Белки конечной точке

Основные положения предложенной мною конформационной теории белков были сформулированы в общем виде и имели вначале чисто эвристический характер [40, 41]. Создание расчетного метода требовало их детализации и тщательной проверки. Достоинство теории даже в ее первоначальной, быть мо жет, несовершенной форме заключалось в том, что она позволяла всю необходимую работу с первой и до завершающей стадии заранее представить в виде строго последовательного ряда логически связанных между собой шагов, где каждое продвижение вперед опиралось на результаты предшествующих исследований и предваряло последующее. Иными словами, теория, отражавшая вначале чисто субъективное представление автора о структурной организации белка, в то же время представляла собой достаточно четко ориентированную рабочую программу исследования. Одно из положений теории, а именно предположение о согласованности в белковой глобуле всех внутри- и межостаточных взаимодействий, давало возможность разделить задачу на три большие взаимосвязанные части. Цель первой заключалась в кон-формационном анализе свободных остатков стандартных аминокислот, т.е. в оценке ближних взаимодействий валентно-несвязанных атомов. Идеальными моделями для изучения ближних взаимодействий явились молекулы метиламидов М-ацетил-а-аминокислот (СНз-СОМН-С НК-СОЫН-СНз). Вторая часть общей задачи состояла в выяснении влияния средних взаимодействий, т.е. взаимодействий между соседними по цепи остатками. Объектами исследования здесь могли служить любые природные олигопептиды. Цель третьей, завершающей части - изучение роли контактов между удаленными по цепи, но пространственно сближенными в глобуле остатками и априорный расчет трехмерной структуры белка. В дефинициях нелинейной неравновесной термодинамики эти цели могут быть сформулированы следующим образом. Во-первых, определение возможных конформационных флуктуаций у свободных аминокислотных остатков и выявление энергетически наиболее предпочтительных. Во-вторых, нахождение возможных конформационных флуктуаций локальных участков полипептидной цепи и установление среди них бифуркационных флуктуаций, ведущих к структурированию фрагментов за счет средних невалентных взаимодействий. В-третьих, анализ возможных флуктуаций лабильных по средним взаимодействиям участков полипептидной цепи и идентификация бифуркационных флуктуаций, обусловливающих комплементарные взаимодействия конформационно жестких нуклеаций, стабилизацию лабильных участков и, в конечном счете, образование нативной трехмерной структуры молекулы белка. [c.109]

Этот метод был использован также для исследования нативного и денатурированного додецилсульфатом натрия гемоглобина [117], а также для изучения реакционной способности сульфгидрила в сывороточном альбумине до и после денатурации солянокислым гуанидином [135] и после окисления сульфгидрильных групп ферри-цианидом [134]. Если оказывается, что прямое титрование денатурированных белков дает заниженные результаты, то к альбумину сначала добавляют избыток титрующего вещества. По окончании периода денатурации измеряют ток после добавления ряда последовательных порций реагента. Прямую линию зависимости тока от общего количества добавленного реагента продолжают до линии, соответствующей нулевому току, точку пересечения с которой принимают за конечную точку титрования. [c.393]

На конечных стадиях очистки ферментов часто используется электрофорез. Это — физический метод, в основе которого лежит различная скорость движения отдельных белков в электрическом поле, определяемая величиной свободного заряда их молекул. Так как количественные соотношения положительно и отрицательно заряженных групп в белках неодинаковы, то различия в их свободном (суммарном) заряде могут служить основой для электрофоретического разделения белковых смесей. Когда белок находится в изоэлектрическом состоянии, т. е. его суммарный отрицательный заряд равен положительному, то в электрическом поле он неподвижен. При различных pH среды он может двигаться либо к аноду, либо к катоду, причем с неодинаковой скоростью. [c.154]

Если вы посмотрите, сколькими способами можно объединить тридцать (или даже меньше) аминокислот в длинные цепи, содержащие сто или больше звеньев, то поймете, почему известно такое множество белков и почему в живых тканях животных и растений содержится много различных белков. Ферменты — биологические катализаторы — также относятся к белкам. Конечно, каждый фермент имеет свою особую структуру, определяемую последовательностью и пространственным расположением аминокислот, из которых он состоит. Самым замечательным в химии живых организмов является, вероятно, способность к избирательному синтезу белков с определенной структурой — единственной из бесчисленного множества возможных структур. [c.518]

Общая схема синтеза все же ясна. Порядок аминокислотных остатков в белке, т. е. тип белка, будет зависеть от порядка оснований в матричной РНК, а этот порядок, в свою очередь, определяется порядком оснований в ДНК. Но ведь ДНК способна к саморазмножению. Отсюда вытекает, что порядок оснований в исходной ДНК будет определять образование одних и тех же белковых молекул неопределенно долгое время. Именно этим механизмом и объясняется сохранение типа белка и в конечном счете наследование признаков. Следовательно, ДНК несет важнейшую функцию — с помощью этой нуклеиновой кислоты передаются наследственные признаки. Иногда это выражают словами ДНК несет генетическую информацию . На ДНК синтезируется РНК, а на РНК создается белок . Поэтому если после удвоения спиральной молекулы ДНК получилось две одинаковые новые двойные спирали, то они смогут синтезировать такие же молекулы РНК, что и исходная, а на этих новых молекулах РНК будут формироваться те же белки, что и раньше. Организм, построенный из новых белков, ничем не должен отличаться от исходного. Так оно на самом деле и происходит. Бактериальная хромосома, т. е. хромосома простейшей клетки, содержит всего одну двойную молекулу ДНК- При размножении бактериальная клетка делится на две и каждая из них получает по одной двойной молекуле ДНК, причем обе молекулы совершенно одинаковы. Следовательно, в процессе деления бактериальной клетки происходит удвоение ДНК — из одной двойной спирали получаются две двойные спирали и каждая становится источником для получения матричной РНК, т. е. дает начало синтезу белков. Белки, конечно, у обеих клеток будут также совершенно одинаковыми. Это вегетативное размножение. При таком способе размножения потомство по всем свойствам полностью совпадает с родителями и никакой эволюции не совершается — организмы просто увеличиваются в числе. Вегетативное размножение — простейший способ воспроизводства, но его значение в природе велико, так как и [c.82]

В заключение необходимо отметить, что при интерпретации кривых титрования белков возникает ряд трудностей, зависящих от целого ряда обстоятельств. Так, белки содержат очень большое число ионогенных групп, связывающих и отдающих протоны. Кривые титрования показывают, что на 1 г белка требуется около 1 ммоля кислоты и 1 ммоля основания. При молекулярном весе белка порядка 100 000 на одну белковую молекулу приходится, следовательно, около 100 кислых и 100 основных, групп. Однако точно установить число тех или иных основных групп затруднительно, поскольку на кривой титрования имеется некоторое перекрывание в области pH между 8 и 12. Следовательно, pH 8,5 принимается в качестве конечной точки нейтрализации а-аминогрупп и имидазольных групп до некоторой степени произвольно. На характере кривой титрования сказывается и взаимодействие белков с другими ионами, кроме водородных. В частности, белки образуют прочные связи с такими двухвалентными ионами, как ионы кальция, магния, фосфата и карбоната, а также одновалентными ионами хлора. Как уже говорилось, такое взаимодействие приводит к сдвигу изоионной точки и изменению электрохимических свойств белка-за счет нейтрализации ионогенных групп, что приводит к искажению-кривой титрования. Сдвиг изоионной точки особенно велик тогда, когда в растворе находятся ионы фосфатов, которые наиболее прочно связываются основными группами. [c.163]

Дисульфидных групп определение в белках. Определение дисульфида в белках проводят с целью установления их структуры. Дисульфидные группы переводят в тиолы, которые титруют раствором нитрата серебра, используя для установления конечной точки титрования сульфидсеребряный электрод 94-16 и электрод сравнения 90-02. [c.36]

При титровании SH-групп к раствору добавляют ионы серебра или двувалентной ртути, которые образуют с исследуемым веществом растворимые меркаптиды. При соблюдении строго определенных условий через ячейку протекает только небольшой остаточный ток, пока не окажутся блокированными все SH-груипы тогда конечная точка титрования проявляется в возникновении диффузионного тока, обусловленного избытком титрующего реактива. На график наносят значения силы тока как функцию добавленного объема реактива точка пересечения экстраполированных ветвей кривой представляет конечную точку титрования. При титровании простых веществ кривая имеет острый перегиб. В тех же случаях, когда титруемые вещества являются более сложными молекулами, например белки, удаление из растворов ионов тяжелого металла происходит медленно и кривая к концу титрования постепенно переходит в прямую линию. [c.100]

Второй случай эквивалентная точка титрования. Довольно часто возникает необходимость быстро рассчитать значение pH раствора, содержащего соль слабого основания и сильной кислоты (например, сульфата аммония), или раствора, содержащего соль слабой кислоты и сильного основания (например, ацетата натрия). Концентрированные растворы сульфата аммония используются при фракционировании белков, и, как правило, для того чтобы решить, в какой концентрации брать буфер, необходимо рассчитать pH раствора. Другая практическая задача возникает при титровании слабой кислоты или слабого основания. Конечной точкой на кривой титрования служит значение pH, соответствующее раствору соли, например соли Na+A или ВН+С1. Поскольку это значение pH почти никогда не бывает равно 7,0, требуется заранее прикинуть, какой брать индикатор или какую шкалу устанавливать на рН-метре. [c.219]

ВОДИЛИСЬ, для детального изучения химизма протекающих при модификации белков процессов. Как следствие этого мы обнаруживаем пробел в науке о белке, т. е. пока не имеется детальных и всесторонних знаний о белке с точки зрения органической химии, хотя известно, что белки вступают в большое число разнообразнейших реакций. Эта область исследования белков — очень плодотворное поле деятельности для исследователя, обладающего смелостью, неослабным терпением и большой изобретательностью, который к тому же способен скрупулезно вникать в детали и непоколебимо верить в имеющуюся в конечном счете возможность разрешить сложную задачу установления точного строения и реакционноспособ-ности этого важнейшего класса очень сложных природных полимеров. В настоящее время, когда достигнуты большие успехи в выяснении последовательности аминокислот во многих белках и в определении вторичной и третичной структуры этих полимеров, химики-органики имеют в своем распоряжении доступные материалы, которые могут быть использованы в качестве удобных моделей для изучения специфических химических и биологических модификаций, механизма этих процессов и других аспектов структуры и реакционноспособности белков. В течение последнего десятилетия наметились большие успехи в этой области, основу для которых предоставили уже исследованные вещества, использованные в качестве моделей. [c.331]

Сопряжение я-электронов азота, углерода и кислорода придает пептидной связи особый характер. Полипептиды входят в структуру белков. Интересно, что первый синтез белка — инсулина, включающего в свою структуру 51 аминокислоту, который был выполнен до матричного синтеза обычным путем, проходил в 221 стадию. Так как выход продукта на каждой стадии никогда не достигает 100%, то выход конечного продукта многостадийного спн-теза очень мал. Кроме того очистка от побочных продуктов, получающихся на каждой стадии, очень трудна. [c.191]

Растворы ВМС, образующиеся с понижением свободной энергии и находящиеся в равновесном состоянии, агрегативно устойчивы, как и истинные растворы. Их устойчивость главным образом определяется растворимостью данного ВМС в растворителе, а другие факторы, которые играют основную роль в устойчивости лиофобных коллоидов, например заряд частицы и сольватирующая способность, практически не влияют на устойчивость. Так, известно, что белки устойчивы в изоэлектрической точке, где дзета-потенциал равен нулю. Поэтому теории, которые объясняют агрегативную устойчивость растворов ВМС действием электрического заряда либо сольватацией, в настоящее время надо признать устаревшими. Заряд и сольватация, конечно, играют роль, но только в той степени, в которой они влияют на растворимость ВМС. Так, растворимость белков зависит от pH она минимальна в изоэлектрической точке. При смещении от изоэлектрической точки увеличение заряда и гидратация молекул белка повышают растворимость его в воде, и поэтому увеличивается устойчивость раствора ВМС. [c.368]

Понятие о химическом строении белков. Как мы неоднократно имели случай убедиться, наиболее устойчивыми к воздействию химических реактивов в органических молекулах являются углерод-углеродные связи. Нагревание вещества с водными растворами кислот или щелочей обычно не нарушает этих связей гидролиз, как правило, приводит к расщеплению связей у кислорода или азота. Таковы реакции гидролитического расщепления сложных эфиров (например, жиров) и амидов. Белковые вещества при гидролизе распадаются в конечном итоге до а-аминокислот. Если в состав белка входят только различные а-аминокислоты, то мы имеем дело с так называемыми собственно белками, или протеинами Но существуют и сложные белки, или протеиды, в состав которых входят остатки соединений, принадлежащих к иным классам органических и неорганических соединений. [c.393]

Использование реакций замещения для превращения функциональных групп мы рассмотрим на примере одного из первых, реально осуществленных синтезов тирамина — физиологически активного природного соединения. Тирамин был обнаружен во многих продуктах питания (например, в сыре), но когда он попадает в организм, то немедленно разрушается сложным белком (ферментом), называемым моноаминооксидазой (МАО). При разработке схемы синтеза тирамина, приведенной ниже, в качестве исходного соединения мы выбрали /г-оксибензиловый спирт. В большинстве случаев выбор пути синтеза целесообразно начинать с конца. Приходится намного меньше вспоминать, если, начав с конечного продукта, задать вопрос Как получить данное соединение в одну стадию Это в свою очередь ведет к выбору ближайших предшественников конечного продукта, и тот же вопрос возникает вновь. Обычно после рассмотрения таким способом двух-трех стадий синтеза вопрос оказывается решенным или выбранный синтетический путь становится очевидным. [c.185]

Эту методику можно использовать для определения дисульфидов в белках после предварительного расщепления 5 мл 7%-ного белкового раствора раствором (20 мл), содержащим 0,005% пепсина и 0,05% НС1. После расщепления в течение 1 час при 24 10 мл кипятят в течение 2 час с обратным холодильником в присутствии 2 6 УИ НС1. Сульфгидрильные группы, содержащиеся в неденатурированном белке, в процессе гидролиза окисляются до дисульфидов. Для нативного белка конечная точка соответствует сумме половины содержания сульфгидрилов и всего количества дисульфидов. Содержание —8Н в неденатурированном белке можно определить меркури-метрическим титрованием на вращающемся платиновом электроде. Этот метод успешно применялся для определения дисульфидных групп в нормальной и патологической сыворотках крови и их альбуминовых и глобулиновых фракциях. [c.393]

Газовое титрование. Титрование люжет быть проведено II в полном отсутствии растворителя. Банкрофт и Барнетт [567] изучали поглощение аммиака и НС1 на больщом числе сухи.х веществ, включая аминокислоты и белки. Чарнецкий и Шмидт [568—569] изучали поглощение NH, , H l, СО2, H9S аминокислотами и белками. Конечная точка химического соединения и начала адсорбции определяется по точке, при которой давление начинает иостепенно возрастать, а не остается постоянным или скачкообразно возрастающи.м до нового постоянного значения при прибавлении малого количества газа. Для наиболее чистых веществ была найдена область постоянного давления, как этого можно было ожидать согласно правилу фаз. Интересно, что триптофан и различные пептиды присоединяют две молекулы НС1 при нескольких миллиметрах давления. Банкрофт [567], не найдя прямолинейного участка на кривой поглощения НС1 зеином, пришел к заключению, что зеин не содержит пептидных связей. [c.108]

Проведение анализа. Белки. В сосуд для титрования наливают 30 мл раствора фосфатного буфера, закрывают пробкой, помещают в него соляной мостик, трубку для впуска азота и в течение 10 мин пропускают через него азот. По истечении этого времени в сосуд добавляют образец в таком количестве, чтобы результирующий раствор оказался примерно 10" М по сульфгид-рилу, и продолжают пропускать азот. Затем в сосуд устанавливают платиновый электрод, начинают вращать его и титруют полученный раствор хлоридом ртути(II) при потенциале —0,2 В. По результатам титрования строят график зависимости величины тока от израсходованного объема титранта. (Этот график должен иметь вид зеркального отражения буквы L, причем точка пересечения его прямолинейных ветвей соответствует конечной точке титрования.) [c.349]

ДНК производит ДНК, производит РНК, производит Белок , Это утверждение говорит о том, что носителем наследственной информации является ДНК. В конечном счете этот молекулярный материал ответственен за точную передачу информации от родительских клеток к дочерним и за контроль над всей совокупностью химической активности в нормальной клетке, что осуществляется посредством каталитических белков. С точки зрения генетиков, хромосомы содержат дискретную линейную нуклеиновую кислоту, каждый из участков которой, называемых генами, ответственен за образование специфического клеточного продукта. Эти продукты генов являются либо полипептидами, либо структурными молегу- [c.197]

Функционирование генов, т. е. биосинтез белка, подвергается тонкой регуляции в живых системах. За регуляцию на молеку-лярнОлМ уровне ответственны явления молекулярного узнавания, реализуемые посредством слабых взаимодействий. В конечном счете именно молекулярные взаимодействия, формирующие необходимые для регуляторных процессов обратные связи, определяют весь путь биологического развития клетки. Мы уже встречались с обратными связями на молекулярном уровне—с явлением аллостеризма (с. 203). [c.287]

Цистеин не может быть оттитрован меркуриметрически в смесях с глутатионом или белком. Сульфит также мешает определению, и поэтому титрование дисульфида в присутствии сульфита нужно проводить на КРЭ. Вообще меркуриметрическое титрование дает более крутые линии, соответствующие избытку реагента, и, следовательно, более четкие конечные точки, чем аргентометрическое титрование. Меркуриметрическое титрование особенно удобно для определения восстановленного глутатиона, где аргентометрическое титрование дает заниженные результаты, а также для определения биологических материалов, когда необходимо избежать денатурации. [c.393]

Безусловно, говоря о вилках метаболизма гормональных и антигор мональных соединений, нельзя не учитывать тесной связи регуляторных соединений с классами аминокислот, белков, витаминов, пигментов. Так, например, в период активного роста растений идет быстрое превращение триптофана в индольные ауксины и одновременно происходит его включение в полипептиды и белки, в то время как осенью, при замедлении роста, этот путь тормозится и усиливается образование безазотистых соединений — лигнина, флавоноидов и фенольных ингибиторов. Гормональные соединения, по-видимому, регулируют синтез этих продуктов, что в конечном счете ведет к изменению темпов ростового процесса. [c.213]

Отличие амфионной схемы от схемы Михаэлиса заключается в том, что в щелочной среде отщепление иона Н" происходит не от карбоксила, а от аммиачной группы NHj, в кислой же присоединение этого иона происходит не к аминогруппе, а к карбоксильной группе. Итог, конечно, получается один и тот же в первом случае белок заряжается отрицательно, а во-вто-ром—положительно. Поэтому в общих рассуждениях о поведении макромолекул белков в той или иной среде практически безразлично, будем ли мы пользоваться схемой Михаэлиса или амфионной схемой. Представление о белковой макромолекуле, как амф-ионе, имеет большое значение для объяснения эластических [c.176]

Мы уэнали о строении атомов по их спектрам. Спектры и другие оптические свойства молекул дают ценнейшую информацию об их структуре. И, конечно, то же относится к белкам. [c.232]

Хроматографический анализ аминокислот, входящих в состав белка, занимает всего два-три дня, и поэтому в течение 10—15 лет, прошедших с того времени, как такой анализ стал производиться, накоплено довольно много сведений об аминокислотном составе самых разнообразных белков. Конечно, как и следовало ожидать, количество аминокислот в них оказалось разным. Некоторые белки состоят всего из нескольких аминокислот. Поэтому их с большим правом называют не белками, а пептидами. Большинство же белков содержат несколько сот аминокислот. Причем пропорция содержания каждой амп1юкнслоты в разных белках, как выяснилось, разная. Таким образом, удалось сделать полный анализ аминокислотного состава белковой молекулы, то есть произвести ее полную разборку. [c.43]

Хлорид титруют нитратом серебра в среде, немного подкисленной серной кислотой. Конечную точку определяют потенциометрически с помощью пары электродов серебро—амальгама серебра, работающей, как биметаллическая система. Если кислотность среды установлена так, что не происходит образования соединений белка с серебром и белок не соосаждается с хлоридом серебра, то белок из раствора можно предварительно не выделять. [c.216]

B. В. Зеленкин, Дж. Милсум, Э. С. Крендел и др.) показало, что навязывание или усвоение ритмов сыграло важную роль в процессе эволюции. Установлено, что усвоенный биологической системой внешний ритм в конечном счете может стать свойством самой системы и действовать в ней независимо от обстановки. В этом случае, несомненно, внешнее воздействие сыграло роль фактора, формирующего биохимические (т. е. по существу химические) структуры. Однако ритмы, фиксированные в оперативной памяти человека, способны к быстрым перестройкам при соответствующем изменении ритмов внешней среды. Так, по данным Б. А. Карпова с сотр., колебательное ритмическое движение светящейся точки вызывает ритмическое движение глаз наблюдателя, причем глаз сначала подстраивается к движению источника света, а затем приобретает устойчивый ритм, сохраняющийся даже после выключения света. Глаз, по мнению этих исследователей, может усваивать даже полигармонические сигналы. Явления навязывания кода , наблюдаются и для случаев пространственного кодирования. Навязывание означает, например, конформационное изменение макромолекулы, которое происходит под влиянием более жесткой структуры присоединяемой низкомолекулярной частицы. Конформационные изменения в белках описаны ниже (часть IV, гл. 4). Эти процессы имеют большое значение в ферментативном катализе, где жесткой структурой часто обладают молекулы субстратов. [c.339]

Синтез РНК связан с количеством транспортной т-РНК, т. е. РНК переносящей аминокислоты. Если концентрация молекул т-РНК, не имеющих нагрузки, возрастает, то синтез РНК задерживается. Действие этого поразительного механизма уже само по себе указывает на постоянную пространственную близость всех деталей аппарата, синтезирующего белок. В действительности так оно и есть, ведь синтез белка протекает в рибосомах, т. е. в организованных частицах клетки. Число структур, образуемых мембранами, не исчерпывается, конечно, митохондриями и рибосомами. Ядро клетки, лизосомы, аппарат Гольджи и другие органел-лы также построены из мембран они же послужили и материалом для создания нейронов — элементов нервной системы, в том числе и мозга, выполняющего высшие кодовые функции. [c.395]

Биологическая роль нуклеиновых кислот начала выясняться в конце 40-х — начале 50-х годов, когда впервые было выяснено, что ДНК, взятая у одной разновидности бактерий и введенная в другую разновидность, заставляет последнюю производить потомство с признаками, имеющимися у первой разновидности. Отсюда вытекало, что вместе с ДНК была перенесена наследственная информация — каким-то образом закодированный приказ строить белковые молекулы определенного типа. Эти работы стали исходной точкой быстрого прогресса в области молекулярной генетики , приближающего нас к познанию процесса синтеза белка в клетках, размножения клеток путем деления и в конечном итоге воспроизведения всего сложного животного или растительного организма в том виде, который характерен для родителей этого организма. Подробное обсуждение этих проблем увело бы нас далеко в область биохимии, в общих же чертах роль ДНК и РНК выглядит следующим образом. Молекулы ДНК находятся в клеточных ядрах, они содержат наследственную информацию в виде различной последовательности нуклеотидов. ДНК играет роль матрицы , с которой отпечатываются копии молекул РНК, непосредственно участвующих в синтезе белков. Таким образом, молекулы РНК служат передатчиками от ДНК к местам клетки, где непосредственно осуществляется синтез белка. Роль РНК в процессе синтеза белка была подтверждена опытами, выполненными в начале 60-х годов М. Ниренбергом и Д. Матеи. [c.351]

Единственная химическая реакция, которая здесь будет рассматриваться, —это гидролиз. Он может осуществляться как ферментативным, так и химическим путем. Горячая разбавленная минеральная кислота медленно расщепляет амидные связи с образованием с учайных фрагментов, в конечном итоге приводя к простым аминокислотам. Контролируемый кислотный гидролиз разрушает белок с образованием смеси пептидов. Возможен также ферментативный гидролиз протеолитические ферменты очень разнообразны по своему специфическому действию. Некоторые из них, такие, как папаин или фицин, фактически неспецифичны и расщепляют белки до свободных аминокислот, в то время как другие — трипсин, химотрипсин и пепсин— гидролизуют только особые связи в белковых молекулах (ср. мальтаза, эмульсин и т. д., разд. 17.6 и 17.7). Так, пепсин расщепляет амидную связь между карбоксильной группой ди-карбоновой ь-аминокислоты и аминогруппой ароматической ь-аминокислоты при условии, что вторая карбоксильная кислотная группа дикарбоновой аминокислоты не связана. Химотрипсин менее специфичен и расщепляет амидную связь с карбонильной стороны ароматической ь-аминокислоты. Трипсин гидролизует амидные связи, включающие карбоксильные груп- [c.296]

Суть его. можно представить следующим образом (рис. 146). В результате первого раунда репликации возникают два дочерних луплекса с одноцепочечны.ми З -конца.ми (как и при репликации геио-ма фага Т7). Но геном Т4 характеризуется кольцевыми перестановками (см. рис. 134), Поэтому если клетка заражена несколькими фаговы.ми частицами, то концевая последовательность одной молекулы фаговой ДНК будет соответствовать внутреннему участку другой молекулы. При помощи специальных фагоспецифических белков одноцепочечный З -конец первой молекулы может внедриться во внутренний район другой. молекулы в результате появляется затравка, способная обеспечить дальнейшее удлинение цепи. В конечном счете возникает молекула, которую можно рассматривать как разветвленный конкатемер. Отметим, что рекомбинационная итшиации и.меет место и тогда, когда клетка заражается единственной фаговой частицей (рекомбинация в этом случае происходит между одинаковыми дочерними. молекулами-) [c.279]

Этим мы ограничим число примеров использования ионообменной хроматографии для фракционирования белков (при обычных давлениях). Читатель, конечно, обратил внимание на то, что во всех примерах фигурировали щелочные белки. Это отвечает реальной хроматографической практике. Дело здесь не в каких-либо хроматографических преимуществах катиоиообменников или щелочных белков, а в различии чисто биологических ситуаций. [c.312]

Удаление белков. Белки из исследуемого раствора осаждают трихлоруксусной или хлорной кислотой, добавляя ее к раствору до конечной концентрации 2,5%. Раствор хорошо перемешивают, осадок белка удаляют фильтрованием или центрифугированием. Если в растворе присутствуют кислотолабильные фосфорные соединения, то фильтрование или центрифугирование проводят на холоде, а кислоту из безбелкового раствора удаляют. От трихлоруксусной кислоты можно освободиться путем повторного встряхивания раствора с 5— 10-кратным объемом насыщенного водой эфира. Трихлоруксусная кис-Исключение составляет метод Бенцини (с 37) [c.33]

М триэтиламмоний-бикарбонатном буфере до конечной концентрации 1—5 мг/мл и добавляют раствор карбоксипептидазы (отношение фермент субстрат= 1 30—1 200). Проводят инкубацию при 37°С и отбирают аликвоты, содержащие 0,1—0,2 мкмоль белка, сразу после добавления фермента (нулевая точка), а затем через 30, 60, 120 и 420 мин после начала инкубации. Параллельно с опытной ставят контрольную пробу без белка, но содержащую все остальные компоненты реакционной смеси, включая карбоксипептидазу. Реакцию останавливают добавлением к отобранным пробам раствора уксусной кислоты до конечной концентрации 10%. Если при этом выпадает осадок, его отделяют центрифугированием и промывают 2 раза водой. Супернатант после первого центрифугирования и промывные жидкости объединяюг и упаривают на роторном испарителе. [c.156]

Кристаллизация. Раствор белка охлаждают (можно использовать охлаждающую смесь Na l со льдом). К охлажденному до 0° С раствору добавляют АМФ и Mg (СНзСООН) 2 до конечной концентрации, соответственно равной 0,001 и 0,01 М. Кристаллизация фосфорилазы b начинается через 15—20 мин (иногда через 1—2 ч). Для более полной кристаллизации раствор фермента оставляют на ночь при О—4° С. На следующий день суспензию центрифугируют (15000 , 5—20 мин лри О—4° С), осадок растворяют в 30 мМ Na-p-глицерофосфате, pH 6,8, содержащем 30 мМ L-цистеин (или 2-меркаптоэтанол) при 30° С. Нерастворившийся белок отделяют центрифугированием и отбрасывают. К супернатанту вновь добавляют АМФ и Mg (СНзСООН) 2 в той же концентрации. [c.222]

Гель-фильтрация. Готовят колонку (20x40 см), заполненную сефадексом 0-75 и уравновешенную 0,1 М сульфатом аммония, содержащим 1 мМ ЭДТА и 1 мМ дитиотреитол, pH 6,0. На колонку наносят около 2 мл раствора белка и пропускают раствор, используемый для уравновешивания колонки. Анализируют фракции элюата, определяя в них содержание белка и активность фермента. Собирают и объединяют фракции, содержащие наибольшее количество активного белка. Гель-фильтрацию можно повторить на той же колонке с новыми порциями раствора белка. Объединенные элюаты концентрируют путем осаждения белка сульфатом аммония (конечная концентрация — [c.262]

Для проведения следующей части работы на полярографе подбирают максимальную концентрацию Са +, добавление которого к митохондриям в среде с сукцинатом вызывает обратимую активацию дыхания. Для прочносопряженных митохондрий печени крысы (4—5 мг белка в пробе) это составляет около 200—400 мкМ Са +. Дальнейшие измерения проводят на регистрирующем рН-метре. В ячейку рН-метра со средой инкубации и погруженными электродами добавляют последовательно митохондрии, сукцинат и выбранную концентрацию Са +. Регистрируют быстрое освобождение ионов Н+ (закисление среды) из матрикса в ответ на добавление Са +. После аккумуляции всего добавленного Са + изменения pH среды прекратятся и на фоне нового стационарного значения pH в суспензии добавляют 1—2 раза одинаковое количество титрованной НС1 или КОН для калибровки шкалы (конечная концентрация НС1 или КОН в используемых условиях должна составлять около IO М). Проводят серию аналогичных проб, содержащих увеличивающиеся концентрации ДНФ, и каждый раз регистрируют скорость закисления среды в процессе активного транспорта Са2+. Для полного торможения транспорта Са + в митохондриях диапазон концентрации ДНФ должен быть значительно (в 2—3 раза) расширен по сравнению с опытами по измерению сукцинатоксидазной активности. Делают 5—6 измерений и строят графическую зависимость скорости транспорта Са + от концентрации разобщителя (5—6 экспериментальных точек). [c.470]

Если клетку, будь то бактериальная клетка или метка животного, лишить тимина, то она уже не сможет синтезирОг вать ДНК. Однако синтез белков и РНК может при этом продолжаться. Это можно показать экспериментально, используя мутантов, нуждающихся в тимине. Тем не менее эти клетки рано или поздно теряют жизнеспособность и погибают. Причина такой бестиминовой смерти неясна. Возможно, ти-мин необходим для репарации повреждений ДНК, и при его отсутствии происходит транскрипция поврежденной ДНК, что в конечном итоге приводит к синтезу дефектного белка. Но какова бы ни была причина, это явление положено в основу некоторых наиболее эффективных подходов к химиотерапии рака. Раковые клетки со свойственным им быстрым метаболизмом особенно чувствительны к отсутствию тимина. Поэтому тимидилат-синтетаза оказывается одной из наиболее удачных мишеней для воздействия ингибиторами. Одним из мощ ных ингибиторов этого фермента является монофосфат 5-фтор-2 -дезоксиуридина. Его ингибирующее действие было обнаружено, когда выяснилось, что 5-фторурацил можно использовать для химиотерапии рака. [c.165]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология