Фракционирование гель-проникающая

Установлено, что уширяющий эффект в гель-проникаю-щей хроматографии и термическое разложение в процессе фракционирования оказывают незначительное влияние на определение. [c.203]

Основополагающим в механизме фракционирования является то, что самые большие макромолекулы растворенного вещества не способны проникать внутрь пор гранул сшитого геля и поэтому элюируются первыми (время их удерживания является наименьшим). Меньшие макромолекулы задерживаются внутри пор гранул геля, вследствие чего требуется больше времени для их вымывания (время их удерживания больше). [c.56]

Детальное обсуждение достоинств различных методов, используемых для фракционирования полимеров, выходит за рамки данной книги. Большинство этих методов достаточно сложно и требует длительного времени, причем число получаемых при разделении фракций в значительной степени зависит от продолжительности фракционирования. Следует различать препаративное фракционирование, когда осу-щ,ествляется разделение полимера на фракции с последующим определением молекулярной массы каждой фракции, и аналитическое фракционирование, при котором определяется молекулярно-массовое распределение без выделения каждой отдельной фракции. В первой группе методов следует упомянуть новую быструю методику фракционирования с помощью гель-проникающей хроматографии. В этом методе разделения используется хроматографическая колонка, в которой в качестве стационарной фазы применяют пористый набухший полимер сетчатого строения. По мере прохождения полимерного раствора по колонке молекулы полимера диффундируют через гель в соответствии с их размерами. Молекулы небольшой длины глубоко проникают в гель, и, следовательно, для их прохождения через колонку тре- [c.239]

Если компоненты смеси незначительно различаются по молекулярному весу, их объемы выхода с колонки также очень близки. Поскольку рабочий объем колонки составляет определенную долю общего объема геля (см. стр. ПО, 111), то совершенно очевидно, что при прочих равных условиях разделение будет тем лучше, чем длиннее колонка. Конечно, пористость геля должна быть оптимальной для данного случая. Области применения различных гелей указаны в табл. 5, 8—10 и 15. Желательно использовать такой гель, чтобы в его гранулы совсем не мог проникать только один из компонентов исследуемой смеси. Если компоненты сильно различаются по молекулярному весу, то целесообразно проводить предварительное фракционирование на геле средней пористости. Затем низкомолекулярную и высокомолекулярную фракции можно хроматографировать повторно на соответствующих гелях. [c.150]

В литературе описаны попытки использования сефадексов и биогелей, представляющих собой соответственно сшитый декстран и гранулированный полиакриламидный гель, для разделения компонентов нуклеиновых кислот за счет различного сродства их молекул к сорбенту [32, 33]. Однако в основном гель-хроматографию применяют для фракционирования нуклеиновых кислот и их компонентов в соответствии с размерами молекул этих соединений. Например, на колонке с сефадексом 0-10 нуклеозиды и нуклеотиды отделяются от неорганических солей (выходят со свободным объемом колонки) [34]. Аналогичным образом олигонуклеотиды, содержащие больше 10—15 нуклеотидных остатков, не задерживаются на сефадексе 0-25 или 0-50, а мононуклеотиды проникают в поры геля и поэтому элюируются значительно медленнее [3]. Именно этот метод широко используют для удаления избытка нуклеозидтрифосфатов из смеси биосинтетических олиго- и полинуклеотидов [35]. [c.167]

В последнее время наиболее тщательное фракционирование полимеров удается осуш,ествить методом гель-фильтрации. При проведении гель-фильтрации разбавленный раствор исследуемого полимера заливают в высокие колонки, заполненные предварительно набухшим в том же растворителе сетчатым полимером (гелем) с различной плотностью полимерной сетки. Исследуемый полимер диффундирует вместе с растворителем внутрь набухшего геля. Чем ниже молекулярный вес фракции, тем в более узкие микроканалы она проникает. Одновременно из микроканалов большего диаметра низкомолекулярные фракции вытесняются более высокомолекулярными. После установления равновесного распределения полимера в набухшем геле его смывают растворителем. Первые дозы фильтрата содержат наиболее высокомолекулярные фракции полимера, для которых микроканалы геля оказались слишком малыми, последующие дозы растворителя вымывают полимер все более низкого молекулярного веса. [c.62]

Разделение асфальтенов с помощью гель-фильтрацйи было исследовано Альтгельтом [83]. Согласно разработанному им методу, бензольный раствор асфальтенов пропускался через медленно вращающуюся хроматографическую колонку, плотно заполненную полистирольным гелем. Для подавления адсорбции асфальтенов к гелю в бензольный раствор добавлялось 10% метанола. Гель получался сополимеризацией стирола, ди-винилбензола, винилэтилбензола, диэтилбензола в присутствии додекана, количеством которого регулировался размер пор в геле. Фракции, в которых размеры молекул позволяли проникнуть внутрь пор геля, двигались вдоль колонки с меньшей скоростью, чем молекулы, не способные проникать в поры. Так как желательно было собрать самые высокомолекулярные фракции, то в нижней части колонки помещался гель с меньшим размером пор, а в верхней — гель с большим размером пор. Альтгельт установил, что молекулярные массы асфальтенов могут составлять 700, а мальтенов 2400. Последующими исследованиями [79] было показано, что при фракционировании гель-фильтрацией получаются фракции асфальтенов, имеющие молекулярные массы от 500 до 4040. Такое перекрывание наглядно иллюстрирует невозможность разделения асфальтенов на фракции только с помощью осаждения растворителями из-за конкурирующего влияния молекулярной массы и химического состава. [c.32]

Разделение в ЭХ основано на различии в дайне пути, который проходят в колонке молекулы разного размера. Заполнитель колонки (гель) имеет поры определенного размера. Если в разделяемом образце есть молекулы, размеры которых не позволяют им проникать в поры геля, эти молекулы проходят с потоком элюента только между частицами геля и выходят из колонки. Молекулы небольшого размера могут прошкать во все поры геля, путь их удлиняется, и они задерживаются в колонке большее время. И наконец, молекулы средних размеров проникают только в некоторые поры, иугь их оказьшается средним по длине, и они выходят из колонки между крупными молекулами, полностью исключающимися из пор геля, и молек лами, полностью проникающими в них. Область между исключением и . лолньш проницанием составляет область фракционирования геля, т. е. определяет те границы размеров молекул, которые могут подвергаться разделению на данном геле. Таким образом, одна из отличительных особенностей ЭХ - большие молекулы элюируются из колонки раньше, чем молекулы меньшего размера. Основным параметром, характеризующим разделение в ЭХ, является обьем элюирования или объем удерживания. В других методах ЖХ компоненты образца задерживаются в колонке и элюируются после неудерживаемого пика растворителя, т. е. объем элюирования компонентов образца больше объема подвижной фазы в колонке. В ЭХ компоненты образца частично (или полностью) исключаются из геля (заполнение колонки) и элюируются перед пиком растворителя, т, е. объем элюирования образца меньше объема подвижной фазы в колонке в этом другая особенность ЭХ. [c.72]

Нейтрализованные гумусовые кислоты растворяли в 2М растворе хлористого натрия и пробы, содержащие 3,33 мг/мл каждого образца, разделяли на колонке с сефадексом дистиллированной водой. Разделение проводили на колонках длиной 32 см (сефадекс G-25), 42 см (сефадекс G-50) и 52 см (сефадекс G-100), диаметр колонки во всех случаях равнялся 4,1 см [30]. Во всех случаях достигали разделения на две основные фракции а и б, окрашенные в коричневый цвет. На сефадексе G-25 выделяли третью фракцию, меньшую по размерам, желтовато-коричневого цвета. Фракции а и б после повторного разделения исходной пробы упаривали до 20—30 мл при температуре ниже 45 °С. Фракции подкисляли 0,2— 0,3 мл 5 н. раствора НС1, после чего проводили центрифугирование. Осадки отмывали дваз сды порциями по 10 мл 0,1 н. НС1. Гумусовые кислоты высушивали под вакуумом и хранили при, комнатной температуре. Пробы высушенных и измельченных гумусовых фракций растворяли в NaOH, растворы доводили до рН=7,0 и записывали спектры поглощения. Коэффициенты экстинкции рассчитывали для растворов с концентрацией 1,0 мг/мл и по ним получали информацию о молекулярной массе. Аналогичные исследования, в ходе которых в качестве элюента использовали растворы солей, проведены также в работах [35—38]. Хотя гель-проника-ющая хроматография на сефадексах и других типах гелей широко используется для фракционирования и характеристики сложных природных полимеров, необходима разработка более эффективных систем фракционирования гумусовых кислот, чтобы достаточно глубоко изучить свойства гумусовых кислот и фульвоколлоидов в почве. [c.279]

Проблема анализа распределения компонентов остатков по размерам приобрела большое значение сравнительно недавно и в основном связана с развитием процессов их каталитического гидрооблагораживашм. Возможность получать какие-то определенные результаты появилась после разработки метода гель-хроматографического разделения. Метод этот — гель-проникающая хроматография (ГПХ) — впервые нашел широкое применение в биохимии и химии полимеров [31]. При ГПХ разделение органических веществ осуществляется совсем на иных принципах, чем при других хроматографических методах. Принцип метода заключается в том, что во время прохождения раствора исследуемого вещества через колонку, заполненную частицами твердого геля, происходит разделение молекул этого вещества за счет различной способности их проникать в поры геля. Поры в частице геля имеют различный размер. Молекулы образца также различаются по величине. Некоторые молекулы слшиком велики, чтобы войти даже в самые крупные поры, и исключаются из частицы геля. Поэтому они двигаются через слой геля между его частицами и первыми выходят из колонки. Другие молекулы так малы, что входят во все поры геля, полностью проникая в частицу. Эти соединения задерживаются в наибольшей степени и появляются на хроматограмме последними. Молекулы промежуточных размеров могут входить только в некоторые поры и двигаются по колонке со средней скоростью. При разделении смеси с ширркой областью молекулярных масс используют набор гелей с разными пределами исключения. Это позволяет расширить область фракционирования колонки. Использование различных гелей дает эффект только при последовательном соединении колонок с разными гелями. При разделении соединений, мало различающихся по размеру, используют гели с узкой областью [c.36]

Раствор, содержащий смесь двух и более веществ, отличающихся по размеру молекул, а следовательно, и по молекулярной массе, вносят в колонку, заполненную гелем с сетчатой структурой и уравновешенную буферным раствором. Наибольшей скоростью продвижения по колонке обладают компоненты раствора, размеры молекул которых больше пор геля. Такие компоненты не проникают в гранулы гелевой фазы и выходят из колонки первыми. Более мелкие молекулы, способные проникать внутрь геля, непрерывно обмениваются между жидкими фазами внутри и вне геля и продвигаются по колонке значительно медленнее. Находящиеся в растворе самые маленькие частицы (например, неорганические соли) выходят из колонки последними. На этом принципе основаны методы фракционирования белков и других полимеров, их обессо-ливание, определение молекулярной массы, замена одних буферных растворов другими и др. [c.106]

Разновидностью метода фракционирования на колонке является гель-хроматография [86]. В качестве разделительного вещества применяют органические или неорганические вещества (например, силикагель) пористой структуры с размером пор, зависящим от плотности сшивок и условий получения. Для фракционирования полимеров, растворимых в воде, чаще всего применяют набухший в воде декстран с различной степенью сшивания (сефадекс). Для растворов полимеров в органических растворителях применяют сшитые полистиролы или сополимеры метилметакрилата с этилен-гликольдиметакрилатом. Образец полимера растворяют, заливают в колонку и элюируют, используя тот же самый растворитель. Небольшие молекулы полимера свободно диффундируют внутрь геля. Размеры некоторых молекул оказываются настолько большими, что им не удается проникнуть внутрь пор, в результате чего они первыми выходят из колонки при элюировании. Продолжительность элюирования фракций возрастает с уменьшением размера макромолекул. Существует критическое значение молекулярной массы, ниже которого макромолекулы полимера могут проникать в поры сетки и поэтому могут быть разделены. Молекулы большего размера уже не могут быть разделены, так как они не могут диффундировать в гель. Частота сетки геля и критическое значение молекулярной массы связаны между собой простой зависимостью чем чаще сетка, тем меньше критическое значение молекулярной массы. [c.83]

Эффективность гель-хроматографического фракционирования определяется не только природой геля, но и геометрией колонки. Полный внутренний объем пор геля Vi определяется количеством сухой смолы и ее способностью к набуханию, которая, в свою очередь, зависит от элюирующего растворителя. Общий объем геля Уг складывается из собственного объема гелевого скелета Vg, внутреннего объема пор геля и свободного объема Уо между частицами геля. Для макромолекул с молекулярной массой выше критической элюирующий объем Уе равен свободному объему Уо, поскольку макромолекулы такого размера не проникают в поры геля и проходят через колонку без задержки, что позволяет легко определить Уо- Молекулы, размер которых настолько мал, что они могут проникать во все поры, могут находиться как в любой [c.83]

Рис. 172. Метод гель-хроматографии а — схема разделения Ьравннтельно небольшие макромолекулы J, проникая внутрь гранул набухшего геля (, гадерживакяся в них. более крупные частицы 2, не способные проникать в гранулы, проходят между ними), б — фракционирование полистирола (фракция /, =

Метод фракционирования с помощью гельироникающей хроматографии заключается в том, что анализируемая смесь пропускается через пористое инертное вещество, в результате чего большие молекулы не могут проникнуть в поры геля и поэтому элюируются первыми, а малые молекулы проникают в поры и поэтому элюируются позже. [c.29]

Метод фракционирования веществ по размерам молекул на колонках с гранулированными гелями часто называют гелевой фильтрацией . Этот термин подвергался критике, поскольку филь-трация в самом общем виде означает разделение только двух фаз, например, на фильтровальной бумаге [18, 19]. Поскольку в данном случае имеет место хроматографический процесс, представляется логичным использовать в названии метода слово хроматография . Однако, к сожалению, этот термин непроизвольно ассоциируется с адсорбционной хроматографией на силикагеле и окиси алюминия [20, 21]. Термин эксклюзионная хроматография [22] обладает тем недостатком, что в этом случае постулируется еще недоказанный механизм процесса, заключающийся в различной способности веществ в соответствии с размерами молекул проникать в гранулы геля. Крупные молекулы вообще не проникают в набухшие гранулы. Аналогичные недостатки свойственны терминам диффузионная хроматография [23] и гельпроникающая хроматография [18]. [c.237]

Гель-проникающая хроматография [39] является разновидностью метода фракционирования на колонке, в которой разделение на фракции осуществляется по методу молекулярного сита, основанному на способности молекул проникать в поры адсорбента определенного размера. В качестве адсорбентов в данном методе используют материалы, не имеющие зарядов и ионогенных групп, обладающие точно заданным размером пор (см. гл. 18). Наилучшим образом этим требованиям удовлетворяют специально приготовленные сополимеры стирола с дивинилбензолом, которые при набухании образуют гели. Отсюда и название метода. Кроме того, применяют гели декстрана (сефадекс), разновидности силикагелей (сферосил) и др. [c.296]

Пористые материалы широко используются для фракционирования смесей по молекулярному весу компонентов. Примером тому служит ультрафильтрация — продавливание раствора через мембрану, способную пропускать лишь молекулы небольших размеров и препятствующую фильтрации макромолекул. Аналогичный принцип был использован при электроосмотической миграции веществ через гели [18]. Противоположное явление — прохождение молекул больших размеров и удерживание молекул меньших размеров ( обратные сита ) — наблюдалось при фильтрации растворов электролитов через колонку, содержащую ионообменную смолу. Это явление основано на способности ионов малых размеров проникать в сетчатую структуру ионита и сорбироваться там в то время, когда ионы больших размеров проходят через колонку без задержки. Применение сильносшитых малопористых смол позволяет отделять ионы металлов от органических оснований. На несколько более набухающих смолах осуществимо разделение высокомолекулярных и низкомолекулярных полипептидов, на сильнонабухающих ионообменных смолах достигается разделение белков по молекулярным весам [19]. [c.201]

Принцип гель-хроматографирования (гель-фильтрации), описанный Олтгелтом и Муром [20], заключается в следующем. Колонка заполняется студнеобразными частицами набухшего в растворителе сшитого полимера, содержащего поры с определенным набором по размерам. Образец полимера, подлежащий фракционированию по молекулярному весу, заливают в виде раствора в колонку и элюируют тем же растворителем. В зависимости от размеров макромолекулы проникают в соответствующие поры студня. Очень крупные молекулы остаются в промежутках между частицами студня и извлекаются с первыми порциями растворителя. Чем меньше размер молекул, тем при большем объеме элюирующей жидкости они будут извлечены из пор студня. [c.239]

Синге и Тизелиус [15] впервые наблюдали эффект молекулярного сита в гелях при фракционировании продуктов гидролиза амилозы в агар-агаровом геле. Для детального исследования механизма молекулярного сита Лейт и Ратвен [16] использовали зерна крахмала. Они нашли, что белки не проникают в обычный гидратированный [c.218]

Теория и методология гель-хроматографии подробно обсуждается в ряде обзоров и книг Г1—9]. Этот метод позволяет разделять белки в соответствии с размерами их молекул. Первыми с колонки элюнруются самые большие молекулы, в то время как молекулы меньшего размера, способные диффундировать в поры матрицы, заполненные жидкой фазой, удерживаются на колонке. Размер пор матрицы геля определяет диапазон молекулярных масс макромолекул, способных проникать в частицы геля и выходить из них. Для фракционирования белков пригодны различные полиакриламидные, агарозные и декстрановые гели. [c.106]

Рис. 4-46. Три типа матриксов, используемых для хроматографии. При ионообменной хроматографии (А) нерастворимый матрикс содержит ионы, задерживающие молекулы с противоположным зарядом. Для разделения молекул используются следующие матриксы диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ-целлюлоза) - заряжена положительно карбоксиметилцеллюлоза (КМ-целлюлоза) и фосфоцеллюлоза - заряжены отрицательно. Силы взаимодействия между молекулами в растворе и ионообменником определяются ионной силой и pH элюирующего раствора, которые для достижения эффективного разделения можно варьировать определенным образом (как на рис. 4-47). При хроматографии по методу гель-фильтрапии (Б) матрикс инертен, но содержит поры. Низкомолекулярные соединения проникают внутрь частиц матрикса. Оказавшись при этом в относительно большем объеме, они проходят через колонку медленнее. В качестве матрикса можно использовать зерна поперечно-сшитого полисахарида (декстран или агароза). Поскольку в продаже имеются полисахариды с самым различным размером пор, их можно использовать для фракционирования молекул с молекулярной массой от 500 до 5 х 10 дальтон. При аффинной хроматографии (В) используется нерастворимый матрикс, ковалентно связанный со специфичными лигандами (антителами или субстратом ферментов), которые присоединяют определенный белок. Связываемые иммобилизованным субстратом молекулы фермента можно элюировать концентрированными растворами субстрата в свободной форме, а молекулы, связанные с иммобилизованными антителами, можно элюировать за счет диссоциации комплекса антитело антиген концентрированными растворами соли или растворами низкого или высокого pH. Однократная хроматография на такой колонке позволяет

Рис. 172. Метод гель-хроматографии а — схема разделения ( сравнительно небольшие макромолекулы J, про-никвя внутрь гранул набухшего геля , гадерживаются в них, более крупные частицы 2, не способные проникать в гранулы, проходят между ними), б — фракционирование полистирола (фракция I, = = 267 ООО, Л1 /М = 08, фракция И М =82 ООО, М /М =1,05) / — скорость элюирования 26,4 мл/ч 2 — скорость элюирования

В продаже имеется значительный выбор матриксов р=вличных типов (рис. 4-46). Ионообменные тлонки набиты маленькими шпиками, з яженными положительно или отрицательно. При использовании таких колонок фракционирование белков происходит в соответствии с расположением з адов на поверхности белковых молекул. Гидрофобные колонки наполнены шариками, из которых выступают гидрофобные цепи, в таких колонках задерживаются бежи с обнаженными гидрофобными участками. Колонки, предназначенные для гель-фильтрации, заполнены крошечными пористыми шариками, при использовании таких колонок происходит разделение бежов по размерам Молекулы небольшого размера по мере прохождения через колонку проникают внзпр1Ь шпиков, а более крупные молекулы остаются в промежутках между шариками. В результате они быстрее проходят через колонку и выходят из нее первыми. Гель-фильтрация обычно используется и для разделения молекул, и для определения их р меров. [c.212]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология