Модификация карбоксильных групп белка

Модификация карбоксильных групп белка [c.146]

Другая особенность переноса электрона заключается в важной роли отдельных групп белка, образующих друг с другом активные контактные комплексы. Например, окисление миоглобина МЬ цитохромом с (цит. с) проходит при контактах на ограниченных участках поверхностей этих нейтральный молекул главным образом в области расположения гис А10 и гис СН1 у молекулы МЬ и остатков лиз-13, лиз-87 и поверхностной карбоксильной группы гема у молекулы цит. с. Расстояние между гемами МЬ и цит. с составляет не менее 3,0 нм. Каталитическое окисление МЬ ионами Си также сопряжено с участием гис СН1 и гис ЛЮ и делокализацией электрона по их пептидным группам. Модификация состояний гис А10 и гис СН1 при изменении pH среды влияет на перенос электрона. Это также подтверждает наличие в белковой глобуле пути переноса (или электронной тропы ), вдоль которого и происходят акты туннелирования от донорной группы к акцепторной. Иными словами, перенос электрона между белковыми макромолекулами связан с конкретными путями движения электрона внутри отдельных молекул, а также с образованием контактных комплексов на их поверхностях. [c.394]

В присутствии нуклеофила активированные СООН-группы, экспонированные в растворитель, либо гидролизуются, либо ковалентно присоединяют молекулу нуклеофила, а активированные СООН-группы, которые маскированы для растворителя и нуклеофила, претерпевают перегруппировку в N-ацилмочевину, причем последний процесс протекает во много раз медленнее, чем реакции с нуклеофилом [Ноаге, Koshiand, 1967]. Таким образом, в зависимости от расположения в глобуле и условий модификации карбоксильные группы белка либо совсем не модифицируются, если находятся вдали от поверхности молекулы и стерически недоступны, либо могут модифицироваться только карбодиимидом, либо только нуклеофилом, либо и тем и другим. Мы смогли дифференцировать модифицируемые СООН-группы пероксидазы по их расположению в глобуле фермента, проводя модификацию ЕОР-карбодиимидом в отсутствие и в присутствии о-дианизидина. [c.117]

Эта реакция была использована для частичной модификации карбоксильных групп в белках [46, 146, 147]. Хоар и Кошланд [146] использовали 1-бензил-3[3-диметиламино-(М)-пропил]-кар-бодиимид в виде /г-толуолсульфоната, Хориниши с сотр. [147] применяли 1 -этил-3[3-морфолино-(4)-пропил]-карбодиимид ЭМП К. В качестве аминного компонента обе группы исследователей использовали метиловый эфир глицина. Степень модификации определяют потенциометрическим титрованием или аминокислотным анализом. При модификации лизоцима в присутствии указанных реагентов конденсация идет соответственно по 8 и 6 карбоксильным группам (из 11). В присутствии реагента, предложенного Хориниши, модификация идет по 1 из 2 карбоксилов бацитрацина и по 3 и 6 карбоксилов инсулина. [c.365]

Аминогруппы белка наиболее часто используют для различного рода химических модификаций и для целей ковалентной иммобилизации ферментов. Это обусловлено рядом причин. Во-первых, их в белке достаточно много (см. рис. 13). Во-вторых, аминогруппы высокореакционноспособны и уступают лишь 5Н-группам по числу и разнообразию реакций, в которых они могут принимать участие. В-третьих, в большинстве своем аминогруппы играют второстепенную роль в поддержании структуры и функции ферментов. Важное свойство аминогрупп — способность протонироваться (рК 9—10), обеспечивает в физиологических условиях наличие на поверхности белков положительных зарядов, которые взаимодействуют с противоионами из раствора или с отрицательно заряженными карбоксильными группами белка, образуя в последнем случае солевые мостики. Если для нормального функционирования фермента важно сохранение положительного заряда, то этого можно достичь при химической модификации аминогрупп, переводя их (алкилированием) из первичных во вторичные. В-четвер-ты , если некоторые аминогруппы, а не только их заряд, окажутся существенными для структуры и функции фермента, то их при необходимости нетрудно защитить, например, ацилированием ангидридом трифторуксусной кислоты или малеиновым ангидридом (первая из указанных защитных групп снимается в щелочной среде, а вторая — в кислой). В-пятых, для ковалентной иммобилизации ферментов посредством их аминогрупп разработано большое количество подходящих носителей и сшивающих реагентов. [c.85]

Модификацию карбоксильных групп в коротких пептидах осуществляют с помощью водорастворимого карбодиимида путем конденсации с соответствующими диаминами (1,2-диамнноэта-ном или диаминометаном). При соответствующем выборе диамина остатки аспарагиновой кислоты превращаются в аналог лизина [112]. Реакцию конденсации пептида с 2 М диамином проводят при pH 4,75 в присутствии 0,4 М солянокислого 1-этил-3-(3-диэтиламинопропил) карбодиимида при 20 °С в течение 1 ч. Затем добавляют вторую порцию карбодиимида и инкубируют еще в течение 5 ч. Модифицированные пептиды отделяют от продуктов реакции и избытка реагентов путем гель-фильтрации. В результате происходит необратимая модификация всех карбоксильных групп белка. Возможности использования этого типа реакции для модификации высокомолекулярных белков не исследовались. Указанным способом был модифицирован 29-членный пептид глюкагон это самый крупный пептид, подвергнутый такой модификации. [c.146]

Специфическое расщепление по остаткам аспарагиновой кислоты. Метод модификации карбоксильных групп диаминами [112] позволяет проводить гидролиз белка избирательно по остаткам аспарагиновой кислоты. При этом происходит модификация С-концевой и карбоксильных групп глутаминовой кислоты. В связи с этим маловероятно, что метод найдет практическое применение для гидролиза белков. Однако метод вполне применим для гидролиза коротких пептидов, содержащих ограниченное количество или вообще не содержащих глутаминовой кислоты. [c.149]

Для определения числа доступных в данных условиях карбоксильных групп в белках в известной реакции их с водорастворимым карбодиимидом мы предлагаем использовать в качестве нуклеофильного агента о-дианизидин (3,3-диметоксибензидин). Этот реагент содержит две аминогруппы с рК 3,6 и 4,7 [Moller, Ottolenghi, 1966], имеет максимум поглощения при 300 нм (е = = 16,5 мМ см в 0,05 М Na l), не поглощает в видимой области (рис. 48) и, как будет показано ниже, высокореакционноспособен. Его особенно целесообразно использовать для исследования гемсодержащих белков и ферментов у которых в спектрах при 300—320 нм наблюдается минимум поглощения, что дает возможность с большей точностью определять степень модификации СООН-групп белка, чем при использовании нуклеофилов, поглощающих в области полосы Соре. Например, для пероксидазы хрена минимум поглощения в УФ области спектра наблюдается при 315 нм (е= 15 мМ см , см. рис. 48, а). При использовании же в качестве нуклеофила DPG-диамина измерение поглощения проводят при 360 нм (е= 15 мМ см" ) где пероксидаза имеет е= 45 мМ см". [c.113]

Модифицированный фермент не содержит примеси нативного белка, как показано хроматографией на СМ-целлюлозе при pH 5,0 и 4,0 в градиенте Na-ацетатного буфера (0,005—1,5 М). Из-за увеличения общего положительного заряда молекулы модифицированная пероксидаза элюируется при большей ионной силе, чем нативная и тем позже, чем выше степень модификации карбоксильных групп (рис. 49). Ранее мы показали, что при модификации пероксидазы DPG-диамином и карбодиимидом основная часть DPG-диамина связывается с пероксидазой нековалентно и отделяется от белка при хроматографии на СМ-целлюлозе [Угарова и др., 1982]. [c.115]

То обстоятельство, что Y-кapбoк иглyтaмaт ранее никогда в белках не находили, объясняется легкостью, с которой это производное малоновой кислоты подвергается декарбоксилированию в обычную глутаминовую кислоту. Функция витамина К заключается в том, что он содействует включению дополнительных карбоксильных групп в остатки глутамата в предобразованном протромбине. Почвидимому, аналогичной посттранскрипционной модификации подвергаются и другие факторы свертывания крови"". Вызванное такой модификацией повышение способности к связыванию ионов кальция легко объясняется введением дополнительных карбоксилатных анионных групп, поскольку тем самым увеличивается число имеющихся в белке хелатных центров связывания металла. [c.389]

Следует подчеркнуть, однако, что значительно больший удельный вес имеет посттрансляционная химическая модификация белков, затрагивающая радикалы отдельных аминокислот. Одной из таких существенных модификаций является ковалентное присоединение простетической группы к молекуле белка. Например, только после присоединения пиридоксальфосфата к -аминогруппе остатка лизина белковой части—апо-ферменту—образуется биологически активная трехмерная конфигурация аминотрансфераз, катализирующих реакции трансаминирования аминокислот. Некоторые белки подвергаются гликозилированию, присоединяя олигосахаридные остатки (образование гликопротеинов), и обеспечивают тем самым доставку белков к клеткам-мишеням. Широко представлены химические модификации белков в результате реакции гидроксилирования остатков пролина, лизина (при формировании молекул коллагена), реакции метилирования (остатки лизина, глутамата), ацети-лирования ряда N-концевых аминокислот, реакции карбоксилирования остатков глутамата и аспартата ряда белков (добавление экстра-карбоксильной группы). В частности, протромбин (белок свертывающей [c.532]

Для всех аминокислот характерны реакции, в которых принимают участие аминогруппы или карбоксильные группы или и те и другие одновременно. Что же касается аминокислот, содержащих реакционноспособные боковые цепи, то эти аминокислоты могут, кроме того, принимать участие и в реакциях, специфических для этих боковых цепей. Такие специфические реакции представляют интерес главныхм образом по двум причинам. Во-первых, реакции, приводящие к образованию окрашенных продуктов, широко применяются для идентификации и иолуколичественного определения белков и индивидуальных аминокислот. (Рассматривать их здесь подробно мы не будем ограничимся только сведениями, приведенными в табл. 10.) Во-вторых, реакции, характерные для боковых цепей аминокислот, часто используются в работах по химической модификации белков. [c.47]

Реакционная способность одной и той же функциональной группы в различных белках может быть неодинаковой в зависимости от природы последних и от описанного выше типа экранирования. Большинство исследований по модификации белка, представлявших интерес вследствие зависимости между структурой белка и его биологической активностью или функцией, проводилось на растворимых глобулярных белках. Однако было проведено также большое количество работ по окислению фибриллярных белков (например, кератина шерсти) и по введению групп, создающих поперечные связи в этих веществах. Исследование фибриллярных белков ограничено неприменимостью критериев идеальных реакций и отсутствием у этих белков биологической активности. Таким образом, для химика, исследующего белки, понятие о доступности функциональных групп связывается главным образом с исследованиями, которые проводятся на растворимых корпускулярных белках. Нерастворимые фибриллярные белки реагируют гораздо труднее. Александер и сотрудники [40] показали, что число карбоксильных групп в шерсти, доступных для этерификации с помощью спиртов, изменяется в зависимости от молекулярного веса последних. Не все карбоксильные группы шерсти доступны даже для таких небольших молекул, как молекулы метилового спирта, который, согласно ранее проведенным исследованиям Френкель-Конрата и [c.276]

В иммуноферментном анализе введение ферментной метки осуществляют путем ковалентного связывания молекулы фермента с молекулой антигена или антитела, При этом оно должно проводиться таким образом, чтобы модификация фермента не вызывала его инактивации. В водном растворе молекулы белков обладают структурой, при которой в поверхностном слое располагаются преимущественно гидрофильные боковые цепи отдельных аминокислотных остатков, часть из которых находится в ионизированном состоянии. Среди этих функциональных групп наиболее удобными для связывания являются е-аминогруппы лизина, карбоксильные группы аспарагинового или глутаминового остатков, 8Н-группа цистеинового остатка. Очевидно, что такая модифика ция ие должна затрагивать функдиональных групп активного [c.57]

Общая методология создания целеузнающих ФАП с противоопухолевым действием описана в [26]. Противоопухолевые ФАП присоединяют либо непосредственно к опухоль-специфиче-ским антителам или к менее антигенным и менее объемистым их Р аЬ)- или / (аЬ) 2-фрагментам, либо к промежуточному полимеру-носителю, с которым затем связываются антитела. При этом желательно активировать функциональные группы ФАВ (например, карбоксильные группы метотрексата переводят в оксисукцинимидные эфиры), чтобы избежать сшивания антител. С той же целью для связывания антител с полимером-носителем, особенно если это белок, предпочтительны гетеро-бифункциональные сшивающие агенты (см. гл. 5). В ходе присоединения ФАВ к антителам последние могут потерять свою иммунологическую активность как в результате модификации по узнающим центрам, так и вследствие изменения нативной конформации. Во избежание этого предложено сорбировать антитела на иммобилизованном на твердом носителе ФАВ, проводить ковалентное связывание, а потом десорбировать продукт реакции. В результате получают конъюгаты с максимальным содержанием ФАВ при минимальной потере иммунологической активности. При использовании (аЬ)-фрагментов, связывание ФАВ удобно осуществлять через сульфгидрильные группы белка. Поскольку таких групп немного, то целесообразно применять промежуточный полимер (пoли-L-лизин, поли-1-глута-миновую кислоту, декстран и их производные). Этим приемом может быть значительно повышено содержание ФАВ в конъюгате, однако иммунологическая активность иногда падает за счет экранирования белка полимером. Введение вставки между белком и полимером частично улучшает ситуацию. [c.53]

Результаты рентгеноструктурного анализа белков показывают, что наблюдается закономерное расположение аминокислотных остатков полипептидной цепи таким образом, что заряженные группы, этого требует термодинамика, располагаются в основном на наружной стороне молекулы белка, а гидрофобные — внутри глобулы. Гемовая простетическая группа находится, как правило, внутри складки или кармана , образованного полипептидной цепью [Ком, 1978]. Фиксация гема осуществляется за счет неполярных контактов с гидрофобными аминокислотными остатками белка, а также за счет водородных связей одного или двух пропионовокислых остатков гема с аминокислотными остатками апобелка. Ориентация гема в гемоглобине, миоглобине, цитохром с пероксидазе аналогична таковой в пероксидазе хрена пропионовокислые остатки направлены к поверхности белковой глобулы, а винильные группы — внутрь. Причем, в гемоглобине кашалота карбоксильная группа в 6-ом положении порфирина образует водородную связь с атомом азота Н1 -97 и направлена к проксимальной стороне порфиринового кольца, а карбоксильная группа в 7-ом положении образует аналогичный полярный контакт с Аг -45 [Макинен, 1978] и, следовательно, направлена к дистальной стороне. Образование контактов пропионовокислых групп в гемоглобине как с проксимальной, так и с дистальной стороны, обеспечивает жесткое закрепление гема, препятствующее изменению ориентации его в гемовом кармане . В метге-моглобине только карбоксильная группа в 7-ом положении образует водородную связь с Н1 -45 в а субъединице, с 8ег-45 в Р субъединице. Модификация пропионовокислых остатков гема в [c.15]

Одним из способов выявления роли карбоксильных групп в катализе является изучение свойств реконструированных гембелков с этерифицированными пропионовокислыми остатками гема. Однако такие исследования часто вносят путаницу, так как правильный ответ может быть получен только в том случае, если при реконструкции апобелка с модифицированным гемом образуется каталитически активная конформация нативного белка. Однако достичь этого очень трудно, т.к. при использовании модифицированных гемов часто нарушается структура активного центра фермента вследствие неправильной ориентации гема на апобелке. Этого можно избежать, если модифицировать пропионовокислые остатки гема непосредственно в нативном ферменте, выделить модифицированный гем, а затем проводить реконструкцию модифицированного гема с нативным апобелком и исследовать влияние модификации на каталитические свойства фермента. Таким способом можно определить число доступных модифицирующим агентам, т.е. расположенных близко к поверхности карбоксильных фупп гема, и избирательно промодифи-цировать их как в 6-ом, так и 7-ом положениях, которые, по-видимому, в общем случае не эквивалентны. [c.17]

В живых организмах протекают различные химические реакции среди которых следует вьщелить окислительно-восстанови-тельные, продуктами этих реакций являются свободные радикалы. Для защиты от разрушительного действия свободных радикалов организмы используют компоненты антиоксидантной защиты в составе которых пероксидаза. Фермент способен катализировать оксидазные, оксигеназные и пероксидазные реакции. Сложное строение пероксидазы полипептидная цепь, гемин, кальций и поверхностные моносахариды, последние защищают апобелок от разрушительного действия свободных радикалов. При этом моносахариды располагаются вдалеке от активного центра и не влияют на каталитические свойства пероксидазы, но способны ориентировать фермент в мембранных структурах клетки и ее органелл. Как представитель гемсодержащих белков, пероксидаза способна катализировать реакции с участием перекиси водорода, восстанавливая последнюю до воды и при этом окисляя различные неорганические и органические соединения. Продуктами ферментативной реакции могут быть свободные радикалы или фермент-субстратный радикальный комплекс, эффективно окисляющий даже медленно окисляемые в индивидуальных реакциях субстраты. Для выполнения разнообразных каталитических функций на поверхности холофермента располагается протяженная субстратсвязывающая площадка, представленная двумя участками, где могут связываться субстраты гидрофобной и гидрофильной природы. Причем в месте локализации гидрофобных субстратов проявляется карбоксильная группа, модификация которой замедляет протекание каталитического процесса. рК этой группы может колебаться в пределах 4,5—5,5. [c.208]

Внутриклеточные белки синтезируются на свободных рибосомах. Они не имеют сигнальных последовательностей, однако в больщинстве своем синтезируются в виде пробелков. Некоторые из них после соответствующего процессинга функционируют в цитоплазме, другие импортируют во внутриклеточные органеллы. Кроме адресной модификации, существуют многообразные химические модификации и локальный протеолиз белков, необходимые для их полноценного функционирования. Такими модификациями могут быть фосфорилирование по гидроксильным группам аминокислот, метилирование, гидроксилирование, присоединение карбоксильных, сульфо- и ацетильных групп и др. [c.470]

А. имеют характерные полосы поглощения в инфракрасной области спектра, наблюдаемые ок. 1500 см -(характеристич. частота карбоксильных ионов). Ароматич. А. и цистеин поглощают в УФ-части, что определяется наличием в их молекулах дополнительных хромофорных групп. Все А. (кроме глицина) содержат асимметрич. атом углерода и существуют в оптически активных модификациях. К В-ряду относятся А., имеющие конфигурацию В-глицеринового а [ьдсгида. В том случае, когда в молекуле А. имеется два центра асимметрии и если конфигурация у второго асимметрич. атома отличается от конфигурации у а-углеродного атома, то после значков О или Ь вставляют приставку алло- (напр., Ь-алло-треонин). Оптич. активность А. зависит от реакции среды вследствие возможных изменений в состоянии равновесия мея ду анионной, катионной и диполярной их формами. При переходе к катионной форме увеличивается правое вращение. Все А., входящие в состав белков, являются Ь-изомерами 1)-форм1.1 обнаружены лишь в капсулах микроорганизмов и в нек-рых природных антибиотиках. [c.91]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология