Полинуклеотиды денатурация

Для электрофоретического разделения различных полинуклеотидов используют эффект молекулярного сита, присущий целому ряду гелей. Детальные исследования показали, что посредством электрофореза в гелях можно получить данные о некоторых характеристиках молекул нуклеиновых кислот. Так, например, методом электрофореза можно определить молекулярную массу того или иного полинуклеотида и установить, является ли он рибо- или дезоксирибонуклеотидом. Кроме того, можно выяснить, состоит ли данная молекула из одной или двух полинуклеотидных цепей, а в случае ДНК определить, какую форму имеет молекула — линейную или кольцевую. Несмотря на существование более точных физических и химических методов определения указанных свойств, электрофорез в некоторых отношениях имеет преимущество перед ними. Оно состоит в том, что электрофоретические методы относительно просты, требуют сравнительно недорогого оборудования и могут быть использованы в тех случаях, когда для анализа доступно лишь небольшое количество неочищенного материала. Некоторые физические параметры разделенных нуклеиновых кислот изучают, не прибегая к их элюции из гелей. Например, Роз-нер и др. [1115] исследовали тепловую денатурацию нуклеиновых кислот, разделенных путем электрофореза в гелях. Фраг- [c.368]

Ультрафиолетовое поглощение нуклеииовых кислот зависит от ряда факторов, среди которых ие последнее место занимает характер предварительной обработки препарата. Современные методы выделения рибонуклеиновой и дезоксирибонуклеиновой кислот позволяют избежать большей части условий, которые вызгл-вают денатурацию, например, низких или высоких значений pH, низкой ионной силы или высоких температур, ведущих к необратимым изменениям в спектрах поглощения [263—267]. Для так называемой нативной ДНК значение экстинкции (бмакс), отнесенное к числу фосфатных остатков (т. е. средняя величина экстинкции, приходящейся на один нуклеотид) в 10 Л4 (или выше) растворе хлористого натрия и нейтральном значении pH, лежит между 6000 и 6500. В бессолевом растворе даже при pH 7 происходит глубокая денатурация и между pH 6,5 и 7,5 изменения в ультрафиолетовом поглощении достаточно велики [265], по-видимому, за счет смещения значений рК в результате протонирования адениновых и цитозиновых остатков в этой области значений pH. Экстинкция соответствующей смеси мононуклеотидов должна быть равна приблизительно 10500, и, следовательно, для ДНК характерны значительные гипохромные эффекты. Существенно, что изменения ультрафиолетового поглощения полинуклеотидов в результате изменений pH, температуры и ионной силы отражают большие или малые конформационные изменения (несомненно, наряду с другими физическими свойствами), которые увеличивают или уменьшают гипо-хромный эффект. [c.584]

Различия в высшей структуре нуклеиновых кислот легко обнаруживаются по гиперхромному эффекту после тепловой или химической денатурации или после химического или ферментативного гидролиза. Важную информацию можно также получить при помощи других аналитических методов о гетерогенности по мол. массам, химическом составе и размерах молекул — методами ультрацентрифугирования [19, 35], о соответствии (комплементарности) первичной последовательности в двух полинуклеотидах— методами гибридизации [36, 37], о размерах и [c.68]

Необратимая денатурация. В последние годы много внимания было уделено изучению процессов разделения и рекомбинации комплементарных цепей в двухцепочечных полинуклеотидах. Оказалось, что при соответствующих условиях две комплементарные цепи можно полностью разделить. Этот процесс протекает достаточно медленно (в течение нескольких минут) и требует относительно жестких условий он идет хорошо в тех случаях, когда температура или величина отклонения pH от нейтрального значения превышают значения, соответствующие точкам обратимого перехода (см. фиг. 55). Процесс, обратный денатурации рекомбинация двух цепей), может быть осуществлен только при соблюдении некоторых, перечисленных ниже условий. [c.152]

Рис. 4.16. Изменение оптической плотности при 260 ммк в процессе денатурации двухспиральных полинуклеотидов

Некоторые физические свойства ДНК в растворе плавно меняются при небольших изменениях внешних условий. Эти изменения не связаны ни с разрывом водородных связей, ни с другими сопряженными с денатурацией спирали явлениями. Они отражают скорее всего сдвиг равновесной конформации двойной спирали внутри данного структурного семейства при изменениях концентрации соли или температуры. Для некоторых регулярных последовательностей, таких, как синтетические полинуклеотиды, содержащие только с1А в одной цепи и только с1Т — в другой, определенные структуры оказываются более предпочтительными. Возможно, наличие таких последовательностей в природных ДНК приводит к локальным изменениям структуры. Это могло бы объяснить, как белки, связывающиеся с ДНК, узнают определенные участки двойной спирали без разделения цепей, необходимого для взаимодействия с основаниями. [c.176]

Интенсивное изучение биологических катализаторов дало возможность составить целостное представление об этих, по сути, наиболее важньгх структурах живой материй. В частности, было установлено, что все ферменты являются макромолекулами белковой природы. (Каталитическая активность специфичных полинуклеотидов, принимающих участие в сплайсинге РНК, является исключением, подтверждающим общее правило.) Первостепенное значение для функций ферментов имеет первичная структура, определяющая тип катализируемых реакций. Гидролиз пептидных связей трипсином или пепсином необратимо инактивирует ферменты. Для проявления каталитического действия большое значение имеет также нативность высших белковых структур (гл. 3). Обратимая денатурация является фактором подавления или восстановления ферментативной активности. Физико-химические свойства ферментов соответствуют таковым для белков, причем заряд играет существенное значение для каталитического акта. Молекулярные массы ферментов лежат в пределах от 10 до 1000 kDa и более, т. е. в большинстве случаев фермент по размерам гораздо больше, чем субстрат. [c.61]

Так же как и двухцепочечные полинуклеотиды, одноцепочечные молекулы могут денатурировать с разрушением вторичной и третичной структур. Денатурация наблюдается при повышении температуры, понижении ионной силы или добавлении в среду дена-турирующих агентов — мочевины, органических растворителей и т. д. [c.344]

Скорость реакции формальдегида с полинуклеотидами в большой степени зависит от вторичной структуры полимера реакция очень сильно замедляется или практически не протекает с двухцепочечными комплексами полинуклеотидов, стабилизованными водородными связями Ч Поэтому обработка формальдегидом широко используется в исследованиях вторичной структуры полинуклеотидов (см. гл. 4). Эта реакция была применена для изучения вторичной структуры полиадениловой и полицитидиловой кислот, а также для определения размеров и стабильности двухспиральных участков (см. также Денатурированная ДНК быстро реагирует с формальдегидом, причем продукт реакции теряет способность к ренатурации 4. Нативная ДНК, напротив, реагирует с формальдегидом крайне медленно анализ кинетики реакции показывает, что реакция начинается на дефектном участке двухспиральной структуры и концентрацию таких участков можно определить . Частичную денатурацию ДНК по специфическим участкам при действии формальдегида можно наблюдать под электронным микроскопом Модификация полинуклеотидов формальдегидом была применена и для некоторых функциональных исследований, в частности для изучения инактивации тРНК и для исследования изменения кодирующей способности полиадениловой кислоты в бесклеточной системе [c.412]

Данные о расщеплении имидазольного цикла пуринов в составе ДНК, РНК и полинуклеотидов весьма немногочисленны. Отмечено, что при pH, близких к нейтральному, остатки 7-алкил-гуанина в составе алкилированных РНК и ДНК не претерпевают (в отличие от соответствующих нуклеозидов) раскрытия имидазольного цикла. С остатками 7-N--(HO H2 H2S H2 H2)-гуанина в составе ДНК эта реакция идет с заметной скоростью лишь при pH 10, когда происходит денатурация ДНК При жесткой щелочной обработке ДНК (нагревание с 1 н. NaOH при 100 °С) из обычных пуриновых оснований расщепление имидазольного цикла претерпевают, по-видимому, лишь остатки аденина [c.442]

Хорошо известно (см., например, [8—11]), что молекулы биополимеров в растворе могут обладать различными конформациями в зависимости от температуры, состава растворителя, концентрации водородных и других ионов в нем. Так, молекулы ДНК и синтетических полинуклеотидов в растворе могут либо иметь структуру двойной спирали, стабилизуемой внутримолекулярными водородными связями и силами ван-дер-ваальсового взаимодействия (диполь-дипольными и дисперсионными), действующими между гидрофобными группами, либо находиться в конформации статистического клубка, в которой отсутствует упорядоченная система внутримолекулярных водородных связей. Синтетические полипептиды, в том числе полипептиды, несущие ионизуемые группы, как например поли-Ь-глутаминовая кислота, поли-Ь-ли-зин, также могут находиться либо в стабилизуемой внутримолекулярными водородными связями и ван-дер-ваальсовыми силами спиральной конформации, либо в конформации клубка. Глобулярные белки обладают компактной структурой, стабилизованной гидрофобными взаимодействиями и характеризующейся в ряде случаев наличием спиральных областей при денатурации компактная структура разрыхляется, спиральные области разрушаются. [c.19]

Еще одним доказательством комплементарной природы РНК, полученной на данной ДНК-затравке, служит образование специфического комплекса при нагревании с последующим охлаждением смеси ДНК-затравки и РНК-продукта. При эквимолекулярных соотношениях два полинуклеотида образуют гибридные комплексы, причем ренатурация ДНК исключается благодаря большей стабильности гибрида. Образование гибрида специфично для ДНК-затравки и не происходит с другими дезоксинуклеиновыми кислотами, даже если они обладают сходным нуклеотидным составом. Следовательно, средний нуклеотидный состав, анализ ближайшего соседа и полная комплементарность последовательности — все говорит о доминирующей роли последовательности нуклеотидов в затравочной ДНК в определении природы ферментативно синтезированной РНК- При использовании определенной бактериальной системы Mi ro o us lysodeikti us) не было обнаружено, чтобы матрица и продукт образовывали промежуточные соединения, гибриды (в отличие от ДНК-полимеразы). Далее, после ферментативного синтеза РНК не происходит изменений в плотности матрицы и денатурации (разделении нитей) ДНК- Следовательно, либо двухспиральная ДНК действует как матрица, не раскручиваясь, либо механизм заключается в том, что функционируют небольшие одноцепочечные олигонуклеотидные участки, непосредственно прилега- [c.319]

Результаты изучения скорости реакции формальдегида с аминогруппами полинуклеотида при различных температурах [238, 325[ позволяют выявить структуры, связанные водородными связями. Формальдегид в мягких условиях не влияет на структуру нативной ДНК благодаря наличию в ней прочных водородных связей [325]. Аналогичным образом РНК из ВТМ при 25° реагирует с формальдегидом очень медленно. Однако при 45° скорость реакции возрастает в 19 раз, т. е. аминогруппы становятся вполне доступными. Изучение кинетики этой реакции показало, что действие формальдегида на полинуклеотиды протекает в две стадии сначала денатурация, а затем уже реакция со свободными аминогруппами [326[. В соответствии с этим температура плавления полиинозиновой кислоты в 1%-ном растворе формальдегида понижена примерно на 18°. (Помимо чисто физических эффектов, атака формальдегидом атома N1 пуринового кольца может уменьшить стабильность структуры с такой атаки, по-видимому, начинается реакция формальдегида с остатками аденина.) Результаты, полученные с РНК из ВТМ, показали, что она содержит спирализованные участки, в которых основания связаны водородными связями, количество таких [c.610]

Полное разрущение нативной ДНК до нуклеозидов или мононуклеотидов может приводить к увеличению оптического поглощения при 260 м 1 на 60—70%. В меньщей степени уменьшение оптического поглощения по сравнению с мономерными компонентами характерно для всех полинуклеотидов (включая апуриновые и апиримидиновые кислоты [369]) и олигонуклеотидов. В различные периоды гиперхромный эффект, проявляющийся при разрушении полинуклеотидов, приписывали главным образом остаткам гуаниловой кислоты [370], гуаниновым и цитидиновым остаткам [371[ и полипуриновым фрагментам [372[. Разрушение упорядоченной образованной водородными связями структуры сопровождается большим гиперхромным эффектом, но даже после полной денатурации остаточный гиперхромизм составляет 10—20%. Этот эффект соответствует гипохромизму олигонуклеотидов, на который мало влияют ионная сила или температура и для которого не характерны необратимые изменения при обычных условиях денатурации. Как было показано при изучении синтетических олигонуклеотидов, этот остаточный гипохромизм не связан с образованием водородных связей (см. стр. 496). [c.631]

Следует еще сказать, что если мы хотим оценить свободную энергию полинуклеотида, то непременно должна быть учтена конфигурационная энтропия. В принципе ее можно рассчитать, используя потенциальные функции, как это делал Флори для полипептидов, с той лишь разницей, что интегрирование придется вести не в двумерном, а в шестимерном пространстве. Большая роль конфигурационной энтропии следует из того, что при создании жесткой стопкообразной конформации вращение вокруг одинарных связей резко ограничивается. Во всяком случае именно конфигурационная энтропия песет основную ответственность за разность свободных энергий двухтяжевых полинуклеотидов (в которых внутреннее вращение вокруг 10 связей практически полностью заторможено) и однотяжевых полинуклеотидов, образующихся в результате денатурации. [c.411]

Интересно, что стэкинг-взаимодействия в полинуклеотидах практически аддитивны. Это означает, что энергия взаимодействия, скажем, 10 оснований, расположенных стопкообразно, примерно в девять раз больше энергии взаимодействия пары оснований в динуклеозидфосфате. Приближенная аддитивность для оли-гоаденилатов видна из следующих данных по тепловой денатурации (в 0,1 М 1 аС1, pH 7,4) [44] [c.414]

В настоящее время метод измерения оптического вращения широко используется при изучении переходов спираль — клубок в полинуклеотидах и нуклеиновых кислотах, вызванных изменением температуры [107, ПО] или состава смешанного растворителя [112—114]. Рис. 62а и 626 иллюстрируют изменения удельного оптического вращения [и1в ДНК тимуса теленка и сополимера адениловой и уридиловой кислот [поли-(А + У) 1 при изменении температуры. На этих рисунках для сравнения приведены гиперхромные эффекты при денатурации измерение этих эффектов является одним из наиболее чувствительных методов обнаружения конформационного перехода. Характер кривой зависимости а]ц от температуры для ДНК имеет две особенности, отличающие эту кривую от кривой, полученной для синтетических полинуклеотидов. Наличие на кривой впадины (соответствующей увеличению декстровращения) в области температур 30—80° свидетельствует о тонких изменениях конформации молекулы ДНК- Другой вопрос заключается в величине декстровращения ДНК, которая намного меньше, чем соответствующая величина для двутяжной спирали поли-(А Ь У). Причина этого до сих пор не выяснена. [c.119]

Активность молекул ДНК в бактериальной трансформации (гл. VH) дает возможность исследовать денатурацию двойной спирали с помощью биологического метода. Для этого раствор трансформирующей ДНК, выделенной из генетически маркированного донорного штамма D. pneumoniae, медленно нагревают до все более высокой температуры. Из такого раствора время от времени берут образцы, которые быстро охлаждают в ледяной бане. Затем эти образцы добавляют к культуре рецнпиентного штамма пневмококка, отличающегося генетически от донорного штамма, и учитывают число трансформированных клеток, получивших аллели донора. С помощью такого опыта было показано, что трансформирующая активность пневмококков при достижении точки плавления ДНК (86 °С) резко падает. В ходе таких опытов по тепловой денатурации с использованием меченной трансформирующей ДНК было показано, что потеря трансформирующей активности, наблюдаемая при плавлении ДНК, объясняется неспособностью реципиента поглощать одноцепочечные полинуклеотиды. [c.180]

А. Денатурация и ренатурация линейной молекулы ДНК с повторяющимися концами. но без циклических перестановок. При тепловой денатурации набора таких молекул ДНК возникают одноцепочечные полинуклеотиды. При отжиге они рена-турируют, образуя преимущественно линейные молекулы ДНК исходной длины. Однако в редких случаях при ренатурации могут образовываться кольцевые молекулы. 3 то происходит за счет первоначального спаривания между короткими повторяющимися отрезками на концах молекул. [c.296]

Б. Денатурация и ренатурация линейных молекул ДНК с повторяющимися концами и с циклическими перестановками. В этом случае одноцепочечные полинуклеотиды, образовавшиеся при денатурации, при отжиге могут реассоциировать многими разными спосабами, часто с образованием кольцевых молекул. [c.296]

Термодинамика плавления природных ДНК значительно сложнее термодинамики плавления модельных олигонуклеотидов, поэтому кинетика денатурации и ренатурации ДНК также должна быть более сложной. Действительно, некоторые аспекты этого процесса до сих пор не вполне понятны, хотя в течение пятнадцати последних лет в этой области ведутся интенсивные исследования. Представление об основных трудностях, которые встречаются при анализе этого процесса, дает рис. 23.14. В случае коротких олигомеров для описания большинства наблюдаемых результатов достаточно учесть лишь нуклеа-цию и рост спиральной области. При анализе денатурации ДНК следует принять во внимание образование и слияние петель, происходящее из-за крупномасштабной гетерогенности по нуклеотидному составу. Плавление коротких олигомеров полностью обратимо, чего нельзя сказать о модельных полинуклеотидах. Изменение их оптических свойств при плавлении действительно обратимо, для гидродинамических же свойств наблюдается гистерезис,(гл. 22) [c.341]

Наряду с ферментативным дидезокси-методом широкое распространение получил метод секвенирования ДНК, разработанный А. Мак-самом и В. Гилбертом в 1976 г Метод применим к одно- или двухцепочечным фрагментам ДНК. Изз аемый полинуклеотид подвергают специфической химической фрагментации. Для того чтобы иметь точку отсчета, фрагмент ДНК метят радиоактивным изотопом 32р по 5 - или З -концу. Чаще всего метку включают в 5 -концы с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4, которая в реакции обмена переносит радиоактивный фосфат с [у-32р] АТР на ДНК. У двухцепочечного фрагмента ДНК в такой реакции метятся обе антипараллельные цепи. Субстраты, меченные только по одному концу, при этом могут быть получены или после денатурации [c.38]