анализ пептидов и носителем

Полное количество иммобилизованного компонента может быть определено двумя путями. Первый заключается в непосредственном анализе твердого носителя. Для пептидов и белков использовали аминокислотный анализ после исчерпывающего кислотного гидролиза (6,0 М НС1, ПО С, 24 ч, вакуум) (см., например, работу [4]). Для матриц, содержащих иммобилизованные нуклеотиды, проводилось определение фосфата [14] после исчерпывающего гидролиза модифицированной матрицы [15]. Другой метод состоит в определении после реакции присоединения количества лиганда, не связавшегося с твердым носителем. Количество иммобилизованного лиганда определяется вычитанием количества лиганда, остающегося в растворе после реакции (включая промывные воды), от исходного количества лиганда. [c.227]

Адсорбция на носителе. При работе с пористым носителем поверхность раздела фаз очень велика и даже сравнительно слабая адсорбция может привести к полной неудаче при электрофоретическом разделении. Причины адсорбции не всегда достаточно ясны. По-видимому, силы неэлектростатического происхождения играют большую роль по отношению к белкам, чем к малым ионам. Адсорбция последних (пептидов, аминокислот и т. д.) связана с наличием ионизованных групп на поверхности носителя. Установлено, что в целлюлозе и крахмале, например, имеется значительное количество карбоксильных групп. Так как эти группы заряжены отрицательно, опасность адсорбции относительно мала для отрицательных ионов, но велика для положительных. Делались попытки уменьшить заряд бумаги этерифи-кацией карбоксилов диазометаном. С белками рекомендуется работать при pH выше их изоточки, тогда электростатическое отталкивание препятствует адсорбции. Этот эффект можно усилить, используя ионообменную бумагу, в которой с поверхностью целлюлозных волокон химически связано значительное число ионизированных групп с зарядом, противоположным заряду исследуемого иона. Для уменьшения адсорбции белков применялись также детергенты иногда помогает предварительная обработка носителя раствором исследуемого белка. Хотя в некоторых случаях эти меры приносят желаемый эффект, адсорбция часто (для белков — почти всегда) наблюдается в той или иной степени при электрофорезе на твердом носителе. Обратимая адсорбция проявляется в уменьшении скорости движения и в образовании хвостов у движущихся зон, что ухудшает разделение и затрудняет количественный анализ. Необратимая адсорбция приводит к тому, что на всем пути зоны остается равномерный след — адсорбированный белок, а количество вещества в зоне постепенно уменьшается. Если это количество мало, зона может вообще исчезнуть по дороге. Иногда адсорбция сопровождается денатурацией белка, частичной или полной потерей его биологической активности. [c.81]

Первый том монографии посвящен методам синтеза пептидов. В нем достаточно полно рассмотрен весь арсенал синтетической пептидной химии, включающий наиболее широко применимые Ы- и С-защитные группы, а также способы образования пептидной связи. В основном обсуждаются классические методы синтеза, которые в настоящее время достаточно хорошо разработаны и вполне оправдывают себя при получении относительно простых пептидов. Значительное место уделено также синтезу атипичных пептидов, в частности депсипептидов, где имеются свои специфические методические проблемы, разрешенные в последние годы. Более кратко обсуждены в книге новые приемы синтеза пептидов, прежде всего синтез на полимерном носителе. Сравнительно мало места уделено анализу [c.5]

ТФ-секвенатор легче обслуживать, чем жидкофазный, но новички часто затрудняются в выборе наилучшего метода присоединения конкретного пептида. Поэтому в данной главе в основном рассматриваются наиболее эффективные (с нашей точки зрения) методы синтеза носителей и присоединения пептидов. В настоящее время для анализа последовательности используют как большие, так и очень малые навески образца. Поэтому излагаемые в этой главе методы рассчитаны па работу с количествами от 500 пмоль до 20 нмоль пептида. Описываются только те методы, при использовании которых мы получали удовлетворительные результаты на пептидах, выделенных из реальных биологических объектов. Более подробную информацию можно найти в статьях, посвященных анализу на микроуровне [25, 52, 63], а также в обзорах по методам анализа последовательности [70, 71]. [c.375]

Следует обязательно проверять наличие альдегидов и пероксидов в реактивах и растворителях рекомендуется проводить (без добавления пептида) все этапы методики присоединения образца к носителю и использовать обработанный таким образом носитель для анализа на секвенаторе (холостой опыт). [c.376]

Методы твердофазного анализа применимы почти ко всем типам пептидов. Они разработаны для пептидов, содержащих до 30 аминокислотных остатков, но могут быть использованы для анализа и более крупных пептидов и белков. Обязательные стадии включают 1) присоединение пептидов через а- и е-ами-ногруппы к носителям на основе полистирола или стекла путем [c.399]

Создание твердофазных носителей для анализа последовательности [55] стимулировало разработку мощного метода селективного выделения С-концевых пептидов. В принципе можно селективно присоединить белок к смоле через С-концевой карбоксил белка, химически или ферментативно расщепить иммобилизованный белок и селективно выделить С-концевой пептид, поскольку после гидролиза только он останется присоединенным к смоле. Однако на практике при активации С-концевого карбоксила активируются и карбоксильные группы боковых цепей Asp и Glu, которые затем связываются с носителем [51], что ограничивает возможности использования таких смол в качестве общего метода селективного выделения С-концевых фрагментов белков. [c.483]

Эти данные были использованы для ступенчатого последовательного гидролиза и анализа пептидов с N-конца, что сравнимо с действием аминонептидазы. Для большинства аминокислот выход реакции гидролиза составляет 30—50%. Для иовышения выхода предложен другой подход с использованием твердофазного носителя. В щелочном буфере при 60°С только N-концевой остаток остается связанным с твердофазным носителем, а остальные ненрореагировавшие вещества могут быть отмыты и использованы вновь [230]. [c.358]

В конце синтеза пептидил-полимер помещают на тарированную воронку с пористым фильтром, промывают уксусной кислотой, спиртом и сушат в вакуум-эксикаторе над едким кали. Так как часть аминокислот может быть связана с пептидил-полимером ионогенно или за счет адсорбции после стадии пептидообразования, то анализы пептидил-полимеров или неочищенных отщепленных пептидов на содержание аминокислот лучше проводить после дополнительной стадии удаления БОК-защитной группы. НС1 в диоксане (или НС1 в СНзСООН) удаляет сорбированную БОК-аминокислоту. Промывку пептидил-полимера следует проводить очень тщательно, чтобы удалить из вещества весь НС1 перед длительным хранением. Вес пептидил-полимера записывают. Увеличение веса полимерного носителя в процессе синтеза может служить приблизительным методом контроля количеств присоединенных аминокислот и дает верхний предел количества пептида, полученного на полимере. Аликвотную часть пептидил-полимера можно проанализировать на аминокислотный состав (см. стр. 122). После этого пептид отделяют от полимерного носителя одним из методов, рассмотренных на стр. 93—104. [c.88]

Принцип ТФ-анализа аминокислотной последовательности заключается в ковалентном связывании пептида с нерастворимым носителем и последующим отщеплении (при помощи ФИТЦ) аминокислот от пептида, связанного с носителем. Разработан набор методов присоединения пептидов и белков к носителям, применяемым в виде шариков (производные полистирола или стекла, содержащие различные функциональные группы [33]). Носитель с ковалентно присоединенным пептидом (пептидил-носитель) можно упаковать в колонку и тщательно промыть реагентами и растворителями, используемыми в процессе анализа (при этом в отличие от ЖФ-метода нет опасности вымывания образца). После проведения полного цикла отщепления анилинотиазолинон АТЗ-аминокислоты вымывают из колонки, а пептид, укороченный на одну аминокислоту, остается присоединенным к носителю и доступным для проведения следующего цикла реакций. [c.375]

РИС. 12.4. Колонка для анализа пептидов на микроуровне. Материал колонки — тефлоновая трубка, внутренний объем которой зависит от количества используемого носителя. В верхнюю часть колонки введена узкая тефлоновая трубка, нижний конец колонки закрыт пористым тефлоновым фильтром с диаметром пор 2 мкм (фирма Zitex, hernplast In .). Колонка помещена в термостатированную стеклянную трубку (см. рис. 12.1) [c.394]

Есть несколько сооби ений о получении, свойствах и использовании в твердофазном пептидном синтезе акриловых сополимеров, состоящих главным образом из поли-Ы,Ы-диметилакрил-амида [23, 95, 96] или поли- -акрилпирролидона [93, 97]. Эти полимеры совместимы с гораздо большим числом полярных и умеренно полярных растворителей (и, по-видимому, также с присоединенными пептидами), чем полиакриламидные или по-листирольные носители. Поэтому представляется заманчивым использовать указанные полимеры в качестве носителей для ТФ-анализа пептидов. Выбирая носитель, мы ориентируемся прежде всего на жесткую конструкцию матрицы, что позволяет избежать серьезных осложнений, связанных с разбуханием сорбента и блокированием колонки. Для того чтобы можно было проводить реакцию присоединения ФИТЦ в сильнощелочной среде, мы выбрали вместо стеклянных носителей макропористый полистирол. Дополнительное достоинство полистирола состоит в том, что на нем можно устойчиво и воспроизводимо проводить многочисленные реакции химической модификации. Выяснилось, что эта жесткая, сильносшитая матрица тем не менее обладает некоторой гибкостью на молекулярном уровне и обеспечивает большой набор микроокружений (включая неблагоприятные) в структуре гидрофобных поверхностей. [c.442]

Для анализа коротких I пептидов более эффективен подход, заключающийся в их ковалентном присоединении к нерастворимому носителю. Этот принцип положен в основу твердофазного секвенатора, где реакц. сосудом служит хроматографич. колонка, с носителем к-рой ковалентно связан исследуемый пептид. Через колонку последовательно пропускают реагенты и р-рители. Носителями чаще всего служат полистирол и пористое стекло. В кач-ве функц. группы, реагирующей с пептидом, обычно использует- [c.252]

С помощью Л. X, удается выделять и разделять соед., склонные к координации с ионами металлов, в присут. больших кол-в минер, солей и некоординирующихся в-в. Напр, с использованием иминодиацетатной смолы с ионами Си из морской воды выделяют своб. аминокислоты На катионитах с ионами Ре разделяют фенолы, с ионами Лg -сахара. На карбоксильных катионитах с N1 разделяют амины, азотсодержащие гетероциклы, алкалоиды. На силикагеле с нанесенным слоем силиката Си в водно-орг. среде в присут. ННз проводят быстрый анализ смесей аминокислот и пептидов, причем элюируемые из колонки комплексы легко детектируются спектрофотометрически. На высокопроницаемых декстрановых сорбентах с иминодиацетатными группами, удерживающими ионы N1 или Си- , селективно выделяются из сложных смесей индивидуальные белки и ферменты, содержащие иа пов-сти своих глобул остатки гистидина, лизина или цистеина. Силикагели с фиксированными на пов-сти инертными т/)ис-этилендиа.миновыми комплексами Со используют для т. наз. внешнесферной Л. х. смесей нуклеотид-фосфатов. Методом газовой Л. х. с помощью фаз, содержащих соли Ag , разделяют олефины, ароматич. соед., простые эфиры. Тонкослойная Л. х. на носителях, пропитанных солями Ag , применяется для анализа стероидов и липидов. [c.590]

В главе Аминокислоты изменения коснулись главным образом разделов, посвященных синтезу и анализу, причем особое внимание уделено биотехнологическим способам получения аминокислот, асимметрическому синтезу и новейшим методам выделения. В главе Пептиды более точно изложены и обоснованы цели химического синтеза и введен краткий исторический очерк развития этой области. Защитные группы представлены в таком порядке, как это обычно принято в литературе. При описании методов синтеза пептидов, которых в настоящее время известно около 130, авторы ограничивались наиболее широко применяемыми в практике пептидного синтеза. Кроме того, затронуты новые интересные направления пептидного синтеза, как, например, ферментативный. В разделе Пептидные синтезы на полимерных носителях рассмотрены важнейшие варианты этих синтезов. Семисинтез белков описывается во вновь введенном разделе Стратегия и тактика . В этом же разделе авторы попытались критически оценить синтез пептидных и белковоподобиых соединений и определить его возможности и границы применения. [c.7]

Все перечисленные выше твердые носители содержат свободные аминогруппы, за которые и прикрепляются пептиды или белки для анализа последовательности. Используются три основных метода связывания. В первом пептид обрабатывают Л -(3-диметиламино)-Л -этоксипропилкарбодиимидом в отсутствие нуклеофилов. Карбоксильные группы пептида сначала образуют 0-ацилизомоче-вины аналогичные производные, расположенные в боковых радикалах аспарагиновой и глутаминовой кислот, легко перегруппи- [c.268]

М. М. Шемякин, Ю. А, Овчинников разработали методы синтеза полипептидов на полимерном носителе, послужившие началом создапия в СССР экспресс-методов синтеза полипептидов в промышленных масштабах. Ю. А. Овчинни ков с сотрудниками развил работы по анализу пространственной структуры пептидов и белков с помощью спектральных и расчетных методов. [c.696]

Дополнительный теоретический анализ естественного градиента pH выполнен Свенссоном [9, 12] в 1961 и 1962 годах. Он предложил заменить многокамерный прибор градиентом плотности и описал свойства амфолитов-носителей, пригодных для формирования стабильного градиента pH. Свеиссон рекомендовал использовать низкомолекулярные амфолиты, обладающие буферными свойствами и- проводимостью в изоэлектрической точке . Поиски подходящих носителей показали [12, 13], что доступные амфолиты не вполне пригодны для работы, особенно при pH 4—7. Для этой цели более или менее пригодны смеси пептидов, полученные частичным гидролизом белков, однако их присутствие затрудняет анализ разделяемых смесей [13]. До настоящего времени наиболее удачными амфолитами оказались соединения, которые были специально синтезированы для этих целей. [c.301]

С целью сведения к минимуму реакции образования четвертичных аммонийных групп Мэррифилд предложил применять при реакции этерификации немного менее 1 эквивалента триэтиламина. Присутствие четвертичных аммонийных групп означает также, что для определения количества первой аминокислоты на носителе нельзя использовать элементарный анализ на азот. Для этой цели, как и для всего аналитического контроля синтеза, абсолютно необходимы другие подходящие методики или прибор количественного аминокислотного анализа. Было показано, что элементарный анализ не обеспечивает определения чистоты пептидов, и многие опытные химики, занимающиеся пептидами, больше не тратят бесполезно свое время и силы на выполнение таких анализов. Единственным удовлетворительным методом определения количества аминокислоты на носителе является кислотный гидролиз с последующим количественным аминокислотным анализом. Гидролиз нужно проводить в растворителе, который смачивает полимер и обеспечивает его набухание. Для этой цели обычно используют смесь эквивалентных количеств диоксана и концентрированной соляной кислоты. [c.28]

Полимер-носитель трижды промывают трифторуксусной кислотой (каждый раз берут по 10 мл СРзСООН на 1 г полимера), следя за тем, чтобы трифторуксусная кислота при каждой промывке пропитывала и экстрагировала полимер в течение 1 мин, затем раствор пептида упаривают досуха при пониженном давлении без нагревания. Пептид несколько раз растворяют в подходящем растворителе, например в смеси уксусная кислота — вода (3 1) или метанол— вода (1 1), и упаривают растворитель при пониженном давлении для удаления избытка бромистого водорода (пептид на этой стадии всегда обнаруживает кислую реакцию). Если в раствор для отщепления пептида был добавлен анизол, неочищенный продукт тщательно экстрагируют эфиром (для удаления анизола, метионина и метилэтилсульфида можно использовать также хроматографию на сефадексе), а затем сушат пептид в высоком вакууме. Неочищенный пептид после отщепления раствором бромистого водорода в трифторуксусной кислоте всегда содержит много нримесей непептидного характера, поэтому вес вещества на этой стадии не является действительным показателем выхода. Выход неочищенного пептида можно определить лишь после аминокислотного анализа гидролизата. [c.95]

Преыму1цества использования пористых стекол для анализа аминокислотной последовательности. Шарики PG сохраняют постоянный объем в ходе всего цикла отщепления, не подвержены набуханию — сжатию, поэтому в отличие от носителей на основе органических полимеров ими можно заполнять колонки без разбавления другими материалами. Стекла нечувствительны к давлению в колонке, поэтому жидкости можно прокачнва 1ь через колонку с высокой скоростью. Они химически устойчивы во всех средах, за исключением сильных оснований, особенно нри высоких температурах, поэтому присоединение пептидов к носителям следует проводить при рН<10. [c.383]

N-концевые аминокислоты и остатки лизина после отщепления от пептидной цепи остаются ковалентно связанными с носителями, поэтому их нельзя идентифицировать. Однако в случае неполного присоединения N-концевых аминокислот к смоле (стеклу) среди продуктов отщепления обнаруживают в небольших количествах ФТГ-производные N-концевых аминокислот. Обычно после пришивки пептида к носителю для блокирования оставшихся свободных аминогрупп смолы (стекла) используют метилизотиоциапат (МИТЦ). В этом случае образуется метил-тиогидантоин (МТГ) первой аминокислоты [28]. Мы заменили МИТЦ на ФИТЦ, поэтому N-концевая аминокислота можег быть определена в виде обычного ФТГ-производного, При анализе на микроуровне такая обработка не влияет на вы.чоды отщепления при условии, что использовался перегнанный ФИТЦ. [c.388]

На этой стадии чаще всего используется буфер Л э 1 [27]. Недавно предложен безводный буфер на основе ДМФА (содержащий 2,5% триэтиламина или К-метилморфолина) [43, 60]. В анализе с использованием ДАБИТЦ — ФИТЦ хорошие результаты дает использование буфера № 3 (рис. 12.5). Безводные или содержащие ДМФА буферы предпочтительнее предлагавшихся ранее водных (поскольку безводная среда создает гидрофобное окружение пептида, присоединенного к полимеру). Эти буферы применимы как для полимерных, так и для стеклянных носителей. [c.394]

Присоединение пептида или белка к активированному с помощью ДИТЦ аминостеклу и цикл твердофазной деградации по ДАБИТЦ—ФИТЦ-методике проводят, как изображено схематически на рис. 14.2. Конденсация пептида с твердым носителем и последующий анализ последовательности осуществляют в пробирках со стеклянными пробками, на дне которых находится магнит (2X6 мм). Помещают пробирку в нагрева-тельный блок (52 °С) над магнитной мешалкой. На каждой стадии сушки используют стеклянную пробку (С-10) с пори- [c.420]

Со времени появления секвенатора квадрол оставался главной составной частью буферов. Он удовлетворял всем основным требованиям автоматического анализа, но обладал единственным недостатком для его удаления необходима экстракция реакционной массы растворителями (например, этилацетатом), в которых растворяются некоторые пептиды. Во избежание этого в 70-0 годы стали широко использовать летучие буферы на основе ДМАА, К,М-диметилбензиламина (ДМБА) и тому подобных аминов. И только после появления [3] в 1975 г. программы с применением 0,1 М квадрола предложения использовать небелковый носитель — полибрен — и введения в комплект прибора охлаждаемой ловушки буферы на основе квадрола снова оказались приемлемыми. [c.428]

Большие успехи в применении нерастворимых носителей для твердофазного (ТФ) синтеза пептидов [72] стимулировали разработку метода анализа аминокислотной последовательности пептидов, ковалентно присоединенных к нерастворимым полимерам [61]. Впоследствии метод ТФ-анализа гтоуктуры пептидов удалось автоматизировать [62]. Общая особенность методов синтеза ( сборки ) и анализа аминокислотной последова- [c.437]

Ни один из известных сегодня носителей пе удовлетворяет одновременно всем вышеупомянутым критериям. Слабосши-тые полистирол и полиакриламид должны предварительно хорошо набухнуть в растворителе для того, чтобы функциональные группы носителя или пептида, присоединенного к носителю, были доступны для реагентов. Поэтому при работе с такими сорбе11тами очень важен выбор растворителей. При смене растворителей часто происходит усадка или разбухание этих гелеобразных полимеров, что ведет к образованию каналов или же запиранию колонки. Для предотвращения этих явлений частицы пептидил-полимера тщательно смешивают с гораздо большими объемами маленьких стеклянных шариков. Однако увеличение общего объема реакционной массы требует применения большего расхода реагентов и промывающих растворителей, ведет к сорбции реагентов и побочных продуктов реакции. Соответственно возрастает уровень фона в анализируемых образцах, что может стать серьезным препятствием для анализа на микроуровне. [c.440]

Предварительное расш,епление пептидов, присоединенных к ТФ-носителям, проводится почти исключительно по методу Эдмана с применением реагентов и условий, аналогичных таковым для ЖФ анализа. Обсуждение этих методик читатель может найти в литературе, относящейся к разд. 1б,2Л. [c.448]

ТФ-подход значительно стимулировал развитие работ по тиоцианатному расш еплению, хотя до сих пор не удавалось отщепить более 6 аминокислот. Особые сложности возникают при анализе как самих остатков Asn, Asp, Glu, Pro, так и остатков, следующих за ними. Pro отщепляется на первой же операции своего цикла отщепления (обработка тиоцианатом аммония), поэтому вместе с ним в продуктах того же цикла появляется следующая аминокислота [58]. Отщепление других вышеприведенных аминокислот происходит с низкими выходами. Идентификацию тиогидантоинов проводили различными методами без использования преимуществ высокочувствительной фотометрии. Трудно оценить возможность определения длинных участков последовательности без проведения дополнительной вдумчивой и систематической работы. Мы надеемся, что подобное исследование будет продолжено, так как С-концевые отщепления могут очень полезно дополнять анализ N-концевой последовательности. Кроме того, количественное присоединение пептидов по а-аминогруппе к нерастворимому носителю происходит в целом значительно легче, чем конденсация по С-концевому карбоксилу. [c.455]

Для устранения потерь с промывками образца был предложен твердофазный (ТФ) метод анализа [И] Благодаря ковалентному присоединению изучаемого полипептида к химически модифицированной матрице носителя (па основе стекла или полистирола) исключены потери образца при промывке его органическими растворителями в процессе отщепления аминокислот. Простота конструкции колонки-реактора ТФ-секвепа-тора облегчает ее миниатюризацию, что позволяет повысить чувствительность определения последовательности. В то же время ковалентное присоединение пептидов и белков к носителю в гетерогенной системе пе так просто осуществить, а выходы на этой стадии составляют лишь 20—50%. Реакции связывания белка (пептида) с матрицей носителя проводятся вне секвенатора, они весьма трудоемки и требуют длительного времени. Необходимо отметить, что планирование эксперимен- [c.464]

При проведении процесса в растворе для отделения избытка реагентов от пептидилтиогидантоина и тиогидантоина от укороченного пептида обычно используют хроматографию на сефадексе. Эти разделения и лиофилизация фракций с колонки отнимают много времени. Твердофазный анализ исключает многие из этих проблем, но неудачный выбор (или предварительный синтез) активированного носителя и сложности присоединения пептида к носителю резко снижают шансы иа успех определения. Ниже приводится детальное описание методик. [c.502]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология