Кинетика ингибирования фермента

Перспективны, по-видимому, методы определения концентрации каталитических центров, основанные на использовании высокоспецифичных необратимых ингибиторов ферментов. Эти методы, как показывает наш опыт, дают надежные результаты, если соблюдены необходимые требования к ингибиторам. Сущность методов будет описана после рассмотрения теоретических вопросов кинетики ингибирования ферментов. [c.57]

Возможность создания полифункциональных ингибиторов с заданными жестко закрепленными расстояниями между реагирующими группировками придает им свойства химических шаблонов , при помощи которых можно решать многие задачи строения активной поверхности ферментов. Однако применение ингибиторов в качестве химических шаблонов требует строго количественной оценки их реакционноспособности по отношению к активным центрам. В связи с этим в последние годы в рамках ферментативной кинетики развиваются методы исследования кинетики ингибирования ферментов. [c.79]

Представления относительно кинетики ингибирования ферментов в присутствии субстрата были использованы при исследовании взаимодействия холинэстераз с фосфорорганическими ингибиторами. Результаты сопоставления теории с опытными данными, а также дальнейшее развитие теории будут даны в гл. X. [c.122]

Влияние температуры на кинетику ингибирования ферментов [c.135]

Теория, описывающая реакцию бактерий на ингибиторы роста, базируется в основном на кинетике ингибирования ферментов и работает при допущении, что бактерии ведут себя так же, как ферменты. Эта аналогия проявляется в концепции двух основных типов ингибирования конкурентного ингибирования, при котором ингибитор конкурирует с лимитирующим рост субстратом из-за сходства с этим субстратом, и неконкурентного, когда ингибитор воздействует не так, как лимитирующий рост субстрат. В обоих случаях ингибирование описывается с помощью введения коэффициента [c.96]

В этих случаях удобным является метод совмещения самой ферментативной реакции с процессом ингибирования, т. е. исследование кинетики взаимодействия фермента с ингибитором в присутствии, субстрата. [c.117]

Изложенное выше, по-видимому, применимо и к отщеплению продуктов ферментативной реакции из связи с активным центром и регенерации свободного фермента. Видимо, и в этом случае происходит последовательный разрыв связей, в ходе которого может освобождаться функциональная группа активного центра, способная к реакции с ингибитором (например, гидроксил серина). Другие группировки, оказывающие влияние на реакционноспособность этой группы, могут оказаться в момент реакции с ингибитором еще занятыми. Очевидно, что при этом фосфорорганический ингибитор будет реагировать с ферментом с иной скоростью, чем при полностью свободном активном центре. Такое явление особенно должно сказываться на кинетике ингибирования при концентрациях субстрата, значительно превышающих величину константы Михаэлиса, т. е. тогда, когда активные центры насыщены молекулами субстрата и для реакции с фосфорорганическим ингибитором доступны лишь те, которые освобождаются в ходе ферментативной реакции. При этом, естественно, скорость ингибирования фермента будет зависеть от соотношения констант скорости к+х (реакция с субстратом) и к1 (реакция с ингибитором). Это соотношение будет неизменным, если реакция идет с полностью свободным активным центром. Оно будет изменяться (при избытке субстрата), если ингибитор будет взаимодействовать с неполностью освобожденным активным центром. Если эти соображения выразить языком кинетики, то можно получить уравнение, вполне аналогичное уравнению (Х.8). Для этого достаточно считать, что с ингибитором реагирует не ацилированный фермент, а продукт его превращения, в котором гидроксил серина уже свободен, но фермент еще не принял исходного структурного состояния. Такое предположение в равной мере объясняет различие соотношения констант скорости ингибирования в отсутствие и в присутствии субстрата для разных по структуре ингибиторов. [c.231]

Как указывалось выше, приведенные в таблице данные были получены при изучении кинетики ингибирования ХЭ в условиях избытка фермента. Вместе с тем представлялось важным получить значения констант скорости этой бимолекулярной реакции при взаимодействии ФОС с ХЭ в отсутствие ацетилхолина и при отсутствии избытка ингибитора. Это потребовало дальнейшего усовершенствования кинетических методов. В частности, было необходимым найти способ вычисления концентрации активных центров ХЭ по данным об активности фермента, или, что то же,, нахождения числа оборотов ХЭ — количества молекул субстрата, расщепляющихся на одном активном центре. Такой способ был найден [12]. Он основан на экспериментальном нахождении концентрации необратимого ингибитора, эквимолекулярной концентрации активных центров,. [c.431]

Следует заметить, однако, что при использовании этого критерия кинетика ферментативной реакции, сопровождающейся ингибированием фермента продуктом [c.39]

Согласно этой теории (на ее основе проводится всесторонний анализ ферментативной кинетики и ингибирования) фермент Е сначала реагирует с субстратом 8, в результате чего образуется фермент-субстратный комплекс Е8, распадающийся за- [c.114]

Азид-, цианат-, сульфид- и цианид-анионы способны вытеснять сульфамид из активного центра (рис. 16.9, б). Концентрация Н-ацетазоламида, необходимая для связывания с ферментом в присутствии равных и постоянных концентраций этих анионов, оказывается прямо пропорциональной величинам их сродства к активному центру, рассчитанным из кинетики ингибирования ( N->SH >O N->N3) [21]. [c.586]

На примерах хорошо изученных ферментов рассмотрены современные представления об активном центре, механизме действия, специфичности, активации и ингибировании ферментов. Вопросы, связанные с кинетикой ферментативных реакций, изложены весьма кратко (более подробно с этими вопросами можно познакомиться в книгах М. Диксон, Э. Уэбб Ферменты и Ферменты под ред. А. Е. Браунштейна). Поскольку основные методы выделения и очистки белков описаны в разделе Белки , в данном разделе затронуты только вопросы, связанные со специфическими свойствами белков-ферментов. [c.188]

Кинетику ингибирования холинэстеразы яда кобры регистрировали в псевдомономолекулярных условиях, Ио по убыли активности фермента, используя ацетилхолин в качестве субстрата. В термостатированной при 25,0°С ячейке рН-стата к 5,0 миллилитровым порциям водного раствора ЛИ, [c.862]

Во-вторых, простой член к будет определяющим, если процесс лимитируется кинетикой электродной реакции и почти весь фермент превращается в Е. Эти условия выполняются, если электрохимические процессы протекают медленно и отсутствует ингибирование фермента продуктом реакции. Константа скорости к входит в то же выражение в скобках, что и произведение поскольку в любом случае скорость- [c.153]

В ряде случаев кинетика действия ферментов осложняется влиянием ингибирования реакции избытком субстрата или продукта. Это вносит определенные изменения в уравнение скорости ферментативной реакции и соответственно в кинетические закономерности действия реактора. [c.297]

Уравнение (5.34) — трехпараметрическое и достаточно часто используется в стационарной кинетике ферментного катализа. Помимо субстратного торможения, трехпараметрическое уравнение описывает рН-зависимости ферментных реакций, активацию и ингибирование ферментов ионами металлов и другие процессы. [c.573]

В зависимости от численных значений множителей а и (3 эффектор Э может выступать в роли либо ингибитора (I), либо активатора (А, промотора) ферментативной реакции. Полный кинетический анализ и сводная таблица возможных частных случаев ингибирования и активации фермента в рамках схемы (6.14) даны в работе [6]. Некоторые частные случаи имеют особое значение и широко применяются для описания кинетики ферментативных процессов. К их числу относится полное конкурентное ингибирование, полное неконкурентное ингибирование, бесконкурентное ингибирование, простая активация и некоторые типы смешанного ингибирования и активации. [c.219]

Во второй части книги, посвященной ферментам, рассматриваются как традиционные вопросы биокинетики (уравнение Миха-элиса — Ментен, различные виды ингибирования, влияние pH на скорость ферментативных реакций и т, д.), так и новые, не нашедшие пока отражения в учебной литературе (новые методы нахождения элементарных констант из данных стационарной кинетики, влияние диффузии на кинетику действия иммобилизованных ферментов, использование интегральных форм кинетических уравнений, кинетический анализ систем со взаимным истощением, анализ нетривиальных типов ингибирования, применение теории графов в ферментативной кинетике и др.). Требования систематизации курса способствовали созданию новых методов обработки кинетических данных ферментативных реакций, описываемых в главах 5—8, 10, 11. [c.4]

В работе [10] изучали влияние н-бутаиола на-кинетику реакций гидролиза сложных эфиров, катализируемых карбокси-пептидазой В. На основании зависимости скорости ферментативной реакции от начальной концентрации субстрата (табл. 11) предложить кинетическую схему реакции (приняв двухстадийный механизм действия фермента) и определить константу ингибирования н-бутанолом. [c.91]

При исследовании взаимодействия фосфорорганических ингибиторов с холинэстеразами было установлено, что каждая молекула ингибитора реагирует с одним активным центром фермента, т. е. что реакция ингибирования фермента является бимолекулярной (см. ниже, стр. 205). Используя кинетические закономерности для бимолекулярных реакций при эквимолекулярных концентрациях реагирующих веществ (см. стр. 124), можно экспериментально определить молярную концентрацию фермента [99]. Так, при исследовании кинетики ингибирования холинэстеразы сыворотки крови лошади (частично очищенный препарат) о-этил-п-нитрофенилэтил-фосфонатом — армином (см. формулу I) были получены кинетические кривые, часть которых приведена на рис. 29. Для концентрации фермента, соответствующей скорости гидролиза ацетилхолина [c.166]

Приведенные представления и результаты исследования кинетики действия карбаматов на ацетилхолинэстеразу показывают, что определение величины для таких ингибиторов, исходя из зависимости активности фермента от концентрации ингибитора, необоснованно. Это очень отчетливо можно проиллюстрировать результатами исследования кинетики ингибирования двух типов холинэстераз серией производных карбаминовой кислоты [75]. [c.198]

Н. А. Лошадкина, М. А. Чистовой и И. Л. Кнунянца [153] при исследовании кинетики ингибирования ацетилхолинэстеразы нитрофе-нилфосфатами и нитрофенил-фосфонатами не наблюдалось линейной зависимости между Еоф заместителей у атома фосфора и константой скорости ингибирования фермента. В то же время гидролиз этих соединений лучше описывается корреляционными уравнениями при использовании 0ф [153]. По-видимому, в ингибировании холинэстераз существенно большее значение, чем в более простых реакциях (например, гидролиза), имеют стерические затруднения. Бесспорно, немалую роль в этом отношении играет и то, что при взаимодействии с ферментами, в реакции участвуют одновременно несколько атомных групп как активного центра, так и ингибитора. [c.213]

При недостатке марганца активность ферментов цикла три-карбоновых кислот уменьшается, что в свою очередь подавляет анаболизм. Такое нарушение обмена приводит к повышению концентрации аммонийных ионов внутри клеток, и они могут смягчать ингибирующее влияние цитрата на фосфофруктокина-зу. Кроме того, марганец, видимо, как-то влияет на биохимические свойства поверхности клеток и морфологию гиф. Поскольку в процессе потребляется много кислорода, возможно повторное окисление цитоплазматического NADH без образования АТР. В нем участвует альтернативная, а не основная цепь дыхательных реакций. В результате без сколько-нибудь выраженного изменения обмена возникает метаболическая утечка (flux) через гликолиз. Эта утечка, происходящая при участии конститутивной пируваткарбоксилазы и некоторых ферментов цикла трикарбоновых кислот, а также необычная кинетика действия ферментов, участвующих в метаболизме оксалоацетата, приводят к увеличению внутриклеточной концентрации цитрата. Последний способствует дальнейшему накоплению цитрата путем ингибирования изоцитратдегидрогеназы. [c.140]

Выше мы уже обсуждали один из механизмов, препятствующих участию ацетилкофермента А в обмене веществ, а именно ингибирование биосинтеза жирных кислот ацильными производными кофермента А с длинной цепью. Сейчас в результате работы группы ученых Мюнхенского университета выясняется, что аналогичный механизм может регулировать окисление ацетилкофермента А в цикле трикарбоновых кислот [29]. Было найдено, что фермент цитрат-синтаза из печени, катализирующий конденсацию ацетилкофермента А со щавелевоуксусной кислотой, сильно ингибируется тиоэфирами кофермента А жирных кислот. Характер кинетики ингибирования позволяет предположить, что при этом осуществляются аллостерические взаимодействия. Так, для стеарилкофермента А была получена сигмоидальная кривая зависимости скорости реакции от его концентрации фермент утра- [c.64]

Вероятность существования двух оОратимых фермент-ингибиторных комплексов (схема III) согласуется с данными Стертеванта и Муна [3] по кинетике ингибирования химотрипсина ДФФ в отсутствие субстрата. Согласно схеме V предполагается, что ингибитор взаимодействует с ферментом по субстратному механизму, выступая как плохой субстрат. [c.334]

Кинетика ингибирования холинэстераз в отсутствие субстрата изучалась с помощью манометрического метода Олдриджа. В качестве источника фермента использовались препараты очищенной холинэстеразы лошадиной сыворотки и препараты стромы эритроцитов крупного рогатого скота. В опытах с холинэстеразой в качестве субстрата применялся бутирилхо-линиодид, в опытах с ацетилхолинэстеразой — ацетилхолиниодид. Во всех случаях концентрация субстрата в реакционной среде была 0,02 М. [c.334]

О возможных механизмах подавляющего действия ПС на Na+-, К+-АТФазу мозга. При исследовании кинетики ингибирования ферментативной активности под действием ПС было выявлено наличие конкуренции ПС с активирующими ферментную систему одновалентными ионами (табл. 1). Следует отметить, что левомепромазин и хлорпромазин, обусловливающие наиболее сильное подавление Na -, К -АТФазной активности, конкурировали с обоими активирующими ионами. Остальные же изученные ПС (за исключением фенамина, конкурирующего с ионами калия) конкурировали только с ионами натрия. Возможно, что особое поведение фенамина объясняется тем, что из всех изученных ПС только он является первичным амином. Однако прямых экспериментальных доказательств этого предположения пока не имеется. Роль конкурентного ингибирования в качестве одного из возможных механизмов действия ПС иа Na -, К -АТФазу мозга может быть косвенно подтверждена наличием кооперативного связывания как активирующих одновалентных катионов, так и самих ПС с соответствующими участками АТФазы (табл. 1 и 2), что соответствует данным об аллостерической природе этого фермента (Тарве, Брехтлова, 1967 Robinson, 1970). [c.115]

Одна из особенностей Mg-АТФазы заключается в том, что этот фермент не подчиняется кинетике Михаэлиса — Ментен, проявляя свойства отрицательной кооперативности по отношению к субстрату, и инактивируется в присутствии АТФ (М. Р. Multon et al., 1986). На первый взгляд, это свидетельствует в пользу олигомерной структуры фермента. Однако не исключено, что ингибирование фермента обусловлено взаимодействием АТФ с дополнительным (некаталитическим) участком на молекуле Mg-АТФазы. Этот процесс предотвращается конканава-лином, после чего фермент обретает способность гидролизовать АТФ в соответствии с кинетикой Михаэлиса — Ментен. [c.59]

Изучение механизмов обратимого ингибирования ферментативных реакций — предмет детального анализа в энзимологической литературе [28]. Однако анализ-закономерносхей ингибирования ферментов был посвящен в основном односубстратным реакциям. Оче- видно, что многосубстратная природа реакций должна весьма специфическим образом отражаться в кинетике ингибирования, и для многосубстратных реакций должны существовать особые закономерности ингибирования. Рассмотрим эти закономерности для случая упорядоченных механизмов реакций. [c.12]

Изучение кинетики ингибирования НАД- и НАДФ-зави-симых дегидрогеназ продуктами реакции показывает, что для ферментов этого класса, как правило, выполняется принудительная последовательность связывания кофермента и субстрата связывание кофермента предшествует связыванию субстрата. Первые кинетические данные подобного рода, свидетельствующие в пользу общего механизма упоря- [c.85]

Представляет интерес анализ динамических закономерностей в поведении системы в условиях ингибирования фермента с учетом эффекта инактивации фермента в процессе реакции (см. 2.8). Проанализируем кинетику процесса для системы, открытой и по субстрату, и по ферменту. Для выяснения свойств системы рассмотрим в сравнении два случая 1) субстратнезависимый отток фермента, характеризуемый линейной зависимостью скорости оттока от концентрации в системе фермента 2) субстратзависимый отток, для которого константа скорости инактивации фермента гиперболически зависит от концентрации субстрата. [c.323]

Значения р/Са аминокислотных остатков активного центра свободного фермента и комплекса фермента с ингибитором находят по результатам измерения скорости необратимого ингибирования ферментов точно так же, как и в случае обычной ферментативной кинетики. р/Са других остатков определяют из рН-зависимости скорости реакций этих соединений с различными реагентами. Например, поскольку амины, находясь в форме основания, реагируют с уксусным ангидридом [27] или динит-рофторбензолом 128—30], степень их ионизации определяется из относительных скоростей реакций при разных pH. Этот подход был использован для определения р/Са аминогрупп в белках. [c.186]

Эти эксперименты показывают, что промежуточным соединением в реакции гидролиза эфиров является ацилфермент, который можно выделить при низких pH. Константа скорости де-ацилирования ацилфермента имеет такое же значение, какое было получено из данных по стационарной кинетике. Из опытов по изучению реакции ацилирования следует, что промежуточное соединение образуется довольно быстро, в стехиометрическом соотношении 1 1. Естественно, что ни в одном из этих экспериментов не было показано, что ацилируется именно Ser-195. Окончательно этот вопрос был решен лишь при рентгеноструктурном анализе индолилакрилоил-химотрипсина (гл. 1) [15]. Вывод об участии в ацилировании Ser-195 был подтвержден классическим путем, состоящим в необратимом ингибировании фермента эфирами фосфорной кислоты (например, диизопропилфторфосфатом) с последующим выделением фосфатсодержащего пептида после частичного гидролиза белка [16, 17]. [c.218]

Известно [17], что неконкурентное ингибирование ферментативной активности а-химотрипсина борной кислотой обусловлено взаимодействием ингибитора с имидазольной группой остатка гистидина-57 активного центра фермента. В табл. 20 приведены результаты совместного воздействия борной и н-гексилборной кислот на кинетику гидролиза анилидного субстрата, катализируемого а-химотрипсином [18]. Определить, принимает ли гистидин-57 активного центра фермента участие в связывании н-гексилборной кислоты. [c.97]

Наибольший интерес представляют кинетическое описание протяженных кривых ферментативной деградации полимеров и выявление соответствующих кинетических закономерностей. С этим вплотную связана проблема разработки методов оценки биополимеров с точки зрения их атакуемости ферментами, а также в отношении оценки перевариваемости белков протеазами [22—25]. Иэ немногочисленных количественных данных в литературе по ферментативной деградации биополимеров видно, что для них свойственно ингибирование низкомолекулярньши продуктами реакции (см. [22, 26—32]), При этом в большинстве случаев выводы об ингибировании продуктами были сделаны при кинетическом анализе так называемых полных кривых ферментативной деградации биополимера, или протяженных участков кинетических кривых, с помощью известных методов ферментативной кинетики (например, используя интегральную форму уравнения скорости, см. [21]). В ряде случаев не исключена возможность некоторого действия ингибирования продуктами так, в работе [33] выдвинуто и обосновано положение, что формально-кинетический анализ протяженных участков кинетических кривых ферментативной деградации полимеров практически неизбежно приводит к кажущимся эффектам ингибирования продуктами, даже если продукты не связываются с ферментом и ингибирование на самом деле отсутствует. Этот эффект наблюдается для ферментов, реакционная способность которых уменьшается при увеличении степени конверсии полимерного субстрата (за счет уменьшения степени полимеризации субстрата или доли наиболее реакционноспособных (доступных) связей в молекуле полимера). Подобные ферменты составляют подавляющее большинство ферментов-деполимераз (см. табл. 1). [c.30]