Буферные растворы для ионообменной хроматографии

Рассмотренные три способа не могут дать удовлетворительного результата, если ионы очень мало различаются по свойствам и поглощаются ионитом почти одинаково. В этом случае эффективного разделения можно достичь, применяя метод ионообменной хроматографии с комплексообразователем, дающим с разделяемыми ионами комплексные соединения различной прочности. -Рассмотрим суть этого метода на примере разделения ионов редкоземельных элементов с применением лимонной кислоты в качестве комплексообразователя. Разделяемым катионам дают поглотиться в верхней части катионитовой колонки (сульфокатионит в ЫН4- или Н-формах). Затем через колонку пропускают растворы нитратного буферного раствора (лимонная кислота + гидроксид аммония), имеющие разные pH. При этом поглощаемые катионы образуют нитратные комплексные отрицательно заряженные анионы, прочность которых (и, следовательно, вымывание из катионитовой колонки) определяется pH и концентрацией цитратного буферного раствора. Так создаются условия для дифференциального вымывания поглощенных катионов. Чем прочнее образующийся комплексный анион, тем легче вымывается катион из колонки. [c.690]

При фракционировании белков методом ионообменной хроматографии большое внимание уделяют выбору ионообменника (природе матрицы и емкости ионита) и буферного раствора, при котором осуществляется сорбция белков (величине pH и ионной силы, природе буфера и буферной емкости). [c.108]

Подготовка исследуемого материала. Раствор белка, наносимый на колонку, должен иметь тот же состав и те же значения pH и ионной силы, что и исходный буферный раствор, которым уравновешен ионообменник. Образец переводят в исходный буферный раствор, подвергая его предварительно диализу или гель-хроматографии. Если объем пробы, предназначенный для ионообменной хроматографии, невелик, образец можно развести исходным буферным раствором. Нерастворимые компоненты удаляют центрифугированием или фильтрованием. Если [c.110]

При разделениях методом ионообменной хроматографии силу растворителя меняют, увеличивая или уменьшая концентрацию буферного раствора или меняя pH, в некоторых случаях используют модификацию органическими веществами. [c.13]

Подвижная фаза в ионообменной хроматографии должна обеспечивать растворимость различных солей и создание буферного раствора, необходимых для ионного обмена, контроль степени удерживания образца за счет использования растворителя нужной силы, получения необходимой селективности разделения. [c.36]

В подвижную фазу добавляют иногда органические растворители (метанол, этанол, ацетонитрил, диоксан), действие которых аналогично добавлению растворителей в обращенно-фазной хроматографии при увеличении их количества степень удерживания образца снижается, и этот эффект более силен для менее полярных растворителей. Добавлением органических растворителей можно добиться также изменения селективности системы. Таким образом, снижают время удерживания в ионообменной хроматографии следующие факторы 1) повышение температуры 2) повышение концентрации буферного раствора 3) снижение степени ионизации вещества за счет изменения pH. [c.37]

При ионообменной хроматографии отношение количества носителя к образцу обычно бывает более высоким, чем при адсорбционной хроматографии. Так, например, для разделения аминокислот используют при навеске 1 мг колонки с внутренним диаметром 0,9 см и высотой 150 см, что соответствует соотношению адсорбента к иониту, равному 1 100 ООО. При препаративном разделении это соотношение колеблется приблизительно в пределах от 1 400 до 1 4000. Внутренний диаметр колонки следует выбрать с таким расчетом, чтобы его отношение к высоте составляло приблизительно от 1 50 до 1 100. Для разделения сильноосновных веществ на сильнокислом катионите иногда выгодно это соотношение уменьшить до 1 15. Благодаря изменению рП или при использовании некоторых буферных систем столб ионита может сильно набухать. Поэтому в колонке над столбцом ионита всегда оставляют достаточное свободное пространство, которое заполняется буферным раствором. [c.553]

Рааделение амино слот на ионообменниках основано на способности аминокислот образовывать соли с кислотами и щелочами. Подбирая соответствующие катиониты или аниониты, можно быстро и с успехом разделить гидролизат белка, пользуясь для этого 2,5—3,5 мг белка. Ионообменную хроматографию хорошо сочетать с элюционным или вытеснительным анализом. Мур и Штейн пользуются для этого катионитной смолой сульфополистирольного типа Дауэкс-50, через колонку которого пропускают аминокислоты последние вымывают затем соответствующими буферными растворами. Для разделения достаточно 3 мг аминокислот. [c.481]

Принцип метода. Ионообменная хроматография проводится в летучих буферных растворах, что позволяет избежать специальных стадий обессоливания фракций. [c.199]

С помощью тонкослойной ионообменной хроматографии можно разделить-16 аминокислот, присутствующих в белковом гидролизате, используя всего лишь один буферный раствор. В буферном растворе Б (табл. 10), имеющем относительно высокую концентрацию ионов цитрата, смесь из 16 аминокислот делится на 15 компонентов. Картина такого разделения показана на фнг. 53. Из 16 аминокислот не разделяются только Тре и Сер. [c.255]

При приготовлении подвижных фаз для ион-парной, обращенно-фазовой или ионообменной хроматографии получение необходимой молярной концентрации компонентов не вызывает затруднений, в то время как установка необходимого значения pH водноорганических элюентов может быть связана с затруднениями. В связи с этим принято указывать значения pH не для элюента в целом, а для его водной части, до смешения с органическим растворителем. Следует иметь в виду, что прибавление к водному буферному раствору органического растворителя может увеличить кажущееся значение pH на Г—2 единицы, в результате чего смешанный водно-органический элюент станет довольно агрессивным по отношению к химически модифицированным силикагелям. [c.312]

Для ионогенных соединений существуют и другие варианты выбора хроматографической системы. Во-первых, это ионообменная хроматография на материалах, которые по химизму взаимодействия повторяют классические иониты. Недостатком такого режима является сравнительно невысокая эффективность разделения. Подвижная фаза, как правило, представляет собой буферный раствор. Его pH и ионная сила подбираются таким образом, чтобы обеспечить желаемые значения констант сорбции. Другой режим разделения ионогенных соединений — так называемая ион-парная хроматография. Методически суть, ее сводится к тому, что в обычную обращенно-фазовую систему добавляют гидрофобные ионы, имеющие заряд, противоположный по знаку заряду разделяемых ионов. Этот прием позволяет по- оТучить пики ионогенных соединений почти идеальной формы, что редко достигается при обычной обращенно-фазовой или / ионообменной хроматографии соединений данной группы. [c.35]

При уменьшении ионной силы буферного раствора ионообменные сефадексы очень сильно набухают, поэтому не рекомендуется применять растворы, ионная сила которых ниже 0,05—0,1. Если хроматографию начинают в слишком разбавленном буферном растворе, то при последующем значительном увеличении ионной силы элюирующего буферного раствора происходит уменьшение объема гранул сефадекса, которое может вызвать образование полостей в колонке геля. Образование полостей нарушает равномерное протека-ние жидкости через колонку и неблагоприятно отражается на результатах хроматографии. [c.217]

Принципы подбора буферных растворов для хроматографии на ионитах-гелях те же, что и в случае ионообменных целлюлоз (см. разд. 84). Регенерацию выполняют 0,1—0,5 и. растворами НС1 или NaOH или 0,5—1 н. растворами солей. [c.168]

При ионообменной хроматографии смесь белков сорбируется в верхней части колонки и затем вытесняется веществами, уменьшающими их сорбцию на ионите. Понижение сорбции осуществляют повышением ионной силы раствора и (или) изменением его pH. Изменение pH и ионной силы элюирующего буферного раствора можно проводить путем создания ступенчатой или градиентной элюции (с. 104). [c.109]

Степень прочности сорбции и десорбции на смоле разных аминокислот, определяемая главным образом величинами зарядов молекул, различна. Наиболее прочно на смоле сорбируются диаминокислоты и наименее прочно — дикарбоновые аминокислоты. Разделение аминокислот при ионообменной хроматографии происходит при десорбции их со смолы элюирующими буферными растворами, отличающимися от исходного буферного раствора большими величинами pH и (или) ионной силы. Обычно для элюции кислых и нейтральных аминокислот используют Ыа-цитратные буферные растворы с pH 3,25 и 4,25. Для десорбции со смолы наиболее прочно связанных (основных) аминокислот используют более щелочной Ыа-цитратный буферный раствор со значением pH 5,28 и более высокой ионной силой (0,35 М). [c.133]

В ионообменной хроматографии применяют следующие буферные растворы ацетатный, фосфатный, цитратный, формиатный, аммиачный, боратный. Селективность разделения в ионообменной хроматографии зависит от концентрации и вида буферных ионов и органических растворителей, а также от pH среды. Ионообменное разделение проходит в пределах температур от комнатной до 60°С. Чем выше температура, тем меньше вязкость подвижной фазы и тем эффективнее разделение. Однако при высокой температуре стабильность колонки или образца может быть нарушена. Многие ионообменники выдерживают температуру до 60 °С, а некоторые полимерные катионообменники — даже до 80°С. Биохимические пробы принято разделять при низких температурах, часто при 4°С, хотя в современной ВЭЖХ при быстрых разделениях вероятность разрушения образца при 20-30°С резко снижается. Повышение температуры может привести к снижению к для всех компонентов образца, а снижение ионной силы подвижной фазы может привести к обратному явлению. [c.36]

Иная ситуация имеет место при проведении эксклюзионной хроматографии в водных средах. Из-за специфических особенностей многих разделяемых систем (белки, ферменты, полиэлектролиты и др.) и разнообразия применяемых сорбентов существует очень много вариаций состава подвижной фазы для подавления различных нежелательных эффектов [34, 35]. Общими приемами модификации является добавка различных солей и применение буферных растворов с определенным значением pH. В частности, поддержание рН=<4 дает возможность подавить слабую ионообменную активность силикагелей, обусловленную присутствием на их поверхности кислых силанольных групп. Требуемая ионная сила подвижной фазы достигается при концентрации буферного раствора 0,05-0,6 М оптимальную концентрацию подбирают экспериментально. Для предотвращения ионообменной сорбции катионных соединений наиболее часто используют такой активный модификатор, как тетраметиламмонийфосфат при рН=3. Однако при разделении некоторых белков могут проявляться гидрофобные взаимодействия, в свою очередь осложняющие эксклюзионный механизм разделения. Те же эффекты иногда проявляются и при работе с дезактивированными гидрофильными сорбентами. Для их устранения к растворителю добавляют метанол. Иногда в водную подвижную фазу вводят полярные органические растворители, полигликоли, кислоты, основания и поверхностно-активные вещества. [c.48]

Ион-парную хроматографию используют для разделения образцов, содержащих как ионные, так и неионные соединения. Ее применяют в тех случаях, когда трудно или невозможно получить приемлемое разделение образца методом ионообменной хроматографии адсорбционной или обращенно-фазной. В некоторых случаях ионные соединения можно разделить на обращенной фазе, придавая им свойства неионных соединений (подавление ионов) с помощью буферного раствора с соответствующим pH, при котором равновесие смещается в сторону образования неионизированной формы. Полярные вещества, обладающие липофильными свойствами, делятся при этом на обращенной фазе как неполярные. Однако большинство наполнительных материалов колонок надежно работает только при рН=1,5—7,5. Исключение составляет партисил 5 ОДС, работающий при рН=1—8,5. В этом диапазоне pH сильные кислоты и основания ионизированы. [c.74]

К сорбентам для высокоэффективной эксклюзионной хроматографии белков, ферментов и других биологических объектов предъявляются значительно более жесткие требования по инертности поверхности, чем к сорбентам для разделения синтетических полимеров. Кислые силанольные пруппы силикагеля обладают высокой адсорбционной активностью, проявляют слабые ионообменные свойства и способны денатурировать белковые молекулы. Поэтому поверхность жестких сорбентов очень тщательно модифицируют прививкой монослоев нейтральных гидрофильных органических групп. К таким сорбентам относятся ц-бондагель Е и материалы, содержащие глицерильные группы. Поверхность д-бондагеля Е модифицирована алифатически-ми эфирными группами. Колонки с этим сорбентом можно использовать с любыми растворителями от пентана до буферных растворов в области pH от 2 до 8. Они характеризуются высокой разрешающей способностью, но из-за малого рабочего объема (примерно 1,2 мл на колонку) требуется особо точная подача подвижной фазы. [c.108]

У большей части белков в процессе хроматографии сразу происходит изменение величины К[От О до 1.Это вызвано тем, что белки либо прочно сорбируются на ионообменнике, либо выходят с элюирующим буферным раствором, поскольку происходит одновременная взаимная нейтрализация многочисленных реакций взаимодействия между белком и ионообменником при данных pH и ионной силе раствора. Поэтому важно тщательно подбирать буферный раствор для ионообменной хроматографии белка. Ионообменную колонку обычно загружают при низкой ионной силе раствора. Для катионообменника оптимальная величина pH равна 4—5, для анио-нообменника 7—8- Элюирование с колонки катионообменника происходит при увеличении pH буферного раствора, а с колонки анионо-обменника — при уменьшении pH. В том и другом случае с изменением pH можно увеличивать ионную силу. Изменение pH и ионной силы элюирующего буферного раствора можно производить поэтапно (ступенчатое элюирование) или непрерывно (градиентное элюирование). [c.22]

В последнее время появилась возможность определять аминокислотный состав белков с помощью автоматических аминокислотных анализаторов. Когда в 1948 г. Мур и Стейн [551 в дополнение к классическим методам органической химии, а также манометрическому и бактериологическому анализу ввели ионообменную хроматографию, наступил поворотный момент в развитии химии аминокислот. В основу работы созданных сотрудниками Рокфеллеровского института современных автоматических аминокислотных анализаторов была положена ионообменная хроматография. Принцип работы этих приборов заключается в следующем. Исследуемый белок гидролизуют, затем гидролизат подвергают хроматографии на смоле типа дауэкс 50 х8 в Na-форме. Элюирование производят с помощью непрерывной подачи буферного раствора. Выходящий из колонки элюат попадает в пластмассовую ячейку особой формы, где он смешивается с раствором нингидрина. Подачу нингидрина осуществляет специальный насос, работающий синхронно с насосом, подающим буферный раствор на колонку. Затем смесь элюата с нингидрином проходит через тефлоновый капилляр, который погружен в кипящую баню. В этих условиях в растворах происходит нингидриновое окрашивание, интенсивность которого измеряется в проточной кювете спектрофотометрически. Поглощение света регистрируется самописцем. Применение сферических смол [80] позволило сократить время исследования одного образца примерно в четыре раза, а использование особых ячеек сделало вполне допустимыми для анализа очень малые количества исследуемого вещества — порядка 0,01—0,05 мкмоля [38]. Введение одноколоночной процедуры значительно упрощает метод [9, 29, 43, 60]. С помощью этой методики в одной и той же пробе можно определить кислые, нейтральные и основные аминокислоты, что не только экономит исследуемый материал, но и повышает точность и сокращает время исследования. Работая на стандартном аминокислотном анализаторе и пользуясь некоторыми модификациями известных методов, можно полностью закончить анализ одного вещества в течение 3 ч [91. [c.32]

Фиг. 41. Градиентное элюирование при ионообменной хроматографии. Буферный раствор, заполняющий резервуар А, имеет ббльшую ионную силу, чем раствор, находящийся в смесителе Б. Градиенты концентрации / — линейный 2 — вогнутый

Для ионообменной хроматографии используется смола в соотЗ ветствующей ионной форме. При колоночной хроматографии смолУ сначала переводят из одной формы в другую (например, из Н" - Ыа -форму), а потом колонку уравновешивают стартовым буферный раствором. При работе с пластинками Фиксион 50 х 8 первой стадии т.е. перевода из одной формы в другую, не требуется, так [c.246]

В классическом методе тонкослойной хроматографии перед нанесением на пластинку исследуемый материал необходимо обессолить. Обессоливание требует больших затрат труда и времени, а при малом количестве вещества приводит к значительным потерям. При ионообменной тонкослойной хроматографии соль, нанесенная вместе с образцом, не мешает Процессу разделения, так как концентрация элюирующего буферного раствора, как правило, превышает концентрацию солей в образце. Чтобы получить полное разделение фракций, необходимо выполнять следующие требования [c.247]

Ароматические и основные аминокислоты на пластинке Фик-сиоц 50 X 8 разделяются при одномерной хроматографии в цитратном буферном растворе pH 5,23 с концентрацией Ыа" 0,35 М (буферный раствор В, табл. 10), который используется в двухколоночной системе аминокислотного анализатора. Типичная хроматография такого разделения представлена на фиг. 49. Колебания pH и концентрации буферного раствора не существенны для фракционирования. Хроматографию проводят при комнатной температуре без предварительного уравновешивания. В камеру наливают слой буферного раствора высотой примерно 1 см. При хроматографии фронт буферного раствора должен подняться на высоту 15 см. Если пластинка не уравновешена, на это уходит около 2 ч. На уравновешенной пластинке (см. буферный раствор для уравновешивания, табл. 10) это происходит за несколько ми-нут. На примере разделения ароматических и основных аминокислот можно оценить Лиз высокую разрешающую спо-Гис обность ионообменной хроматографии в тонком слое по сравнению с соответствующей колоночной техникой. Известно, что на малой колонке в этом же буферном растворе (т. е. 0,35 М Ыа+, pH 5,23) ароматические аминокислоты не отделяются друг от друга. [c.250]

Поэтому до настоящего времени не нашли широкого распространения в области полисахаридов такие виды хроматографии, как распределительная и адсорбционная (отдельные примеры см." ). Более успешным оказалось применение ионообменной хроматографии для разделения кислых и даже нейтральных полисахаридов. Ионообменниками служат обы.ч,но аниониты, полученные модификацией целлюлозы, например ДЭАЭ-целлюлоза. Для элюирования полисахаридов с колонок используют растворы солей или буферные растворы разной концентрации прочно удерживаемые полисахариды элюируют разбавленными растворами щелочей. Таким споссбом легко удается отделить кислые полисахариды от нейтральных, например, пектиновую кислоту от сопутствующего ара-бинана или сульфированные полисахариды водорослей от крахмалоподобных примесей в ряде случаев при таком способе разделения удается освободиться от примесей белка. Нейтральные полисахариды можно разделить, применив ДЭ.ЛЭ-целлюлозу в боратной форме, при вымывании боратным буфером . Описано также успешное применение ЭКТЕОЛА- [c.486]

Еще труднее преодолеть проблемы при анализе оснований. Остаточные силанольные группы сорбента, обладающие кислотными свойствами, могут при определенных условиях взаимодействовать с сорбатами по ионообменному механизму, что отрицательно сказывается на форме пиков и устойчивости величин удерживания. При нормально-фазовой хроматографии оснований в органическую подвижную фазу можно добавить 0,5—1% основания, например диметилформамида. Однако в данном случае этот подход не столь эффективен, как добавление уксусной кислоты при хроматографии кислот. При обращенно-фазовой хроматографии оснований на алкилсиликагелях метод подавления ионизации неприменим, так как модифицированные силикагели неустойчивы при pH >7,5. При использовании кислых буферных растворов [c.305]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология