Белки, определение молекулярной массы гель-электрофорезом

Рис. 12.30. Графическое определение молекулярной массы белков методом электрофореза в полиакриламидном геле в среде додецилсульфата (по данным Вебера с сотр. [105]).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ БЕЛКОВ МЕТОДОМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ В ПРИСУТСТВИИ ДОДЕЦИЛСУЛЬФАТА [c.344]

Определение молекулярной массы белков методом ультрацентрифугирования требует много времени и сложной и дорогостоящей аппаратуры. Поэтому в последние годы разработаны два более простых метода (гель-хроматография и электрофорез). При использовании гель-хроматографии в первую очередь требуется откалибровать колонку. Для этого через колонку с сефадексом пропускают несколько белков с известными молекулярными массами и строят график, откладывая значения логарифмов молекулярной массы против их элюционных объемов, которые находят, как показано на рис. 1.9. [c.45]

При разделении нуклеиновых кислот используют те же методы, что и при фракционировании белков, однако имеются ограничения, обусловленные большим диапазоном величин молекулярной массы (2-10 —Ы0 ° Да), отклонениями от глобулярной формы, различиями в четвертичной структуре (двухнитевые, однонитевые, кольцевые), значительным отрицательным зарядом в нейтральной области pH. Поэтому методы гель-фильтрации и ионообменной хроматографии не получили широкого распространения при фракционировании нуклеиновых кислот и значительно уступают ультрацентрифугированию и электрофоретическому разделению в геле агарозы, полиакриламидном геле или их смеси. Поскольку величина отрицательного заряда нуклеиновых кислот и продуктов их расщепления мало зависит от pH, а отношение заряда к молекулярной массе сохраняется практически неизменным, разделение нуклеиновых кислот при электрофорезе определяется не их зарядом, а размером молекул. При наличии маркеров с известной молекулярной массой возможно определение молекулярной массы препаратов нуклеиновых кислот и их фрагментов. [c.171]

Аминокислотный состав и последовательность аминокислот выяснены для многих тысяч белков. В связи с этим стало возможным вычисление их молекулярной массы химическим путем с высокой точностью. Однако для огромного количества встречающихся в природе белков химическое строение не выяснено, поэтому основными методами определения молекулярной массы все еще остаются физико-химические методы (гравиметрические, осмометрические, вискозиметрические, электрофоретические, оптические и др.). На практике наиболее часто используются методы седиментационного анализа, гель-хроматография и гель-электрофорез. Определение молекулярной массы белков методами седиментационного анализа проводят в ультрацентрифугах , в которых удается создать центробежные ускорения [c.44]

Электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) позволяет снизить до минимума влияние зарядов белков на их подвижность, которая в этих условиях зависит только от размеров молекул. Под действием ДСН третичная и вторичная структуры белков разрушаются. Для определения молекулярной массы очищенных белков, а также мембран, рибосом и т. д. широко используется метод Вебера и Осборна [80]. ДСН высвобождает и солюбилизирует компоненты этих структур, которые невозможно растворить никаким иным способом. В этом методе используется только одна концентрация геля, и график зависимости относительной подвижности (отношение расстояния, пройденного фронтом красителя, к расстоянию, пройденному зоной белка) от логарифма молекулярной массы имеет линейный харак- [c.272]

Для построения калибровочной кривой при определении молекулярных масс используют белки-стандарты тропонин С (18 000 Да), тропонин I (24 000 Да), тропонин Т (38 000 Да), яичный альбумин (42 000 Да) и бычий сывороточный альбумин (68 000 Да), а также стандартный набор для определения молекулярной массы белков. При электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия препарат миозина дает расположенную почти у старта интенсивную полосу тяжелых цепей с м. м. ок. 20 ООО Да и три слабые, но отчетливые полоски легких цепей с м. м. ок. 20 ООО Да для самой тяжелой из них и около 16 000 Да — для самой легкой. Подвижность этих полос в описанных выше условиях высока, поэтому при достаточно большой продолжительности электрофореза эти полоски могут обнаружиться почти у фронта красителя (бромфенолового синего). [c.397]

Известно несколько способов нахождения количества молекул гаптена, пришитых к носителю. Самый простой спектрофотометрический способ заключается в регистрации изменения поглощения раствора конъюгата при определенной длине волны по сравнению с исходным белком-носителем. Можно также рассчитать соотношение компонентов конъюгата из данных по молекулярной массе, полученных электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия или по аминокислотному гидролизу конъюгата. Если конъюгат получили путем пришивки гаптена к аминогруппам белка-носителя, то его состав можно определить по титрованию свободных аминогрупп в исходном белке и конъюгате. Наиболее точный расчет состава конъюгата получается с помощью радиоизотопного метода, в котором используют меченный радиоактивным изотопом гаптен. [c.177]

Заряженные частицы перемещаются в растворе под влиянием электрического поля с различной скоростью. Уже в первой половине нашего столетия для этого явления было введено понятие "электрофорез" или "электрический перенос". Различие скоростей перемещения может быть обусловлено двумя причинами (а) различные молекулы несут на себе различные заряды и поэтому при наложении электрического поля могут ускоряться в различной степени (б) их перемещению препятствует различающееся по величине сопротивление трения. В простейшем случае разделительная среда (раствор электролита) находится в трубке. Из-за отвода Джоулева тепла на практике зачастую наблюдается искажение зон за счет различных плотностей электролита и конвекционных потоков. В случае классического электрофореза применяются гели или полоски бумаги, пропитанные электролитами для того, чтобы уменьшить помехи, вызванные конвекцией, а также чтобы увеличить сопротивление трения макро-молекул с незначительными различиями в зарядах и тем самым усилить эффект разделения. Использование полиакриламидного гель-электрофореза (ПААГ-электрофореза) позволяет проводить эффективное разделение молекул ДНК и белков. Благодаря изменению степени сшивания геля может быть оптимизирована производительность разделения. При использовании гель-электрофореза белков, денатурированных додецилсульфатом натрия (ДДСН), возможно непосредственное определение их молекулярной массы. Разделение в этом случае основано исключительно на затруднении миграции пробы через гель (без геля все денатурированные додецилсульфатом натрия белки перемещаются с одинаковой скоростью). [c.5]

Капиллярный гель-электрофорез Олигонуклеотиды, ДНК, полисахариды, определение молекулярных масс белков [c.364]

Состав гелей для электрофореза в полиакриламидном геле с SDS для определения молекулярной массы пептидов и белков 1105] [c.346]

При использовании диск-электрофореза в полиакриламидном геле для определения молекулярной массы белков также строят график зависимости между логарифмом молекулярной массы калибровочных белков и подвижностью белковых частиц в полиакриламидном геле, а затем, определив подвижность исследуемого белка, по графику находят его массу (рис. 1.11). Электрофорез проводят в присутствии детергента додецилсульфата натрия, так как только в этом случае наблюдается прямая пропорциональная зависимость между молекулярной массой и подвижностью белков. Белки с четвертичной структурой при этих условиях распадаются на субъединицы, поэтому метод находит широкое применение для определения молекулярной массы субъединиц белка. [c.46]

С другой стороны, в результате денатурации белки часто приобретают свойства, значительно улучшающие их электрофоретическое разделение. Этот факт используется в тех методах электрофореза, в которых проводят предварительное восстановление белков и комплексирование их с ДСН. Электрофоретическая миграция таких комплексов зависит от эффекта молекулярного сита, свойственного полиакриламидному гелю, и размеров молекул, что создает основу для весьма простого и эффективного метода определения молекулярной массы белков (подробное описание метода см. в гл. И.2). [c.215]

Обработка электрофореграмм. Определяют расстояние, пройденное каждым белком от стартовой линии. Определение можно проводить визуально или с помощью денситометра при 550—600 нм. Строят калибровочный график, откладывая по оси абсцисс длину пути 1а, пройденного данным белком, а по оси ординат — логарифм его молекулярной массы. Определив длину пути, пройденного белком с неизвестной молекулярной массой 1х, пользуясь калибровочным графиком, определяют молекулярную массу исследуемого белка. При проведении электрофореза в трубочках часто трудно получить хорошо воспроизводимые результаты на разных трубках. В этом случае определяют не абсолютную, а относительную подвижность белков. Для этого определяют отношение длины пробега белковой зоны либо к общей длине геля, либо к длине пробега лидирующего красителя. После этого строят зависимость относительной подвижности белков от логарифма их молекулярной массы. [c.121]

Помимо указанных методов для разделения гистонов и определения их молекулярной массы широко применяют электрофорез в полиакриламидном геле, содержащем ДСН. Следует,, однако, иметь в виду, что при определении молекулярной массы гистонов методом электрофореза в полиакриламидном геле иногда получают ошибочные результаты, если для построения калибровочной кривой используют белки с усредненным аминокислотным составом. Этой опасности можно избежать, приме> нив в качестве маркеров гистоны с известной молекулярной массой [964]. [c.307]

Шапиро и др. [1171] предложили сходную систему для разделения полипептидных цепей белков. В этой системе гель содержит 0,1 М фосфатный буфер (pH 7,1) и 0,1% ДСН. Буфер следует готовить из фосфатов натрия, так как ионы калия дают осадок с ДСН. Перед электрофорезом рекомендуется добавлять 2-меркаптоэтанол или другой восстановитель 5Н-групп. Описанная система с небольшими изменениями была использована многими авторами [119, 120, 456, 679, 1300] для определения молекулярных масс рибосомных белков. [c.311]

Анализ полученных результатов. Как отмечалось в разд. 1.2.1, молекулярные массы полипептидных цепей определяют с помощью градуировочного графика. Однако при электрофорезе в геле с постоянной концентрацией (пористостью) не удается исключить ошибки, обусловленные различием свободной подвижности Уо исследуемого белка и белков-маркеров [148, 149]. Поэтому рекомендуется проводить электрофорез в нескольких гелях различной концентрации. При этом результаты определения молекулярной массы будут тем точнее, чем меньше систематическое отклонение при изменении общей концентрации акриламида. Полученные результаты можно проанализировать с помощью эмпирического уравнения Фергюсона [57] [c.32]

К наиболее распространенным физико-химическим методам определения молекулярной массы белков наряду с седиментационными относятся гель-хроматография (на колонках и в тонком слое), а также электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсуль-фата натрия. Использование этих методов не требует сложной аппаратуры и большого количества исследуемого материала. Получаемые результаты хорошо воспроизводятся и, как правило, коррелируют с данными, полученными другими методами. [c.116]

При использовании электрофореза в ПААГ для определения молекулярной массы белков очень важно соблюдать правильное соотношение между величиной пор геля и размером белковых частиц. Если диаметр частиц будет больше размера пор, то молекулы белка не смогут войти, в гель. Наоборот, если концентрация геля будет невелика и размер его пор будет значительно превышать диаметр белковых молекул, то последние практически не станут задерживаться гранулами ПААГ. [c.258]

Первая стадия опре51 еления строения белка состоит в идентификации и количественном определении составляющих его аминокислот. Для этого требуется образец чистого белка, что само по себе представляет значительную проблему. Чтобы получить чистый образец, обычно применяют комбинацию методов (гл. 3), таких, как гель-электрофорез, ионообменная хроматография и центрифугирование по градиенту плотности (белки с большей молекулярной массой оседают быстрее, чем белки с меньшей молекулярной массой). Когда белок в результате применения этих методов становится однородным или когда достигнут максимум биологической активности, белок считается чистым. Тогда его гидролизуют до составляющих аминокислот горячей соляной кислотой и гидролизат анализируют. [c.267]

Для белков с молекулярной массой менее 12000 определение ее электрофорезом в ПААГ с ДДС-Ка становится ненадежным даже при высокой концентрации геля. В этом случае локальные различия в составе и заряде белков, влияющие на их взаимодействие с ДДС-Ка, уже не усредняются. Степень надежности определения молекулярной массы малых белков и олигопептидов увеличивается, как было указано, при введении в буфер 8М мочевины, а также при увеличении степени сшивки геля. [c.63]

Другим специфическим вопросам, возникающим при сопоставлении хроматографических свойств белков и малых молекул, является вопрос о внутренних стандартах. В хроматографий малых молекул данный вопрос решен достаточно определенно. Хотя некоторые очищенные белки и используются в качестве внутренних стандартов молекулярной массы в гель-хроматографии и при электрофорезе в полиакриламидном геле, они не могут рассматриваться как универсальные стандарты, поскольку предполагается, что молекулы таких белков в нативном состоянии имеют сферическую форму, а в денатурированном — форму полностью развернутой спирали, а применительно к целому ря ду белков, особенно к гликопротеидам, это предположение может оказаться несостоятельным. Таким образом, имеющиеся стандарты применимы не во всех случаях. [c.105]

Методические преимущества электрофореза в полиакриламидном геле навели исследователей на мысль о создании таких его вариантов, которые позволили бы определять молекулярную массу макромолекул и в первую очередь белков, В разд. 1.11.1 пoдpoбiю обсуждался вопрос о том, что при электрофорезе в полиакриламидном геле разделение макромолекул зависит как от их размеров, так и от заряда. Отсюда следует, что для определения молекулярной массы необходимо исключить влияние заряда. Для этой цели разработано множество методов, которые можно разделить на две группы. В методах первой группы для определения молекулярной массы используют коэффициент задержки Д. Зависимость между Кт и молекулярной массой изучена еще недостаточно хорошо, и для ее выражения был предложен целый ряд уравнений [б 12, 1106, 1289, 1296]. Хедрик и Смит [538] построили графики зависимости коэффициентов задержки, определяемых по кривым Фергюсона, от молекулярной массы белков и обнаружили между ними линейную зависимость (рис. 75). Поскольку коэффициент задержки является функцией размера, а не массы молекулы [5, 1186, 1366], некоторые белки ведут себя аномально при электрофорезе, если отличаются от большинства других белков по форме молекулы или парциальному удельному объему. Так, например, полимеры ферритина и альбумина дают соответственно более низкие и более высокие значения Кг, чем можно было бы ожидать, исходя из их молекулярных масс [92, 538]. [c.217]

Пример 11-3. Измерение изменений величины мутантного фермента. Многие методы, применяемые для определения молекулярных масс ферментов, требуют образцов с высокой степенью очистки (например, метод седиментационного равновесия, который будет описан позже) или при использовании не очень чистых образцов дают массы субъединиц (например, ДСН-гель-электрофорез, гл. 9). Использование зональной седиментации позволяет определить молекулярную массу активного фермента непосредственно в неочищенном лизате при применении в качестве метода контроля анализа ферментативной активности. Например, ДНК-полимераза I Е. oli седиментирует при 5 = 5,4. Зоны полимери-зующей и 5 —З -экзонуклеазной активности, связанные с этим белком, седиментируют вместе, поэтому для локализации фермента в градиенте сахарозы можно использовать любую из них. Мутантная форма фермента не обладает полимеразной активностью, однако сохраняет 5 —З -экзонуклеазную. Как следует из рис. 11-26, мутантный фермент обладает значением s = 2,8. Поскольку данная мутация является терминирующей цепь белка, пониженное значение 5 указывает на то, что данный фермент является лишь небольшим фрагментом белка дикого типа и имеет только 0,4% активности. [c.314]

Для определения молекулярной массы применяют также электрофорез в гелях с градиентом пористости [39, 372, 706]. Согласно данным Андерссона и др., [39], при использовании линейного градиента концентрации геля (4—26%) в отсутствие мочевины можно определять молекулярные массы белков от 50 ООО и выше, а в присутствии 8 М мочевины этот предел может быть снижен до 20000. [c.219]

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ БЕЛКОВ С ПОМОЩЬЮ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ В ЛИНЕИНОМ ГРАДИЕНТЕ КОНЦЕНТРАЦИИ Г901 [c.347]

Рис, 79. Калибровочные кривые для определения молекулярных масс белков методом электрофореза в Ю7о-ном (/) и 12,5%-ном (//) полиакриламидном геле, содержащем ДСН [414]. Полимер РНКазы был получен при помощи диэтилпирокарбоната по методу Вольфа и др. [1441]. [c.223]

Определение молекулярной массы проводили методом диск-электрофореза на основании относительной подвижности белков в зависимости от концентрации полиакриламидного геля [Hedri k, Smith, 1968]. Согласно расчетам по таблице, предложенной Г. А. Бузун [1976], масса исследуемых анионных изопероксидаз была одинаковой для вирозных и контрольных изоэнзимов, так как тангенс угла наклона линии регрессии был совершенно одинаков как в опыте, так и в контроле (рис. 20). На рисунке представлена зависимость относительной подвижности анионных изопероксидаз от концентрации акриламида в гелях. Проведенный расчет показывает, что их молекулярная масса равна 45—46 кДа. [c.87]

Электрофорез в градиенте концентрации полиакриламидного геля применяется не только для фракционирования белков, РНК [199] и нуклеопротеидных частиц [295, 876], но также и для определения молекулярной массы белков [39, 706, 1290] и РНК [876]. [c.105]

Все методы, включающие на втором этапе электрофорез в геле с ДСН, дают возможность определять молекулярные массы белков, присутствующих в разделенных зонах. Другой подход к определению молекулярных масс рибосомных белков описали Бикль и его сотрудники [119, 120]. После двухмерного разделения рибосомных белков в системе без ДСН центральную часть каждой зоны вырезают, белки элюируют буферо м, содержащим 6 М мочевину и 1 % ДСН, и подвергают их электрофорезу в геле с ДСН. [c.314]

Молекулярную массу интактного олигомера определяют в неденатурирующих условиях с помощью методов ультрацентрифугирования, гель-фильтрации и электрофореза в градиенте полиакриламидного геля (ПААГ). Устойчивость и растворимость большинства олигомерных белков зависит от ионной силы и pH буферного раствора. В отличие от электрофореза в ПААГ,. где на состав буферных растворов накладываются определенные ограничения, в част1юсти ионная сила не должна превышать 0,1, гель-фильтрацию можно вести в буферных растворах стабилизирующих олигомер (например, в присутствии ионов металлов или кофакторов). Для определения молекулярной массы белков применяют классический вариант гель-фильтрации на сшитых декстранах, полиакриламиде или агарозе. В последнее время получены гели нового типа, позволяющие вести процесс при повышенном давлении, благодаря чему время анализа сокращается с 1—2 сут до 30 мин (гл. 6). [c.17]

Для определения молекулярной массы мономеров используют электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии ДСН и гель-фильтрацию в классическом и современном (ВЭЖХ) вариантах. Предпочитают использовать электрофорез в ПААГ или ВЭЖХ, однако в настоящее время ВЭЖХ уступает электрофорезу по качеству разрешения близких по молекулярной массе белков (гл, 6). Белки, содержащие более 10% углеводов, рекомендуется хроматографировать на агарозных гелях, так как электрофорез может не дать точных результатов из-за различия в связывании ДСН с полипептидной цепью и полисахаридными фрагментами. Следует также напомнить, что мономер может включать несколько полипептид-ных цепей, связанных дисульфидными связями, поэтому определение молекулярной массы следует проводить как до, так и после восстановления 5—5-мостиков. [c.26]

Часто возникает задача определения молекулярных масс белков, которые удалось электрофоретически разделить по величине заряда. В этом случае проводят электрофорез в трубке в присутствии 8 М мочевины, а затем в перпендикулярном направлении в блоке в присутствии ДСН (двумерный электрофорез в геле обсуждается в разд. 7.3,2). [c.44]

Набор стандартных белков разделяют с помощью электрофореза в гелях различной пористости с содержанием поперечных сшивок 5 15%. Выявляют белок, окрашивая его кумасси синим или серебром, и определяют молекулярную массу, сравнивая подвижность белка и стандарта. Особенно широкое применение этот метод нашел при определении молекулярной массы протомера сначала осуществляют денатурацию олигомера (например, кипячением в детергенте в присутствии Р-меркап-тоэтанола), а затем проводят разделение в гелях, содержащих ионный детергент додецилсуль-фат натрия. [c.51]

Для каждого конкретного белка такую зависимость легко получить экспериментально. Удобно, напри ер, в разные карманы одной пластины геля последовательно, через известные промежутки времени, вносить аликвоты раствора исследуемого белка. К моменту прекращения опыта для каждого трека на пластине будет известна продолжительность электрофореза, а расстояние миграции легко измерить. Это можно сделать даже для смеси нескольких белков. Дал е по экспериментальным точкам строят график зависимости у/ от О, имеющий вид прямой линии. Тангенс угла наклона этой прямой —значение коэффициента а в написанном выше уравнении. Ясно, что этот коэффи-цие.нт должен зависеть от молекулярной массы белка чем он крупнее, тем медленнее мигрирует в геле. Оказывается, что соотношение между логарифмами коэффициента а и молекулярной массы белка имеет тоже приблизительно линейный характер в широком интервале молекулярных масс — от 20 до 950 тыс. дальтон. Коэффициенты в этом втором линейном уравнении зависят от выбора буфера. Авторы дают их значения для трех стандартных буферов фосфатного (pH 7,2), Трис-боратно-го (pH 8,2) и Трис-барбитуратного (pH 9,8). Так, для 0,01 М Ыа-фосфатного буфера (pH 7,2) имеет место зависимость lgЛi=l,93 lga- -6,99. Точность определения молекулярной массы невысока — в среднем 20%. Однако важное достоинство метода состоит в возможности оценивать суммарную молекулярную массу белков, состоящих из субъединиц, которые диссоциируют при обработке ДДС-Ыа. Таким образом, комбинируя результаты определения молекулярной массы некоего белка описанным методом с тем, что дает для него же электрофорез с использованием ДДС-Ыа, можно выяснить субъединичное строение белка. [c.76]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология