Рибонуклеаза концентрация

Использование этих стандартных спектров КД для подсчета соотношений а-спирали, -формы и неупорядоченных конформаций глобулярных белков с попыткой воссоздания экспериментально измеренного спектра КД белка по алгебраической сумме различных долей спектра из трех чистых конформаций стало главным применением этого спектроскопического метода в данной области. Достигаемая при этом точность зависит от того, насколько конформационно чистым является стандарт, и для этой цели были рекомендованы и несколько поли ( -аминокислот). Неопределенностью, однако, является то, в каких условиях эти поли (аминокислоты) становятся полностью конформационно неупорядоченными. В качестве стандарта с неупорядоченной конформацией предложен поли ( -серин) при высоких солевых концентрациях [23]. КД-спектры, вычисленные для миоглобина, лизоцима и рибонуклеазы на основе их третичных структур, которые ранее были установлены для этих глобулярных белков по данным рентгеноструктурного анализа, согласуются по всем характеристическим точкам с экспериментальными спектрами КД при использовании в качестве одного из стандартов поли ( -серина) [35]. Подобные данные по анализу соответствия кривых по нативным белкам и полипептидам многочисленны, и они дают информацию о степени конформационной упорядоченности этих веществ в растворах [36]. Эти данные не дают, конечно, ответа на вопрос, какая именно часть первичной структуры а-спирализована, какая отвечает -форме и какая— неупорядоченной, однако основываясь на последовательности аминокислотных остатков белка или полипептида, можно строить рискованные предположения о том, где эти конформации локализованы. Как отмечалось в разд. 23.7.2.4, аминокислоты белков разделяются на те, которые при включении в полипептиды способствуют принятию упорядоченной конформации, и те, которые тому не способствуют. Такая информация получена при рассмотрении [c.437]

Рис. 2.11. Зависимость ширины интервала плавления комплекса ДНК с лигандом -денатурированной рибонуклеазой от отношения концентрации лиганда в растворе О к концентрации фосфатных групп полинуклеотида в растворе Р.

ДНК, могут существенно изменять кривые плавления, когда их молярная концентрация О в растворе значительно меньше молярной концентрации Р в растворе оснований, входящих в состав ДНК. К такого рода веществам относятся ионы тяжелых металлов (Си, Ре и др.), некоторые антибиотики (актиномицин) и кра.сители (акридиновый оранжевый, профлавин), некоторые белки. В качестве примера см. рис. 2.11, где приведена зависимость ДГ от концентрации белка рибонуклеазы. Существенно подчеркнуть, что скрепки связаны с ДНК межмолекулярными силами и за время опыта перераспределяются на молекуле ДНК, занимая при каждой температуре термодинамически наиболее выгодное состояние. [c.75]

Обычно рибонуклеазу выделяют из свежей бычьей поджелудочной железы. Для этого ткань поджелудочной железы экстрагируют 0,25 п. серной кислотой, охлажденной на льду. Затем добавляют сернокислый аммоний до 0,6 насыщения, переводя в осадок трипсиноген, химотрипсиноген и дезоксирибонуклеазу. Рибонуклеазу осаждают из фильтрата, повышая концентрацию сернокислого аммония до 0,8 насыщения. Путем фракционированного осаждения сернокислым аммонием можно получить рибонуклеазу в чистом виде. Полученный фермент можно перекристаллизовать из этилового спирта. [c.85]

Эксперименты показали, что после восстановления нативной рибонуклеазы, взятой в концентрации менее 0,1%, и последую щего ее окисления около 70% окисленного материала оказы-вается растворимым и активность этой растворимой фракции составляет от 80 до 100% активности нативного фермента. Осадок состоит, вероятно, из молекул, соединенных межмолекулярными связями. Окисление в присутствии мочевины не приводит к появлению активного продукта. Эти факты свидетельствуют о том, что характер свертывания молекулы белка предопределен ее аминокислотной последовательностью. Действительно, из 105 вариантов образования дисульфидных связей осуществляется только тот, при котором молекула обладает ферментативной активностью (не исключено все же, что имеется несколько активных модификаций рибонуклеазы). [c.279]

При добавлении мочевины к воде показатель преломления среды увеличивается. Учитывая это, объясните, почему при добавлении малых количеств мочевины к водному раствору рибонуклеазы в ее разностном спектре наблюдается небольшой сдвиг при 285 ммк в красную область спектра, а при увеличении концентрации мочевины до 5 М — резкий сдвиг в голубую область. [c.301]

Рис. 156. Типичные кривые, выражающие зависимость V от концентрации связываемых молекул или ионов А. Рибонуклеаза неустойчива, если произошло отщепление всех протонов, способных диссоциировать штриховой участок кривой для этого белка не соответствует обратимому равновесию

Фиг. 69. Кривые диффузии рибонуклеазы в 0,01 н. растворе уксусной кислоты через целлофан 20/32 при различных концентрациях соли и в дистиллированной воде [3].

Зависимость времени релаксации реакции (9.11) от суммы равновесных концентраций рибонуклеазы и уридин-З -монофосфата. Уелрвия опыта pH 5,5 25° С ионная сила 0,2М (K I) [c.201]

РИС. 2-41. Спектр ПМР для нативной рибонуклеазы, снятый при 60 МГц (А) и 220 МГц (Б) и для денатурированного фермента, снятый прн 220 МГц (В). Концентрация фермента в НзО составляла 11%, pD = 7.5 (А) н 6,8 (Б). Эталон —соль Тьера (Ma Donald С. С., Phillips W. D., J. Am. hem. So ., 89. 6333, 1967). [c.187]

Наблюдать непосредственно за броуновским движением молекул невозможно, однако коэффициент диффузии для них может быть измерен, например, по скорости размывания границы между двумя растворами с разными концентрациями данного вещества [13]. Коэффициент диффузи№ для H HO (НПО) вНгО при 25°С составляет2,27-10 см -с тот же-порядок имеют коэффициенты диффузии для ионов К" " и С1 [14]. ДлЯ многих небольших молекул 10 см с и уменьшается с увеличением размера молекулы. Так, для рибонуклеазы (мол. вес 13 683)-0=1,Ы0 см -с , для миозина (мол. вес 5-10 ) ЫО Коэффициент диффузии связан с радиусом сферической частицы г, вязкостью т и константой Больцмана к соотношением, известным под названием уравнение Стокса — Эйнштейна [c.15]

Для полного восстановления обычно необходимо использовать тиол и реагент, вызывающий разрыв водородных связей, а следовательно, и разделение пептидных цепей. Так, инсулин полностью восстанавливается только тногликолятом в присутствии 8 М раствора мочевины [202], а электрофорез на бумаге в 8 М растворе мочевины позволяет разделить две полипептидные цепи. В отсутствие мочевины цистин восстанавливается не более чем на з- Степень восстановления дисульфидных связей рибонуклеазы [282] также определяется концентрацией мочевины. Тиогликолят при pH 7 в отсутствие поверхностно-активного вещества [209] или гуанидина [171] восстанавливает только одну цистиновую связь из 17 связей, имеющихся в альбуминах человека и быка (мол. вес 65 000). В 0,2 М растворе натриевой соли децилсульфата при pH.7 в течение 1 час при комнатной температуре восстанавливаются все цистиновые связи. [c.172]

Значительно более сложная ситуация возникает при синтезе соединений с несколькими дисульфидными связями. Например, если в пептиде содержится 6 остатков цистеина <3 дисульфидных связи, как в рибонуклеазе А), то формально возможно образование 105 структурных изомеров с разными дисульфидными связями. В этом случае направление и полнота реакции обычно определяются специфической укладкой пептидной цепи, что позволяет проводить самопроизвольное окислительное замыкание нужных дисульфидных связей. Естественно, здесь требуется тщательный подбор условий окислитель, концентрация, pH среды, температура, причем даже в оптимальных условиях выход целевого продукта невысок и не исключается образование пббочных соединений. [c.154]

При более высоких концентрациях РНазы циклофосфатные группы раскрываются, образуя З -фосфатные группы. Процесс раскрытия циклофосфатов может быть осуществлен кратковременной обработкой кислотой при этом образуются смеси 2 - и З -монофосфатов Такие рибонуклеазы относятся к эндонуклеазам. [c.312]

Влияние лигандов, в том числе органических веществ, на структуру и свойства белков очень разнообразно. Известно, что низшие спирты, амины, амиды и другие вещества вызывают развертывание белковых глобул [128, 130], понижают температуру термического перехода глобула — клубок [131, 132] (в случае рибонуклеазы) и перехода тройная спираль — клубок (для коллагена) [133]. Существуют многочисленные наблюдения, показывающие, что образование комплексов белка с большим числом ПАВ [134—137] может сопровождаться частичной дезорганизацией молекулы белка, проявляющейся в изменении растворимости, вязкости, УФ-спектров, оптического вращения [138—146], Полная дезорганизация белка (денатурация) наблюдается при взаимодействии с большими количествами додецил- и тетрадецилсульфата натрия [142—145]. С другой стороны, известно и стабилизирующее действие органических соединений на структуру белка. Например, в работах [146—149] установлено, что низкие концентрации ПАВ стабилизуют белки против денатурации мочевиной в кислых и щелочных областях pH. Авторы [150] наблюдали стабилизирующее действие стероидов. В работе [151] также отмечалось стабилизирующее действие малых концентраций ПАВ на структуру белка и разрушающее больших. [c.28]

Хаммел и Дрейер [31] уравновешивали сефадекс G-25 (0,4 X X 100 см) раствором 2 -цитидиловой кислоты (9 X 10 М) в 0,1 М ацетатном буфере, после чего в том же растворе в колонку вводили 2 мг рибонуклеазы. На диаграмме элюирования помимо пика с /Саю = О, соответствующего комплексу белок — цитидило-вая кислота, наблюдали минимум (с Kav = 0 по отношению к линии фона 2 -цитидиловой кислоты. Если в раствор образца постепенно добавлять все большие количества цитидиловой кислоты, то минимум становится менее выраженным и наконец сливается с линией фона. Концентрация -цитидиловой кислоты в этот момент соответствует точке насыщения комплекса фермент-ингибитор. При дальнейшем увеличении концентрации 2 -цитидиловой кислоты на диаграмме элюирования появляется пик с Kav — 1. [c.148]

Биологические функции имидазола самым тесным образом связаны с основностью его молекулы. Именно по этой причине остаток гистидина в белке содержит в физиологической области pH около 7,4 одновременно заметные количества свободного основания и протонированного имидазолия. Это означает, что он может функционировать как акцептор и как донор протонов в зависимости от потребностей своего ближайшего окружения. Такую же роль играют остатки гистидина и в различных ферментах, например в рибонуклеазе, альдолазе, некоторых протеазах. Другим важным результатом проявления основных свойств имидазола является буферное действие гистидина в системе гемогло-бин-оксигемоглобин [7]. Отмечалось [7], что имидазольная группа в гистидиновой единице полипептидов — самое сильное основание, какое присутствует в каких-либо количествах при физиологических значениях pH, а катион имидазолия является самой сильной из кислот, обнаруженных в заметной концентрации (колебания р/(а зависят от местного окружения). [c.439]

Возможность получения количественных данных по связыванию для взаимодействия белков с иммобилизованным пептидом впервые исследована Гавронским и Уолдом [8]. Определена константа диссоциации, равная (2,5 1,0) 10 моль/л, путем прямого титрования 5-белка рибонуклеазы, связанного с 5-пептидом, иммобилизованным на агарозе. Хорошие кривые титрования получены при концентрации 8-белка 10 —моль/л. Когда концентрация связанного белка равна концентрации белок-пептидного комплекса, взаимодействие может быть описано соотношением [c.58]

Несмотря на малый молекулярный вес и сравнительно высокое содержание необычных минорных) оснований (г1)У и т. д.), структура этих РНК обладает удивительно высокой степенью упорядоченности. Особенно высока упорядоченность в присутствии ионов Mg +, абсолютно необходимых для осуществления биологической функции s-PHK одновалентные катионы даже в больших концентрациях подобного эффекта не вызывают. В присутствии ионов меняется не только точка теплового перехода, но также и его ширина (а следовательно, кооперативность перехода и стэкинг-взаимодействие между парами оснований). При этом оказывается весьма затруднительной реакция с рибонуклеазой или формальдегидом. На фиг. 57 показаны полная первичная и предполагаемая вторичная структуры аланиновой S-PHK (исследована Холли), тирозиновой s-PHK (исследована Мэдисоном в лаборатории Холли), двух достаточно близких сериновых s-PHK (изучены Цахау и его сотрудниками) и фенилаланиновой s-PHK (исследована группой Кораны). Все эти типы РНК были выделены из дрожжевых клеток. Две сериновые РНК содержат по 84 нуклеотида, фенилаланино- [c.158]

Процесс установления равновесия иногда занимает день или больше. Поскольку при таких больших сроках возможны денатурация или бактериальное загрязнение, искажающие результаты эксперимента, разработан ряд приемов, позволяющих ускорить установление равновесия. Длительность этого процесса прямо пропорциональна квадрату высоты столба жидкости. Если оиа равна 1—3 мм, процесс установления равновесия длится в течение нескольких часов. Для ячеек с высотой столба жидкости 0,8 мм это время при седиментации сахарозы, рибонуклеазы и бычьего сывороточного альбумина равно соответственно 15, 45 и 70 мин. Однако при таких размерах снижается точность и чувствительность к гетерогенности, хотя в этом случае можно работать при больших угловых скоростях. С помощью многоканальных ячеек производится одновременное определение нескольких концентраций при одинаковой температуре. К уменьшению времени достижения равновесия приводит также такой режим вращения ротора, при котором начальное значение скорости выбирается несколько завышенным и затем постепенно снижается. Концентрацию можно измерять с помощью интерференционного метода Релея, а молекулярный вес рассчитывать, используя значение градиента концентрации в точке перегиба (т. е. средней точке на фиг. 35, Л). Для обеспечения постоянства скорости, необходимого в некоторых экспериментах по седиментационному равновесию, лучше всего использовать магнитную подвеску стального р тора в высоком вакууме. В этих условиях скорость уменьшается всего на 1 об1мин за сутки. [c.194]

Сравнение скоростей исчезновения сульфгидрильных групп и изменения оптического вращения при окислении восстановленной рибонуклеазы со скоростью восстановления ферментативной активности показало, что сначала наблюдается зависящий от концентрации период индукции, в течение которого скорость восстановления ферментативной активности отстает от скорости исчезновения сульфгидрильных груг(п и уменьшения вращения. Посредством химического анализа было установлено, что- на этом этапе образуются межмолекулярные дисульфидные связи, которые затем исчезают в результате сульфгидрил-ди-сульфидных реакций обмена, приводящих к образованию термодинамически выгодной нативной структуры. О том же свидетельствуют эксперименты, показавшие, что рибонуклеаза, утра- [c.279]

Рис. 3.4. Зависимость температуры конформационного перехода рибонуклеазы от концентрации электролитов [29]. Структурная температура, определенная спектроскопически, для соответствующих электролитов указана штриховыми стрелками. Показано изменение Гпер в результате воздействия ионов на структуру воды.

Гетр — структурная температура раствора, температура чистой воды с эквивалентной концентрацией свободных ОН-групп Гпер-температура структурного перехода рибонуклеазы Са — удельная теплоемкость жидкости в условиях насыщения [c.78]

Стехелин и сотр. [162] частично деполимеризовали рибонуклеиновую кислоту из дрожжей при помощи рибонуклеазы поджелудочной железы. Затем пропускали образец через колонку длиной 30СМС диэтиламинозтилцеллюлозой и вымывали раствором бикарбоната аммония, постепенно повышая концентрацию аммиака. На элюентной кривой получается двадцать один пик не полностью разделенных компонентов. Первые тринадцать из них идентифицировали как нуклеотиды состава Ц, У, АЦ,, АУ, ГЦ, ГУ 4 ААЦ, ААУ, ГАЦ, АГЦ, ГАУ, АГУ, ГГЦ и ГГУ, где использованы следующие обозначения А — аденин, Г — гуанидин, У — уридин и Ц — цитидин. Последние восемь пиков на хроматограмме принадлежали, по-видимому, неидентифициро-ванным тетрануклеотидам. [c.335]

Фракционирование пептидов на ионообменных смолах основано на целом ряде принципов, о которых уже говорилось выше (гл. I и II). Сюда входят и различия в электрохимических свойствах разделяемых фрагментов, и различное сродство неполярных радикалов к бензольным кольцам матрицы смолы, и изменение концентрации конкурирующих ионов в буферном растворе. Поэтому элюция пептидов со смолы достигается путем пропускания через колонку буферных растворов изменяющейся ионной силы и pH. Это изменение концентрации ионов и pH может осуществляться линейно или ступенчато. Элюируемые компоненты идентифицируют нингидриновой колориметрией, лиофилизуют (высушивают из замороженного состояния) и проверяют на гомогенность с помощью хроматографии на бумаге и методом пептидных карт. Негомогенные пики фракционируют дополнительно. В качестве примера можно привести разделение пептидов, полученных триптическим гидролизом окисленной (т. е. лишенной дисульфидных мостиков) рибонуклеазы (рис. 11). [c.84]

Изотермы адсорбции неионных полимеров и противоположно заряженных полиэлектролитов часто описываются так называемыми изотермами высокого сродства , характеризующимися полным извлечением полимера из раствора при низких концентрациях (начальная часть изотерм совпадает с осью ординат) и быстрым выходом Г на насыщение при высоких. Рис. 3.1 иллюстрирует такие изотермы на примере адсорбции рибонуклеазы поджелудочной железы крупного рогатого скота частицами полистирольного латекса (по данным Норде и Ликлема, 1977). [c.41]

Фиг. 52. Кривые скорости гидролиза окисленной рибонуклеазы (1 %-ный раствор) химотрипсином (/) и трипсином (//) при pH 7,0 и 25° (концентрация фермента 0,005%) (по данным Херса и др. [16]).

Собственно говоря, в опыте Спигелмана все естественное ни РНК, ни полимераза, ни нуклеотиды не были синтезированы в лаборатории все они были получены из живых клеток или из бактериофага Рр. Лишь условия опыта были искусственными , т. е. имитируюш,ими природные условия. Описанная бесклеточная система отличается большой чувствительностью достаточно малейшего изменения концентрации компонентов или появления загрязнений (скажем, примеси рибонуклеазы)— и она перестает работать. Приходится только удивляться, что такую систему удалось собрать вне клетки, что точное копирование генома вообще может происходить в пробирке. Но тот факт, что эта столь лабильная система, за которой необходимо так заботливо следить вне клетки, может функционировать и в клетке, причем несравненно надежнее, граничит с чудом. Ведь в клетке — это означает (помимо всего прочего) в присутствии тысяч промежуточных продуктов обмена и тысяч ферментов (в том числе рибонуклеазы), в присутствии рибосом и РНК, всевозможных ионов и т. д. Почти каждый из этих компонентов в отдельности мог бы разрушить нашу систему в реторте . Напротив, в клетке они, по-видимому, не вредят синтезу, точно так же как, скажем, удвоение генома не нарушает других клеточных процессов. [c.398]

В качестве критерия чистоты соединения пользуются также растворимостью. Известно, что растворимость гомогенного вещества постоянна и не изменяется в присутствии избытка твердого вещества. Этот метод вряд ли пригоден для определения растворимости белков в чистой воде, так как растворимость белков в воде сильно зависит от следов электролитов и от концентрации водородных или гидроксильных ионов. Влияние этих веществ можно исключить, если в качестве растворителя использовать концентрированный раствор соли. При проверке растворимости кристаллического яичного альбумина или карбокси-гемоглобина в растворе сернокислого ам1мония было найдено, что растворимость до некоторой степени зависит от количества твердой фазы [22]. На этом основании было сделано заключение, что молекулы этих белков можно рассматривать как системы обратимо диссоциирующих компонентов. Очень тщательные определения растворимости кристаллического химотрипсиногена [23] и рибонуклеазы [24] показали, что эти белки ведут себя как гомогенные соединения. В высшей степени важно, что эти гомогенные белки являются ферментами (см. гл. ХП). [c.15]

Рибонуклеаза Т. Олигонуклеотиды, образовавшиеся при действии на РНК ианкреатической РНК-азы, гидролизуют 30 мин нри 37° рибонукле-а ин1 Т1 в 0,01 М грыс-буфере с рП 7,4, содержащем 0,001 М ЭДТА п фермент в концентрации 0,1 мг мл. Затем продукты гидролиза обрабатывают кислотой так же, как это было описано ранее. [c.65]

Смотреть страницы где упоминается термин Рибонуклеаза концентрация: [c.211] [c.299] [c.322] [c.405] [c.414] [c.310] [c.922] [c.254] [c.56] [c.37] [c.135] [c.230] [c.130] [c.66] [c.82] [c.86] [c.148] [c.253] [c.254] [c.310] [c.76]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология