Антитела иммуноферментный анализ

Рис. 22. Принципиальные схемы гомогенных методов иммуноферментного анализа а—Г — свободный гаптен Е—Г — меченный ферментом гаптен АЬ — антитела 5 н Р — субстрат н продукт ферментативной реакции б — Ag—5 — меченный субстратом антиген Ag — свободный антиген Е — фермент Р — продукт ферментативной реакции символ х — ингибирование ферментативной реакции

Рис. 1.28. Иммуноферментный анализ (твердофазный вариант) а определение неизвестных антител (серодиагностика) б — определение неизвестных антигенов (индикация)

В иммуноферментном анализе используются поли- и моноклональные антитела как по отдельности, так и вместе. Относительная легкость получения поликлональных антител из антисывороток иммунизированных животных в ряде случаев дает возможность пренебречь их гетерогенностью. Однако разработка метода получения моноклональных антител — продуктов гибридных клеток — дала им огромные преимущества в иммунохимическом анализе в связи с уникальными свойствами, выгодно отличающими их от антисывороток. Использование моноклональных антител в иммуноферментном анализе дает возможность работать с практически неограниченным источником антител, однородных по молекулярным и иммунологическим свойствам. С их появлением открылись новые возможности для структурного изучения антигенов. Это связано с тем, что моноклональные антитела, продуцируемые гибридомами, связываются со специфическим участком на поверхности белковой молекулы — антигенной детерминантой и могут быть использованы в качестве селективных зондов на определенные структурные участки. [c.306]

В разделе изложены методы иммунизации животных и гибридизации клеток для получения поликлональных и моноклональных антител, методы получения препаративных количеств антител и их очистки, способы введения ферментных меток в антитела и антигены для использования в иммуноферментном анализе, способы введения радио-изотопных меток в антитела для радиоиммунного анализа, методы изучения антигенных свойств ферментов [c.307]

Взаимодействие двух субпопуляций антител с моновалентным антигеном. Одним из простых приближений при описании реальных систем взаимодействия моновалентного антигена (гаптена) с антителами может быть модель, согласно которой набор популяций антител заменяется двумя —высокоаффинной и низкоаффинной, каждая из которых характеризуется собственной константой комплексообразования — Kt и Кг. Задача определения констант и концентраций каждой из фракций антител перед экспериментаторами возникает ч асто. Знание численных значений этих параметров весьма важно для разработки конкретных наборов для иммуноферментного анализа и выбора схемы проведения имму- [c.47]

Отбор моноклональных антител, связывающихся с различными эпитопами на антигене. Для высокоспецифического выявления ряда антигенов наиболее удобной является сэндвич -модификация твердофазного иммуноферментного анализа. Использование в таком типе анализа двух моноклональных антител, взаимодействующих с разными эпитопами, позволяет сократить время анализа. Кроме того, такие пары моноклональных антител в ряде случаев обладают большей авидностью по сравнению с аффинностью каждого отдельного антитела. Для выявления антител, связывающихся с различными центрами на антигене, обычно используют три метода. [c.173]

Для того чтобы продемонстрировать принцип иммуноферментного анализа, приведем результаты анализа иммуноглобулина, специфичного к вирусу клещевого энцефалита (ВКЭ) в сыворотке крови пациентов. Этот показатель является очень важным как минимум по двум аспектам. Применительно к человеку, укушенному клещом, результат анализа показывает, достаточно ли устойчив человек к энцефалиту. А в случае использования крови здоровых доноров этот показатель свидетельствует о тйм, содержит ли кровь достаточное количество антивирусных антител, для того чтобы быть использованной для приготовления антивирусного иммуноглобулина. Последний может быть использован для введения человеку, укушенному клещом, для предотвращения развития инфекции. Известно, что поверхностный вирусный белок Е является основным антигеном ВКЭ. Этот белок можно достаточно прочно сорбировать на поверхности полистироль-ной пробирки. Если взять его в избытке, достаточном для количественного связывания антител к белку Е в образце, последние будут сорбированы практически полностью. После удаления образца добавляется конъюгат стафилококкового [c.258]

Титр антисыворотки сильно зависит от концентрации антигена, используемого дл я тестирования и от способа его определения. Например, одна и та же сыворотка может иметь титр 100 в тесте иммунопреципитации и 100 000 в тесте иммуноферментного анализа. Поэтому при тестировании сыворотки и определении титра лучше всего применять тот же метод, что и при анализе, а концентрацию антигена выбирать близкую к минимальной в том диапазоне, который выбран для анализа. Кроме того, следует учитывать, что в иммуноферментном анализе используют как гомогенные, так и гетерогенные методы определения концентрации антигена, которые могут сильно отличаться по структуре образующихся иммунных комплексов. В частности, в твердофазных методах вероятность образования циклических комплексов антиген — антитело значительно меньше, чем в гомогенных, а следовательно, и Наблюдаемая аффинность антител в обеих системах будет разная. [c.158]

Антигены, меченные субстратами и кофакторами, также нашли применение в гомогенных методах иммуноферментного анализа. Сущность этих методов (уравнения 6, 7, 8) заключается в том, что при взаимодействии меченого антигена с антителами субстрат становится не доступным для действия фермента, в результате чего продукт ферментативной реакции не накапливается в системе (рис. 22, б) [c.115]

Среди различных направлений разработки иммуноферментного анализа большой интерес представляет создание методов, позволяющих в одном образце проводить одновременное определение нескольких веществ. Например, при диагностике вирусного гепатита важным является одновременное определение нескольких антигенов, что дает возможность определить стадию инфекционного процесса. Использование смеси антител, меченных разными ферментами, — один из путей, который позволяет решить данную проблему. [c.120]

Исключительно важен иммуноферментный анализ при производстве препаратов медицинского назначения, в том числе из животного сырья и донорской крови. Примеси сопутствующих веществ или вирусных антигенов могут оказаться исключительно вредными для организма. Так, например, актуальной является проблема обнаружения в донорской кр.ови, используемой для переливания или получения медицинских препаратов, вируса гепатита В. Наличие белковых примесей в препаратах инсулина, который, как известно, длительно вводится в организм, приводит к выработке антител, в результате чего эффективность его действия резко снижается. Именно поэтому необходим эффективный контроль за наличием примесей, которые не должны превышать 10 %. Иммуноферментный анализ позволяет обеспечить соответствующий контроль качества препаратов инсулина. [c.122]

Кровь, лишенная клеточных элементов, называется плазмой. В плазме содержится фибриноген, приводящий к образованию во всем объеме пробирки сгустка фибрина, который осторожно удаляется центрифугированием при 1000—2000 об/мин в течение 15 мин. Плазма, лишенная фибрина, называется сывороткой. Для удаления белков системы комплемента сыворотку прогревают в течение, 30 мин при 56°С, при этом антитела сохраняют свою активность. Обработку крови и получение сыворотки надо проводить с максимальной осторожностью, избегая разрушения (гемолиза) эритроцитов. Наличие внутриклеточных белков и ферментов в сы-, воротке может приводить к появлению дополнительного фона в некоторых модификациях иммуноферментного анализа. Это замечание касается прежде всего использования антисывороток в гомогенных методах. [c.153]

Необходимым условием для использования антител в иммуноферментном анализе является сохранение их способности специфически взаимодействовать с соответствующими антигенами. [c.22]

Подобного рода проблемы очень часто возникают, например, при разработке методов иммуноферментного анализа лекарственных препаратов, стероидных и белковых гормонов. В зависимости от способа получения антисыворотки антитела могут быть специфичны либо только к одному лекарственному препарату (гап-тену), либо к целой группе близких по структуре химических соединений. В этих случаях распространен способ оценки специфичности, основанный на сравнении связывания антител в данной концентрации (или в определенном разведении иммунной сыворотки) одного и того же количества гомологичного и гетерологичного гаптена. При этом концентрация образовавшегося иммунного комплекса для гомологичного гаптена принимается равной единице, а связывание всех гетерологичных гаптенов оценивается как доля от соответствующего связывания гомологичного гаптена. [c.37]

Созданы и применяются в производстве высокочувствительные диагностические препараты на основе метода ИФА (иммуноферментного анализа), ДНК-зондов, внедрения полимеразной цепной реакции (ПЦР).Используются моноклональные антитела, полученные методом гибридомной технологии. Получены генетически трансформированные кролики с геном асРНК, устойчивые к вирусам лейкоза, а также трансгенные кролики с геном альфа-2 интерферона. Разработана рекомбинантная вакцина против лейкоза крупного рогатого скота на основе оспененного вектора. На культуре клеток нарабатывается антиген и производится диагностика лейкоза крупного рогатого скота. Генно-инженерные вакцины против ящура и сибирской язвы производятся в объемах, обеспечивающих потребности в них России, стран СНГ и ряда других государств мира. [c.428]

Истинные значения констант связывания важны для определения термодинамических характеристик процесса взаимодействия антиген--антитело. Для практических целей, в частности для разработки методов иммуноферментного анализа, достаточно знать эффективные значения, характеризующие свойства используемых антител. [c.41]

Использование твердых носителей для иммобилизации антител с последующим специфическим связыванием определяемого соединения на сорбенте и идентификацией образовавшихся нммунокомплексов с помощью меченных ферментами компонентов лежит в основе методов твердофазного иммуноферментного анализа (метод гетерогенного ИФА). [c.115]

Наиболее простым и чувствительным способом выявления антител, способных одновременно связываться с антигеном, является тест на аддитивность связывания. Предварительная очистка и введение метки в моноклональные тела в этом случае не нужны. В основе метода лежит оцеНка числа антигенных центров, одновременно доступных для пары антител. Определение осуществляется методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. Основным условием при этом является полное насыщение антигена обоими типами антител. Поэтому на первой стадии Эксперимента необходимо получить кривые насыщения антигена аСцитиой или культуральной жидкостью, содержащей анализируемые антитела, и затем определить максимальную оптическую плотность в иммуноферментном тесте, достигаемую при насыщении. [c.174]

Особое распространение получили методы, основанные на использовании антигенов и антител, меченных ферментами, — так называемый иммунофермеитный анализ. Они используются для изучения широкого круга соединений — антител, пептидных и стероидных гормонов, вирусных и бактериальных антигенов, различных белков и ферментов. Существуют гетерогенные (твердофазные) и гомогенные методы иммуноферментного анализа, принципиально различающиеся способом разделения компонентов иммунохимической реакции. Твердофазные методы основаны на применении антител или антигенов, иммобилизованных на нерастворимых носителях. [c.306]

Наиболее простым способом оценки специфичности моноклональных антител в процессе клонирования гибридом является метод непрямого твердофазного иммуноферментного анализа с применением Т8Р-планшетов. ТЗР-планшеты представляют собой полисти-рольные стерильные крышки к 96-луночным культуральным платам, имеющие выступы, опускающиеся в лунки. Поверхность выступов ТЗР-планшетов может быть покрыта в стерильных условиях антигеном. Планшетом накрывают плату, в которой выращивают гибридомы таким образом, чтобы покрытые антигеном выступы опустились в среду культивирования гибридом. Выдерживают 1 ч и заменяют на новый планшет, выступы которого покрыты перекрестно реагирующим антигеном. Дальнейшую обработку ТЗР-крышек проводят в соответствии со стандартной методикой для непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. Используя этот метод, можно в течение одного дня провести оценку способности моноклональных антител взаимодействовать с перекрестно реагирующими антигенами. Это дает возможность уже через 12—15 дней отобрать и клонировать только те гибридомы, которые обладают нужной исследователю специфичностью. [c.172]

Л. а. используют в иммунохим. анализе для определения антител, гормонов, лек. препаратов, вирусных и бактериальных антигенов по концентрации комплекса антиген-антитело. При этом в иммунном флуоресцентном анализе к антителу непосредственно присоединяют флуоресцирующие в-ва, напр. РЗЭ, флуоресцирующие красители (чувствительность метода 10" моль/л), а в иммуноферментном анализе к антителу присоединяют фермент и в результате ферментативной р-ции, сопровождаемой биолюминесценцией, определяют ферментативную активность (чувствительность метода 10" моль/л). [c.614]

Полуколичественная оценка /50 на ранних стадиях культивирования гибридом может быть осуществлена методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. В лунки платы для миКро-титрования, покрытые антигеном, использованным для получения моноклональных антител, помещают по 25 мкл растворенного в фосфатно-солевом буфере с тритоном перекрестно реагирующего антитела, концентрацию которого варьируют от 1 10 до 1 10 М. Затем в каждую лунку добавляют 25 мкл среды культивирования гибридом, разведенной в 2 раза буфером, содержащей моноклональные антитела. Аналогичным образом параллельно титруют исходный антиген, к которому были получены моноклональные антитела. В качестве контроля титрование сходного и перекрестно реагирующего антигенов осуществляют в присутствии 25 мкл разведенной в 2 раза среды культивирования гибридом, не содержащей моноклональных антител. Контрольные и опытные образцы инкубируют 1 ч при 37°С, а затем обрабатывают планшеты по методике для проведения непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. [c.173]

Первые работы по иммуноферментному анализу появились в начале 70-х годов. За это время данное направление стало одним из ведущих в области количественного и качественного определения антигенов и антител ИФА, с помощью которого детектируют химические и биологические соединения различной природы и молекулярной массы — от гаптенов до бактериальных клеток. [c.283]

Если ген нужен для производства программируемого им белка, то с помощью аналогичных приемов его встраивают в специальным образом сконструированные плазмиды, в которых ген примыкает к эффективно работающему промотору РНК-полимеразы. При введении таких плазмид в соответствующие клетки последние начнут интенсивно нарабатывать информационную РНК, соответствующую этому гену, а с ее помощью и конечный продукт гена — белок. Векторы, используемые для этой цели, называют экспрессирующилт. Отбор клеток, которые экспрессируют встроенный ген, лучше всего вести непосредственно по накоплению продукта экспрессии в клопах, например используя радиоимму1Юанализ или иммуноферментный анализ с мечеными антителами к продуцируемому геном белку. [c.304]

При наличии гибридов производят смену среды Дальбекко (без аминоптерина) в течение последующих 14 дней и, наконец, добавляют минимальную модифицированную среду Дальбекко. После этого следует скрининг (от англ. s reen — решето, хфосеивать) гибридных клеток по образованию антител, используя серологические реакции, радиоиммунный, иммунофлуоресцентный или иммуноферментный анализ. Более чувствительный из них радиоиммунный метод. [c.576]

Иммобилизованные ферменты применяют для автоматического анализа биологических субстратов и лекарственных веществ как покрытые электроды (электрохимические датчики, на которые нанесен слой иммобилизованного фермента) в методах сухой химии (слои реагентов и ферментов, при прохождении через которые происходит реакция и образуется окрашенное вещество). 2. Иммуноферментный анализ используют для определения природных лекарственных веществ и ксенобиотиков. Суть его в том, что молекула фермента, соединенная с антигеном или антителом, служит индикатором реакции антиген - антитело в среде. Измеряя активность фермента, можно сказать, сколько молекул антигена вступило в иммунохими-ческую реакцию с антителом. 3. Биотехнология лекарственных препаратов предполагает использование иммобилизованных ферментов в синтезе лекарств. За счет специфичности ферментов в оптималь- [c.478]

Трудности, с которыми можно столкнуться при наработке моноклональных антител, связаны с получением достаточного количества иммуногена и последующим скринингом сыворотки для выявления нужной иммунологической активности. Использование гиперэкспрессии гибридных белков может облегчить преодоление этих трудностей, поскольку дает возможность выделять большие количества белкового продукта с помощью электрофореза или хроматографии. При скрининге сыворотки и полученных затем гибридных клонов можно применять метод радноиммунного анализа (РИА, RTA) или метод твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА, ELISA). [c.173]

После удачного слияния клеток необходимо провести быстрый и эффективный скрининг гибридом. В большинстве случаев дл-ч слияния требуются три этапа скрининга, и поскольку для каждого эксперимента используется свыше 500—1000 лунок, это означает, что для выявления наличия специфических антител нужно проанализировать до 3000 проб. Кроме того, кинетика роста гибридных клеток такова, что результаты скрининга должны быть известны в течение первых 48 ч после отбора проб. Единственный реальный способ обработать такое количество проб — использование метода, который позволяет провести скрининг, дающий визуальные результаты, на планшетах с лунками маленького объема. Скрининг не обязательно дает абсолютно однозначные результаты и допускается выявление некоторого количества ложных положительных клонов. Затем его можно повторить и получить более определенный ответ, работая только с относительно небольшим количеством проб, давших положительный ответ при первом скрининге. Один из наиболее удобных методов скрининга — твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA), при котором антиген наносится на дно лунок пластикового планшета он связывает антитела, продуцируемые гибридомой, а наличие этого комплекса обнаруживается с помощью антител к иммуноглобулинам, конъюгированных с определенным ферментом. Описание иммуноферментного анализа (ИФА) приведено в табл. 6.6. [c.185]

Интересные возможности были обнаружены при использовании ферментов для повышения чувствительности иммунохими-ческих методов анализа. Сущность любого иммунохимического анализа сводится к тому, чтобы после завершения реакции антиген-антитело определить концентрацию избыточного компонента (антигена или антитела), не вступившего в реакцию. Поскольку эти концентрации очень невысоки (10 — 10 моль/л), для их обнаружения обычно применяют легко детектируемую метку радиоактивным атомом, вводимым в один из компонентов (радиоактивный иод, тритий). Оказалось, что без потери чувствительности метода радиоактивная метка может быть заменена присоединением фермента, который после реакции обнаруживается по его каталитической активности. Накоплен достаточный материал по применению этого нового метода, получившего название иммуноферментный анализ (ИФА). С помощью ИФА могут быть детектированы любые вещества, обладающие свойствами антигенов и, естественно, многочисленные возбудители заболеваний человека, животных, растений. Многие из этих методов могут быть приспособлены к автоматическому режиму слежения, что важно для решения задач экологии, контроля технологических производств и т. д. [c.17]

Одним из важных моментов в проведении иммуноферментного анализа является разделение свободных и связанных с антителами меченых компонентов. В настоящее время разработано несколько вариантов решения данной проблемы. Наиболее распространен метод, основанный на иммобилизации антител на твердой подложке (стеики полистирольных пробирок или шариков, целлюлозные диски, гранулы макропористых носителей для хроматографии). Особенно перспективными оказались полистироло-вые пробирки или планшеты, содержащие 96 лунок. Сущность методов разделения основана на том, что одни из компонентов, например антитела, могут быть сорбционно иммобилизованы на поверхности измерительной кюветы. После проведения инкубации с образцом антиген сорбируется на поверхности, а все остальные компоненты остаются в растворе и могут быть легко отделены, например, с помощью пористых частиц под действием магнитного поля. Основными проблемами, возникающими при реализации твердофазных методов разделения, являются стандартизация поверхности и уменьшение неспецифического связывания меченых компонентов с носителем. [c.114]

В медицинской диагностике методы иммуноферментного анализа все активнее внедряются для обнаружения микробных и вирусных возбудителей, а также антител против них. Весьма сложной является проблема обнаружения таких возбудителей паразитарных инфекций, как гельминты, малярийный плазмодий, и других организмов, имеющих сложный и изменчивый антигенный состав. Но и в этих случаях выбор наиболее диагностически значимых антигенов позволяет проводить эффективную диагностику. Все шире применяется иммуноферментный анализ в диагностике неинфекционных болезней, таких, как диабет, р [c.120]

В роли антигенов могут выступать и сами иммуноглобулины (антитела). В этом случае организм вырабатывает антитела, которые часто называют вторичными. Например, при иммунизации <ролика иммуноглобулинами другого вида животного вырабатываются вторичные (антивидовые) антитела. В иммуноферментном анализе существует большая группа методов (в том числе так iaзывaeмый метод двойных антител ), в которых используют ме-1енные ферментом вторичные антитела. [c.14]

В некоторых видах иммуноферментного анализа в качестве одного из реагентов используют гаптен, меченный ферментом. Если связывание в таком конъюгате аналогично способу пришивки в конъюгате гаптена с белком-иосителем для получения антител, то говорят, что в анализе используют гомологичные антитела. Если же структура ножки и способ пришивки гаптена в обоих случаях различны, то говорят о гетерологичных антителах. Применение того или иного вида антител или конъюгатов в нммунофер- [c.16]

В иммуноферментном анализе введение ферментной метки осуществляют путем ковалентного связывания молекулы фермента с молекулой антигена или антитела, При этом оно должно проводиться таким образом, чтобы модификация фермента не вызывала его инактивации. В водном растворе молекулы белков обладают структурой, при которой в поверхностном слое располагаются преимущественно гидрофильные боковые цепи отдельных аминокислотных остатков, часть из которых находится в ионизированном состоянии. Среди этих функциональных групп наиболее удобными для связывания являются е-аминогруппы лизина, карбоксильные группы аспарагинового или глутаминового остатков, 8Н-группа цистеинового остатка. Очевидно, что такая модифика ция ие должна затрагивать функдиональных групп активного [c.57]

При крайне низких концентрациях компонентов образование простого бинарного комплекса антиген-антитело не может быть за регистрировано ни визуально, ни простыми инструментальным методами, что вызывает необходимость усложнения аналитическо системы. Одним из путей визуализации образования комплекс является использование меченых соединений, в которых метка мо ет легко детектироваться в концентрациях, сопоставимых с опре деляемой концентрацией анализируемого соединения. Как правило от типа метки зависит название анализа — радиоиммунологически анализ, флуоресцентный иммуноанализ, иммунокофакторный ана ЛИЗ, иммуноферментный анализ и т. д. [c.78]

Получение меченых антител для анализа методически более просто. Методы синтеза и очистки конъюгатов различных ферментов с иммуноглобулинами в настоящее время хорошо разработаны и унифицированы. С помощью имеющихся стандартных методик получают активные и стабильные препараты, что упрощает разработку методов иммуноферментного определения различных соеди-ненцй. В ИФА могут быть использованы меченая глобулиновая фракция или IgG-фракция антител, аффинно выделенные антитела или их РаЬ-фрагменты. Целесообразность применения того или иного препарата следует оценивать применительно к конкретному случаю. Однако необходимо отметить, что применение меченой глобулиновой или IgG-фракции антител приводит к значительному (до 90%) непроизводительному расходу фермента-маркера, вследствие чего возрастает как стоимость анализа, так и вероятность усложнения интерпретации его результатов за счет увеличения вклада неспецифических взаимодействий. [c.101]

Далеко не все клетки, растущие на НАТ-среде, являются гибри-домами — продуцентами специфических антител. Это связано с тем, что часть лимфоцитов селезенки синтезирует иммуноглобулины неизвестной исследователю специфичности. Кроме того, на первых этапах роста после слияния гибридомы теряют некоторые хромосомы, а вместе с ними и способность к синтезу специфических антител. Поэтому важнейшим этапом получения гибридом является отбор клеток, стабильно синтезирующих антитела к антигену. Тестирование гибридом должно осуществляться на самых ранних стадиях После слияния и предполагает использование таких высокочувствительных методов, как иммуноферментный анализ. Содержание антител в культуральной жидкости на этих стадиях роста клеток составляет 10—100 нг/мл. [c.165]

Недавно описана методика быстрого определения ЬСО с помощью двухсайтового иммуноферментного анализа и иммобилизованных на электроде антител [26]. Активность глюкозооксидазы, связанной с вторыми антителами, определяли электрохимиче Ски с помощью медиатора переноса электронов (диметиламинометид-ферроцена), не прибегая к стадии отдельной инкубации. Средняя чувствительность ЬСО была равна 9 м.ед./л. [c.215]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология