Модификация фермента гидрофобными группам

Для повышения эффективности сорбции может быть также использована модификация носителя гидрофобными соединениями. Связывание фермента с такими носителями обеспечивается за счет гидрофобных взаимодействий между модификатором и неполярными участками на поверхности белковой глобулы. При этом способе иммобилизации применяются те же носители, которые используются при гидрофобной хроматографии белков. В первую очередь к ним относятся различные агарозы, ковалентно модифицированные гидрофобными группами (алкильными, фенильными и т. п.). На конце такой гидрофобной ножки может присутствовать также и заряженная группа, благодаря чему обеспечивается взаимодействие с ферментом одновременно за счет электростатических и гидрофобных сил (рис. 4, в). При таком многоточечном связывании сорбция многих ферментов протекает практически необратимо. Эффект многоточечного связывания достигается также при использовании полисахаридных носителей, модифицированных танином — природным дубящим веществом, содержащим большое число фенольных групп. Танин может быть ли о адсорбирован на носителе, либо связан с ним химически. Удерживание фермента на [c.53]

НИЯ полярных и гидрофобных субстратов пероксидазы в активном центре фермента пространственно удалены. Причем используя водорастворимые карбодиимиды и окрашенный нуклеофил, установлено, что в участке связывания о-дианизидина располагается одна карбоксильная группа. Модификация этой СООН-группы оказывает влияние на скорость переноса электрона с донора водорода - о-дианизидина на окисленные формы пероксидазы Е, и Е , при этом улучшается связывание окисляемого субстрата. Тогда как на процесс окисления ферроцианида, который связывается в гидрохиноновом участке, модификация этой карбоксильной группы влияние не оказывает. [c.142]

Если известна общая эффективная концентрация лиганда, способного связывать фермент (8 мкмоль в 1 мл геля), то можно определить расстояние между ножками , на которых молекулы лиганда прикреплены к гелю оно равно 29 А. Поскольку диаметр молекулы р-галактозидазы 140 А, можно сделать вывод, что приблизительно 19 ножек (пространственных групп) могут взаимодействовать с каждой молекулой белка. Это объясняет, почему в замещенных гелях настолько сильно проявляются неспецифические электростатические и гидрофобные взаимодействия. Если к этим пространственным группам привязан ингибитор, можно ожидать более специфических взаимодействий фермента с сорбентом при низком уровне модификации геля лигандом. [c.99]

После модификации трех функционально важных СООН-групп пероксидазы остаточная активность составляет 30% активности нативного фермента. По-видимому, эти группы расположены вблизи участка связывания о-дианизидина и важны для процесса переноса электронов с органического субстрата — донора водорода — на промежуточные формы Е, и Е пероксидазы. В результате модификации о-дианизидином изменяется заряд, увеличивается объем и гидрофобность СООН-групп, поэтому уменьшение констант и может быть обусловлено также затруднением диссоциации и выхода продукта в раствор. В то же время связывание органического субстрата, о-дианизидина с ферментом по этим же причинам может облегчаться. На пероксидазное окисление субстратов, связывающихся в других участках активного центра пероксидазы, модификация СООН-групп фермента не оказывает влияние. [c.122]

Подобная организация типична для мембранных белков, взаимодействующих с гидрофобными субстратами или с теми из гидрофильных субстратов небольшого размера, содержание которых в омывающем мембрану растворе достаточно велико. Если эти условия не выполняются, то субстрат-связывающий домен мембранного фермента сильно выступает из мембраны в водную фазу. В таких случаях связь с мембраной может осуществляться за счет особого гидрофобного домена — якоря (рис. 7, Б, В). Для увеличения гидрофобности в некоторых случаях наблюдается специфическая модификация якорного домена аминокислотные остатки, содержащие гидроксильные группы, ацилируются жирными кислотами. Этот процесс происходит в аппарате Гольджи. [c.30]

Ковалентная модификация ферментов монофункциональными реагентами используется для введения в белки новых функциональных групп, повышения их растворимости в органических средах и других изменений биохимических свойств. Особенной популярностью пользуется модификация ферментов полиэтиленгликолем (ПЭГ), которая приводит не только к стабилизации в органических растворителях, но и сопровождается повышением временем их полужизни в биологических жидкостях, а также снижением антигенности макромолекул, что важно при терапевтическом применении ферментов [152]. Кроме того, для тех же целей используют ковалентные модификации белков амфифильным (содержащим гидрофобные и гидрофильные группы) детергентом полиоксиэтиленлауроило-вым эфиром (Вгц 35). [c.371]

На примере миозиновой АТФазы рассматривается случай химической модификации с помощью некоторых сульфгидрильных реагентов, доказывается участие SH-rpynn в регуляции активности миозина (SH-группы непосредственно в активный центр этого фермента не входят), а также устанавливается важная роль гидрофобных взаимодействий в осуществлении регуляторного влияния на АТФазную активность миозина. Демонстрируется также стабилизирующее действие АТФ на структуру активного центра миозина. [c.398]

Иная ситуация имеет место при проведении эксклюзионной хроматографии в водных средах. Из-за специфических особенностей многих разделяемых систем (белки, ферменты, полиэлектролиты и др.) и разнообразия применяемых сорбентов существует очень много вариаций состава подвижной фазы для подавления различных нежелательных эффектов [34, 35]. Общими приемами модификации является добавка различных солей и применение буферных растворов с определенным значением pH. В частности, поддержание рН=<4 дает возможность подавить слабую ионообменную активность силикагелей, обусловленную присутствием на их поверхности кислых силанольных групп. Требуемая ионная сила подвижной фазы достигается при концентрации буферного раствора 0,05-0,6 М оптимальную концентрацию подбирают экспериментально. Для предотвращения ионообменной сорбции катионных соединений наиболее часто используют такой активный модификатор, как тетраметиламмонийфосфат при рН=3. Однако при разделении некоторых белков могут проявляться гидрофобные взаимодействия, в свою очередь осложняющие эксклюзионный механизм разделения. Те же эффекты иногда проявляются и при работе с дезактивированными гидрофильными сорбентами. Для их устранения к растворителю добавляют метанол. Иногда в водную подвижную фазу вводят полярные органические растворители, полигликоли, кислоты, основания и поверхностно-активные вещества. [c.48]

Несмотря на относительную стабильность, мембранные компоненты химически не инертны. Они сами подвержены метаболическим превращениям под действием окислительных ферментов, локализованных внутри мембран или на их поверхности. Мембраны содержат также хиноны и другие низкомолекулярные катализаторы. Окислительные реакции играют важную роль в модификации гидрофобных компонентов мембран. Например, стерины, простагландины и другие вещества, обладающие регуляторными свойствами, первоначально синтезируются в форме гидрофобных цепей, связанных с водорастворимыми переносчиками (гл. 12). В мембранах могут накапливаться гидрофобные продукты биосинтеза (так, предшественниками простаглан-динов служат полиненасыщенные жирные кислоты фосфолипидов). Однако при взаимодействии с кислородом в молекулах этих соединений образуются гидроксильные группы, что приводит к постепенному увеличению их способности растворяться в воде. По мере того как гидрофильность соединения возрастает благодаря последовательному гидроксилированию, гидрофобные компоненты мембран неизбежно переходят в водный раствор и полностью включаются в процесс метаболизма. Другим процессом, в котором липиды мембран активно разрушаются, является гидролиз под действием фосфолипаз. [c.356]

Фактором, благоприятствующим гидрофобным взаимодействиям, является изменение энтропии, точнее говоря, ее прирост. В случае глобулярных белков полярные и прежде всего почти все ионные группы находятся на поверхности, чем облегчается гидратащ1я молекулы белка, имеющая большое значение для стабилизации пространственной структуры. У некоторых белков удаление воды неизбежно связано с их денатурацией. Большая часть неполярных остатков, напротив, находится внутри молекулы белка. Они укладываются плотно один к другому и практически выдавливают воду из первоначально еще непрочной клубковой структуры полипептидной цепи, что приводит к компактности и стабильности гидрофобного ядра. Само собой разумеется, что часть функциональных (ионных) групп боковых цепей находится внутри молекулы белка. Группы, оказавшиеся замаскированными, не подвергаются внешним воздействиям (изменение pH, реакции модификации и др.). Более того, измененная реакционноспособность таких функциональных групп, имеющая значение для каталического действия ферментов, определяется гидрофобным окружением и взаимодействием с [c.382]

Интересные результаты были получены Ричардсом при попытке химической модификации З-пептида. Связывание 3-пептида с 3-белком мало зависит от электростатических сил. Оказалось, что можно ацетилировать все 3 боковые аминогруппы в 3-пептиде, а также связать в метиловый эфир все 4 боковых карбоксила (в пределе заряд изменяется от — 4е до Ч-Зе), и при этом сохраняется способность З-пентида присоединяться к 3-белку и приводить к активному ферменту. С другой стороны, метионин, находящийся на 17-м месте в 3 -пептиде, весьма важен для связывания З-пептида с 3-белком. Если окислить метиониновую группу надмуравьиной кислотой до метиопинсульфона, т. е. превратить гидрофобный белковый фрагмент в заряженный и гидрофильный, то способность пептида[присоединяться к белку чрезвычайно ослабляется. Исходный З-нептид реактивирует полностью З-белок при концентрации 10" М после окисления метионина в пептиде требуется концентрация пептида в 1000 раз более высокая, чтобы образовался комплекс пептид—белок. Однако в результате каталитическая активность РНК-азы восстанавливается полностью. Значит, метиониновая боковая группа — ЗСНд нужна, чтобы создавать прочную связь между хвостом и основным ядром макромолекулы. Но к структуре активного центра метионин прямого отношения не имеет. [c.145]

Другим возможным способом классификации является систематизация по типам полимерных носителей реакционноспособных групп. Особую важность при этом приобретает вопрос активации полимеров. В предыдущем разделе были подробно рассмотрены методы введения различных реакционноспособных групп в полимерные структуры. Приведенные примеры можно обобщить в виде схем для наиболее распространенных полимеров. На рис. 2.3 приводятся данные по полимерным реакциям таких распространенных и стабильных материалов, как полиэтилен и полипропилен. Эти полимеры практически не участвуют ни в каких ионных реакциях, число вводимых в них активных групп обычно незначительно. Как правило, модифицированные структуры очень устойчивы и имеют гидрофобный характер. Однако даже такой чрезвычайно стабильный промышленный пластик, как полипропилен, может быть использован в качестве полимера-носителя в очень тонких реакциях (например, в фиксации ферментов). Модификацию полиэтилена и полипропилена можно осуществлять непосредственно в процессе переработки, поскольку многие технологические процессы (формование волокон, пленкообразование) проводятся из расплава, что создает богатые возможности для введения других активных мономеров, получения привитых и блок-сополимеров и т. д. Сшитый сополимер стирола и дивинилбензола может подвергаться различным химическим превращениям (рис. 2.4). Эти материалы будут подробнее рассмотрены в разд. В.З, посвященном полимерным реагентам. Введение групп типа ЗОзН придает полистиролу гидрофильность и позволяет получить растворимый полимер, однако, если такие группы вводятся в сшитый полимер, реакция протекает в очень неоднородных условиях и число присоединенных групп сильно зависит от размера частиц, их пористости, состояния поверхности и т. д. Очевидно, что в процессах ионообмена выгодно иметь возможно большее число таких групп. Для получения большей ионообменной емкости необходимо вводить группы —80 зН и —Ы КзХ почти в каждое фенильное ядро. При использовании полистирола в качестве носителя (при твердофазном синтезе пептидов, ферментативном катализе, катализе переходными металлами и т. д.) требуется, чтобы количество введенных групп превышало 10%. Химическая модификация полистирола (рис. 2.4) может быть осуществлена [c.44]

Денатурация белка в классическом смысле определялась как любая непротеолитическая модификация уникальной структуры нативного белка, приводящая к определенным изменениям химических, физических и биологических свойств [388]. Из этого определения исключаются изменения состояния ионизации, если только они не сопровождаются конформационными переходами. Денатурация может происходить в результате нагревания, изменения pH и добавления неполярных растворителей или некоторых специфических денатурирующих реагентов, например мочевины или солей гуанидина. Она также может быть вызвана восстановительным или окислительным разрывом дисульфидных связей, которые стабилизуют нативные конформации некоторых белков. Денатурация, как правило, сопровождается уменьшением растворимости белка. Это можно легко понять, так как гидрофобное взаимодействие, стабилизующее нативную конформацию, приводит к межмолекулярной агрегации, если полипептидные цепи принимают вытянутые конформации. Другим характерным последствием денатурации является раскрытие реакционноспособных групп, которые расположены внутри третичной структуры и становятся доступны воздействию реагентов при разрушении этой структуры. К числу наиболее пригодных методов наблюдения за процессами денатурации принадлежат спектроскопические измерения, измерения оптической активности и определение каталитической активности ферментов или биологической активности гормонов. Конформационные переходы при денатурации включают ряд процессов, которые в различной степени могут сказываться на каждом из наблюдаемых изменений, и поэтому понятие степени денатурации бессмысленно, если не будет установлен критерий, с помощью которого денатурация измеряется. Эта точка зрения иллюстрируется рис. 44, на котором изображено изменение оптической активности, поглощения света и ферментативной активности рибонуклеазы [389]. [c.136]

Известно, что белки являются амфотерными полиэлектролитами, т.е. сочетают в себе кислотные и основные свойства. Кислотные свойства белку придают кислые аминокислоты (аспарагиновая, глутаминовая), а щелочные свойства — основные аминокислоты (лизин, аргинин, гистидин). Чем больше кислых аминокислот содержится в белке, тем ярче выражены его кислотные свойства, и чем больше входит в состав белков основных аминокислот, тем сильнее проявляются его основные свойства. Причем р1 каждого белка определяется соотношением кислых и основных групп боковых радикалов аминокислот чем выше соотношение кислые/основные аминокислоты в белке, тем ниже его изоэлектрическая точка [Строев, 1986]. Нами проведена оценка содержания заряженных аминокислот в различных изоферментах (А,, В и С) пероксидазы (табл. 3). Видно, что в составе полипептидной цепи фермента содержится всего от 22 до 26% заряженных аминокислот. Таким образом, V4 части полипептидной цепи пероксидазы представлены гидрофобными и незаряженными аминокислотами. Наличие высокой степени гидрофобности белковой молекулы позволяют предположить, что пероксидаза может являться мембранным ферментом, что и было доказано изучая каталитическую активность пероксидазы в системах обращенных мицелл, в том числе и АОТ [Клячко, 1990 Клячко и др., 1997]. В экспериментах использовались нативная и рекомбинантная пероксидазы. Последняя не содержала углеводных остатков на поверхности белковой молекулы. Показано, что стабильность фермента зависит от степени гидратации ПАВ (>v = [Н20]/[А0Т]). В экспериментах использовались два подхода нековалентной модификации микросреды внутренней полости мицеллы. Во-первых, в водный буферный раствор, солюбилизируемый обращенными [c.24]

В живых организмах протекают различные химические реакции среди которых следует вьщелить окислительно-восстанови-тельные, продуктами этих реакций являются свободные радикалы. Для защиты от разрушительного действия свободных радикалов организмы используют компоненты антиоксидантной защиты в составе которых пероксидаза. Фермент способен катализировать оксидазные, оксигеназные и пероксидазные реакции. Сложное строение пероксидазы полипептидная цепь, гемин, кальций и поверхностные моносахариды, последние защищают апобелок от разрушительного действия свободных радикалов. При этом моносахариды располагаются вдалеке от активного центра и не влияют на каталитические свойства пероксидазы, но способны ориентировать фермент в мембранных структурах клетки и ее органелл. Как представитель гемсодержащих белков, пероксидаза способна катализировать реакции с участием перекиси водорода, восстанавливая последнюю до воды и при этом окисляя различные неорганические и органические соединения. Продуктами ферментативной реакции могут быть свободные радикалы или фермент-субстратный радикальный комплекс, эффективно окисляющий даже медленно окисляемые в индивидуальных реакциях субстраты. Для выполнения разнообразных каталитических функций на поверхности холофермента располагается протяженная субстратсвязывающая площадка, представленная двумя участками, где могут связываться субстраты гидрофобной и гидрофильной природы. Причем в месте локализации гидрофобных субстратов проявляется карбоксильная группа, модификация которой замедляет протекание каталитического процесса. рК этой группы может колебаться в пределах 4,5—5,5. [c.208]

Другим местом модификации может быть N-концевая аминокислота полипептидной цепи. Так, N-концевой остаток глицина в молекуле НАДН-цитохром >5-редуктазы ацилирован миристино-вой кислотой СНз (СНг) 12—СООН. Это дополнительно увеличивает сродство липиду N-концевой последовательности фермента, образуемой гидрофобными аминокислотами. Муреиновый липопро-теин, прикрепленный к внешней мембране Е. oli, модифицирован пальмитатом, присоединенным по МНг-группе к N-концевому остатку цистеина. Еще одна молекула фосфолипида соединена с тем же остатком цистеина через глицерин посредством тиоэфирной связи. [c.30]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология