условиях при избытке углеводов в среде, особенно сахарозы и глюкозы. Цитологически наблюдается бродильная перестройка митохондриального аппарата. [c.71]

В живых организмах существует физиологически нормальный уровень свободнорадикальных процессов и перекисного окисления липидов, необходимый для регулирования липидного состава, проницаемости мембран, и ряда биосинтетических процессов (Бурлакова и др., 1991). В генерировании свободных радикалов в биогенных системах может принимать участие и пероксидаза. Однако, несмотря на многолетние исследования фермента, полностью раскрыть его роль в биогенных системах пока не удается. Это во многом связано с тем, что слабо изученным является механизм действия фермента и, в особенности, устройство активного центра пероксидазы. Поэтому в этой работе мы постарались раскрыгь механизм действия пероксидазы, а также роль фермента в составе антиоксидантной системы живых организмов, обобщая как литературные, так и собственные исследования. [c.6]

Заметно не отличаются методы и в отношении размеров облучаемого кристалла и диаметра фокусного пятна. Так, при определении трехмерной структуры антитела Fab 17/9 (16) с использованием излучения рентгеновской трубки Elliott Gxl8 с вращающимся анодом образец имел размеры 0,30 0,04 0,02 мм , а фокусное пятно составляло всего 0,1 мм. Эти параметры явно не уступают условиям эксперимента с синхротронной радиацией. Можно однако полагать, что ситуация с кристаллизацией белков в последнем случае потенциально несколько предпочтительнее, так как мощное синхротронное излучение и его острый фокус позволяют использовать кристаллы, имеющие меньшие размеры и содержащие большие элементарные ячейки. Примеров, иллюстрирующих такую возможность, пока нет. На сегодняшний день проблема кристаллизации белков в обоих случаях стоит столь же остро, как и десятки лет назад. О трудностях получения качественных монокристаллов требуемой величины говорится почти во всех работах. Типично в этом отношении замечание авторов, исследовавших трехмерную структуру фермента из 839 аминокислотных остатков, липокси-геназу I "Кристаллы белка удалось получить после опробования более тысячи различных условий кристаллизации" [516. С. 1482]. Особенно сложное положение, как уже отмечалось, с кристаллизацией мембранных белков (о предпринимаемых здесь усилиях и относительных успехах см. [517-520]). [c.141]

В практикуме по структуре и функции мембран дается краткий обзор большинства методов. Кроме того, предлагаются лабораторные работы, с помощью которых можно решить много важных вопросов из каких компонентов состоят биологические мембраны какие существуют модели биологических мембран каковы структурные особенности макромолекул и макромолекулярных комплексов какова роль белок-липидных, белок-углеводных, липид-уг-леводных и других взаимодействий где расположены отдельные молекулы в мембране как протекают реакции с участием мембранно-связанных ферментов как трансформируется энергия биологическими мембранами, и др. [c.8]

Многие биосенсоры работают при постоянном потенциале, что существенно упрощает приборное оформление. Однако при этом всегда наблюдается фоновый ток, величина которого может быть значимой при низких концентрациях определяемого вещества. Коррекция фонового тока и градуировка биосенсоров in vivo-две серьезные проблемы, которые требуют надежного решения. Колебания этих параметров могут быть обусловлены отравлением электрода компонентами среды. Ухудшается также чувствительность и время отклика биосенсора. Если флуктуации базовой линии обусловлены колебаниями концентраций эндогенных электроактивных мешающих частиц, то можно использовать двухэлектродную (дифференциальную) систему. Этот подход использовали при конструировании глюкозного датчика, где один электрод покрыт мембраной на основе глюкозооксидазы, а другой-мембраной, не содержащей фермента. Предполагается, что электроактивные примеси одинаковым образом диффундируют через обе мембраны [60]. В случаях, когда электрод загрязняется примесями из матрицы или продуктом электрохимической реакции, его подвергают многоимпульсной ступенчатой обработке при разных потенциалах [45, 52]. Этот способ позволяет одновременно провести как обработку электрода (в том числе удаление накопившихся на его поверхности пленок), так и установку базовой линии в области потенциалов, в которой отсутствует электролиз. Применяют также различные виды импульсной полярографии, вольтамперометрию (циклическую или с линейной разверткой потенциала). Последняя особенно полезна в двух случаях, описываемых ниже. Многие нейроактивные вещества окисляются при очень близких значениях потенциалов, и поэтому их трудно различить. Полная циклическая вольтамперограмма отражает различие в химических свойствах продуктов электролиза. Она может служить, с одной стороны, для качественного анализа, как отпечаток пальца исследуемой системы [56], а с другой-для количественного описания протекающих в ней электрохимических процессов. Недавно было показано [61], что представляющие интерес для биологии органические молекулы могут концентрироваться на обработанной поверхности электрода. При линейной развертке потенциала осадок определяемого вещества удаляется с поверхности, давая четко выраженный пик. [c.146]

Как сенсор описанный биотопливный элемент имеет определенные ограничения, связанные с присутствием самоокисляемого медиатора (впрочем, самоокисление можно свести к минимуму, используя нерастворимый медиатор [17]), требованиям к кислородному катоду и особенно мембране. Последняя должна удерживать фермент и в то же время пропускать низкомолекулярные компоненты-газ, медиатор, субстрат. Ионообменные мембраны, как правило, удовлетворяют этим требованиям, хотя их диффузионные свойства зависят от pH буферного раствора [31]. На работу элемента влияет также изменение скорости перемешивания раствора в анодном отделении [c.228]

Глюкоза диффундирует через ацетилцеллюлозную мембрану и смешивается с турбулентным буферным потоком в ферментной ячейке. Таким образом, при той же концентрации глюкозы в пробе реальная концентрация глюкозы, при которой работает рассматриваемый электрод, значительно ниже, чем в предыдущем случае. Это приводит к расширению диапазона линейности отклика электрода. Величина этого диапазона зависит от скорости буферного потока при низких скоростях (0,042 мл/мин) она составляет О-10 г/л, а при высоких (0,45 мл/мин)-0-100 г/л. Важной особенностью буферируемого глюкозного электрода является то, что он может работать при экстремальных значениях pH, поскольку буферный поток защищает фермент. Его [c.286]