Метод антитела двойного

Биологически чистая информационная РНК из миеломы мыши Антитела (метод двойных антител) Сефароза 43 1014 [c.344]

Для анализа антигенов, разделенных с помощью электрофореза или электрофокусирования в полиакриламидном геле, разработаны многочисленные методы иммунодиффузии. Так, для этой цели можно использовать различные варианты двойной иммунодиффузии. Цилиндрические столбики геля разрезают продольно на две половинки (см. разд. 1.15.6), а из пластин нарезают полоски, содержащие разделенные антигены. Разрезанный гель помещают на стеклянные пластинки, заливают их теплым раствором агара и дают ему застыть. Канавки для антител располагают на соответствующем расстоянии от полиакриламидного геля. Как только полиакриламидный гель покроется слоем агара толщиной 1 мм, в непосредственной близости от него сразу же вырезают канавку для антисыворотки. Если для анализа используют разрезанные вдоль столбики полиакриламидного геля, то их кладут на слой агарового геля и в нем рядом с полоской геля по обеим ее сторонам быстро вырезают канавки для антител. Преципитаты образуются под полоской полиакриламидного геля. Столбик полиакриламидного геля можно также разрезать в поперечном направлении на диски и проанализировать присутствующие в них антигены методом двойной радиальной диффузии 203, 394]. [c.244]

Чашечные методы [9—15] адсорбция антител на полисти-рольных чашках (химически неопределенным способом) наиболее часто используются методы двойных антител, т. е. пластиковые чашки, покрытые антителами против мышиных иммуноглобулинов, селективно связывают клетки, предварительно обработанные специфическими моноклональными антителами. [c.247]

Двойная моноклональная система может нуждаться в антителах различной специфичности. Потенциально метод очень чувствителен, поскольку теоретически можно обнаружить даже одну связавшуюся молекулу АГ [c.27]

Через месяц после первой инъекции берут кровь и определяют в сыворотке содержание антител методом двойной иммунодиффузии в агаровом геле (см. гл. 6) либо непрямым методом по связыванию на пластиковых панелях для микротитрования, нагруженных мышин ым IgG. [c.169]

Двойная диффузия в геле — это единственный в своем роде, уникальный и простой метод изучения антигенных взаимосвязей между молекулами и специфичности антител. Он имеет два главных недостатка а) относительно низкую чувствительность по сравнению с непрямыми методами, например реакциями агглютинации и иммуноферментными тестами, и б) при исследовании смесей антигенов методом ДДГ часто наблюдаются перекрывающиеся и накладывающиеся друг на друга линии преципитации. В этом отношении ДДГ уступает ИЭФ (разд. 4.1), в котором антигены разделяются в геле иа Начальной электрофоретической стадии. [c.207]

Конкурентный иммуноанализ. Исследуемый антиген вместе с меченым антигеном наносят на подложку, покрытую специфическими антителами. Чем больше исследуемого антигена содержит раствор, тем меньше количество связывающегося стандартного меченого антигена. Анализ этого типа часто используют для определения антигенов, присутствующих в относительно высоких концентрациях, или гормонов, которые имеют только один антигенсвязывающий центр. 2. Метод двойного захвата антигена. На подложку с фиксированными антителами наносят исследуемый раствор, и если в нем присутствует антиген, он захватывается антителами. После отмывания не- [c.535]

Метод двойного антитела. Обычно антитела получают от кролика. у-Глобулин кролика является антигеном для других жи- [c.259]

А — метод с использованием угля, покрытого декстраном (поскольку Аг является небольшой молекулой, он может проникать в поры декстрановой матрицы) Б — метод двойного антитела. Комплекс Ат—Аг образует преципитат при добавлении антитела козы. Ат — антитела козы против -глобулина кролика Ат р — антитела кролика. [c.260]

Все рассмотренные выше подходы, используемые для получения рекомбинантных поливалентных антител, могут быть применены и для конструирования макромолекул с несколькими специфичностями. В этом случае, димеризуя s Fv-модули разными методами, получают антитела двойной специфичности трех [c.415]

Для получения антител к этому ферменту кролика иммунизируют с использованием обычной для этой цели техники. Взятие крови у кролика и определение в ней антител осуществляются методами иммунопреципитации, двойной диффузии или значительно более чувствительным радиохимическим методом, который состоит в выявлении комплексов антиген — антитело с помощью 1-меченого белка А (один из белков Staphylo o us aureus, прочно связывающийся с цепями иммуноглобулина IgG [99]). [c.173]

Разработка метода определения опиатов на основе латексной агглютинации. На основе полученных реагентов - антител к опиатам и конъюгата морфина меченого латексом, был разработан метод для выявления опиатов в биологических жидкостях организма с использованием латексной агглютинации. Для этого непосредственно перед работой разводили латексный конъюгат до 1% концентрации буферным раствором. Специфичные антитела против опиатов разводили в плашке, используя серию двойных последовательных разведений. Для проведения опыта в микрокамеры с коническими лунками вносили по 10 мкл сыворотки каждого разведения и быстро добавляли равную аликвоту раствора латекса, модифицированного морфином или конъюгатом морфин-овальбумин. В качестве контроля использовш1и лунку, в которую не добавляли антитела. Интенсивность реакции агглютинации оценивали через 1 час по 4-крестовой схеме [2]. Из полученных результатов выбра1ш условия для проведения реакции ингибирования. Для этого использовали концентрацию антигена на латексе 100 мкг/мл и 50 мкг/мл, а разведения сыворотки соответствовали 1 16, 1 32 и 1 64, Морфин вносили в лунки после серии пятикратных разведений в интервале концентраций от 500 мкг/мл до 200 нг/мл, В каждую лунку вносили 7 мкл антиопиатной сыворотки, 7 мю1 раствора морфина соответствующей концентрации и 7 мкл раствора латекса. Контрольные [c.202]

Некоторые методы требуют использования моноспецифических иммунных сывороток. Основной момент при этом — контроль моноспецифичности препаратов антител, который достигается методом специфической преципитации в геле между иммунной сывороткой и экстрактом, из которого иммуноген был очищен. Наличие более одной линии преципитации показывает, что сыворотка неспецифична. Трудность контроля нередко заключается в том, что моноспецифичность иммуносыворотки проверяется методами, имеющими определенный порог чувствительности (например, методом двойной диффузии), тогда как иммунная сыворотка используется при методах с намного более высокой [c.113]

Попытки разработать методы иммунодиффузии, позволяющие количественно оценивать содержание антигенов и антител, делались неоднократно. Одна группа таких методов основьгоается на двойной диффузии в геле по Ухтерлони (см. стр. 131), другая — на измерении скорости диффузии и степени мутности полос преципитации при иммуноэлектрофорезе (стр. 137). Пока эти методы еще не получили широкого распространения. [c.157]

В опытах по иммунодиффузии раствор исследуемого препарата отделен от антисыворотки зоной геля, в который и препарат, и антисыворотка могут диффундировать (двойная диффузия). По другому способу раствор антигена диффундирует в гель, в котором уже находятся антитела (одиночная диффузия). С течением времени концентрация реагентов становится достаточно высокой для специфической преципитации, и в том месте, где это произошло, линия или полоса преципитации становится видимой. В общем случае каждая система антиген — антитело образует отдельную полосу. Для решения специфических вопросов преципитации разработано большое число различных экспериментальных приспособлений двойную диффузию обычно проводят в чашках Петри или (в меньших масштабах) в тонкой пленке геля на предметном стекле. Полосы можно сделать более заметными путем окрашивания. Одиночную диффузию удобнее проводить в маленьких вертикальных трубочках. Недавно Охтерлони [68] опубликовал обзор с исчерпывающей библиографией, охватывающей все аспекты иммунодиффузионного анализа. Очищенный препарат следует проверить в опытах по одномерной или двумерной диффузии при возможно большем числе концентраций препарата [69]. Появление одиночной полосы с обеими антисыворотками является доказательством гомогенности препарата. Однако гомогенный препарат не обязательно должен давать одиночную полосу. Имеется несколько причин, которые могут вызвать образование двойной полосы и в случае гомогенного антигена. Это может объясняться недостаточным контролем температуры или осаждением, напоминающим кольца Лизеганга, при использовании определенных типов антител, если применяется очень сильная неразбавленная антисыворотка. Более того, установлено, что гомогенный антиген, имеющий несколько антигенных детерминантов, может дать несколько полос преципитации. Эти вопросы обсуждены Кроуле [70] и Фингером [71]. Тем не менее гетерогенность является наиболее обычной причиной двойных или множественных полос нрецииитации. Следует иметь в виду, что неантигенные компоненты нельзя определить этим методом, и нужно также отметить, что примеси, дающие перекрестную реакцию, не будут найдены, если их скорость диффузии меньше, чем у гомологичного антигена [72]. Это обычно не вызывает осложнений, за исключением случаев, когда компонент, дающий перекрестную реакцию, сам является довольно сильным антигеном и может порождать свое собственное антитело, [c.53]

Самым распространенным методом определения антигена и антител является преципитация в агаре (реакция двойной диффузии в геле по Оухтерлони). Преимуществами данной реакции являются относительная простота, высокая специфичность, отсутствие ложноположительных и ложноотрицательных ответов, небольшой расход материалов и возможность определения полноты антигенной идентичности. Недостатками реакции являются низкая чувствительность, длительность получение предварительного ответа через 24 ч, а окончательного—лишь спустя 48—72 ч. Для исследования берут кровь больного в количестве, необходимом для получения 0,3 мл сьшоротки. Реакции ставят на пластинах, в 1% агаре, в котором вырезают лунки для ингредиентов реакции. В качестве тест-системы используют стандартный австралийский антиген и соответствующую специфическую антисьшоротку. Учет реакции проводят через 1—3 дня по появлении дуг преципитации между лунками. [c.248]

Сочетание электрофореза с двойной иммунодиффузией впервые описали в 1953 г. Грабар и Уильямс [460]. С тех пор было опубликовано большое число подробных обзоров, посвященных иммуноэлектрофорезу [80, 237, 261, 459, 952]. Исходный метод [460] обычно называют макрометодом (рис. 82), так как в нем применяют относительно большую стеклянную пластинку (13Х Х18 см), покрытую слоем геля толщиной 2—4 мм. В геле вырезают поперечную канавку и заполняют ее образцом, смешанным с расплавленной при 45 °С агарозой. После завершения электрофореза в геле вырезают продольные канавки (параллельные направлению миграции) и заполняют их раствором преципитирующих антител, специфических по отношению к [c.236]

Большинство преципитирующих антител относится к классу иммуноглобулинов О (1дО), обладающих лишь очень слабым отрицательным зарядом при pH 8—9. Поэтому электроосмоти-ческий поток смещает 1 0 к катоду. Электроэндосмос заметно уменьшается при замене агара агарозой. Путем подбора определенных соотношений агара и агарозы можно регулировать скорость эндосмоса, создавая тем самым оптимальные условия для электросинереза. Очевидно, что антитела следует помещать ближе к аноду, а антиген — ближе к катоду. Если расположить рядом несколько лунок с антигенами, то последние можно сравнивать между собой подобно тому, как это делается в методе двойной иммунодиффузии [186]. Видимые линии преципитации образуются в течение 1—2 ч. Избыток реагентов удаляют, продолжая электрофорез после образования преципитатов. При этом нет надобности отмывать гель перед окрашиванием, что позволяет в течение 3—4 ч получить полную картину окрашенных полос преципитации. [c.247]

Поликлональные антитела против GGT почек быка или GGT почек крысы (легкие формы) могут быть получены иммунизацией кроликов (самки, возраст 6—8 нед) путем инъекций в подушечки задних лап эмульсии, состоящей из 50 мкг фермента в 0,5 мл Na l-натрийфосфатного буфера с 0,5 мл полного стимулятора Фрейнда на животное. Через 2 нед вводят то же количество антигена (50 мкг GGT в 0,5 мл того же буфера), хорошо эмульгированного неполным стимулятором Фрейнда, подкожно в несколько мест шеи. Целесообразно повторить последнее введение еще через 2 нед. Через 10—15 сут берут пробы крови кролика инкубируют взятые пробы при 37 Х в течение 2 ч, затем оставляют на ночь при 4 °С и отделяют антисыворотку центрифугированием при 3000 g в течение 30 мин. В анализах методом двойной иммунодиффузии антисыворотка при разбавлении 1 128 (Na l-фосфатным буфером) все еще дает дуги преципи тации с разбавленной GGT (0,025 мг/мл). [c.153]

При анализе методом двойной иммунодиффузии препарат GGT, очищенный из почек быка с применением иммуноаффинной хроматографии, дает с гомологичными антителами три отдельные дуги преципитации, каждая из которых проявляет GGT-активность. Ферментный препарат может быть также разделен на четыре активные фракции изоэлектрическим фокусированием. GGT из почек крысы, очищенная на иммуноадсорбенте, дает с гомологичными антителами две дуги преципитации, обладающие ферментативной активностью. Эти наблюдения подтверждают предположение, что GGT присутствует в виде нескольких молекулярных форм, которые могут отличаться по содержанию сиаловой кислоты. Тэйт и Мейстер [34] впервые продемонстрировали, что чистая легкая форма GGT из почек крысы может быть разделена на несколько ферментных форм. Эти наблюдения делают очевидным тот факт, что молекулярные формы, очищенные на иммуноадсорбентах, иммунологически неразличимы. [c.162]

В роли антигенов могут выступать и сами иммуноглобулины (антитела). В этом случае организм вырабатывает антитела, которые часто называют вторичными. Например, при иммунизации <ролика иммуноглобулинами другого вида животного вырабатываются вторичные (антивидовые) антитела. В иммуноферментном анализе существует большая группа методов (в том числе так iaзывaeмый метод двойных антител ), в которых используют ме-1енные ферментом вторичные антитела. [c.14]

Следует обратить внимание читателей на те основные тенденции развития иммуноферментного анализа, которые прослеживаются в представленной книге сокращение времени анализа и упрощение методик благодаря переходу к гомогенным методам анализа применение двойных меток (два фермента, фермент и якорная группа и т. д.), которые повышают специфичность детектирования ферментной метки использование моноклональных антител и множественный антигенный анализ для повышения специфичности иммунохимической стадии детектирования. Принципиально новым является создание методов иммунохроматографии, в которых концентрация вещества определяется не по активности ферментного конъюгата, а по его хроматографической подвижности. [c.6]

Метод ОТНОСИТСЯ к гомогенно-гетерогенным, так как первая стадия взаимодействия антител с определяемым и меченым антигеном проходит в растворе. После установления в системе равновесия в раствор вносят носитель с иммобилизованными вторичными антителами, которые сорбируют образовавшиеся на первой стадии специфические иммунохимические комплексы. Часто отделение образовавшегося комплекса достигается за счет образования преципитата в присутствии растворимых антивидовых антител, необходимая для полноты осаждения концентрация которых предварительно должна быть точно подобрана. После проведения стадии отмывки несвязавшихся компонентов определяют ферментативную активность на носителе или в Преципитате. В литературе этот подход часто называют методом двойных антител (англ. double antibody assay). [c.98]

Широко используемый метод двойной диффузии в агаре предложенный О. Ухтерлони (О. ОисЬ1ег1опу, 1948), состоит в том, что антиген (ы) и антитело a) помещают в лунки, проделанные в топком слое геля на [c.254]

Помимо выявления аитигенной неоднородности метод двойной диффузии в геле позволяет сравнить антигенное строение нескольких веществ и выявить наличие сходства и различий между ними. Как всякий иммунологический метод, метод двойной диффузии в геле имеет ограничения, основное из которых — спектр антител в исследуемой антисыворотке. Так, в ранних работах при сравнительном изучении антигенного строения IgG кролика и его Fab- и F -фрагментов использовали антисыворотку против IgG кролика, полученную от коз. Исследователям не было тогда известно, что животные этого вида не образуют практически антител против детерми-Бант Fab-участка молекулы. Поскольку при использовании этой антисыворотки F -фрагмент давал реакцию антигенной идентичности с нерасщепленной молекулой IgG, сделали ошибочное заключение об отсутствии в РаЬ-участке видоспецифических антигенных детерминант. Ошибка была исправлена после исследования фрагментов молекулы IgG с помощью антииммуногло- булиновых сывороток, полученных от животных других видов, в антисыворотке осла против IgG кролика содержится примерно равное количество антител против антигенных детерминант Fab- и F -участком. На этом примере можно еще раз убедиться в необходимости использования при антигенном анализе антисывороток, полученных от животных разных видов (см. гл. 2). [c.255]

При изучении иммунных систем широко используется стандартный метод двойной иммунодиффузии, однако для получения тонких характеристик антител и антигенов может потребоваться анализ иммуноглобулинов в культуральных жидкостях или в сыворотках крови. В этих случаях сывороточные белки метят радиоактивным иодом, а иммуноглобулины, продуцируемые клетками в культуре, — биосинтетически или также иодом. [c.489]

Для проведения двойной иммунодиффузии агаровый гель наливают на предметные стекла, после застывания вырезают в нем лунки и заполняют их исследуемыми растворами антигена (Аг) и антител (Ат). Растворы диффундируют в гель, и на той линии, где происходит взаимодействие Аг и Ат (с перекрестным связыванием и осаждением иммунных комплексов), образуется линия (дуга) преципитации. Ее можно наблюдать визуально, если промыть гель (для удаления растворимых белков) и нанести на него краситель, выявляющий белки, например кумасси синий. Такой метод может быть использован для определения родства между антигенами (синие кружки) и в реакции с данными тест-антителами (желтый кружок). При этом возможны три основных типа результатов (цифры в синих кружках обозначают эпитопы антигена). В реакции (1) дуги преципитации, образованные антителами и двумя исследуемыми антигенами, сливаются это показывает, что антитела взаимодействуют с идентичными эпитопами на двух антигенах (эпитоп 1). Такой результат не означает полную идентичность самих антигенов, но только их идентичность в том смысле, что данные антитела не выявляют различий между ними. В реакции (2) антитела выявляют 3 разных антигена, которые образуют независимые дуги преципитации. В реакции (3) антигены имеют общий зпитоп 1, однако один из них несет еще эпитоп 2. [c.528]

Берд и Вонг (Burd, Wong, 1977, 1979) разработали иммуноферментный анализ без разделения компонентов, основанный на использовании связанных с лигандом флуорогенных субстратов. В этом методе (рис. 2-4) производное лиганда ковалентно соединяют с флуорогенным субстратом фермента, получая прочный конъюгат [субстрат — лиганд (С—Л)], который конкурирует с определяемым веществом за имеющиеся в ограниченной концентрации антитела к Л. В результате по реакциям I и II образуются Л Ат и С—Л Ат. Когда в растворе нет определяемого вещества Л, конъюгат С—Л связывается с антителами против Л при этом индикаторная реакция III не идет, так как связанный с антителами конъюгат С—Л Ат в отличие от свободного С—Л не является субстратом фермента. Однако при увеличении концентрации Л количество свободного С—Л, чувствительного к ферменту, будет возрастать и, следовательно, по реакции III будет образовываться большее количество продуктов. Таким образом, конъюгат [флуорогенный субстрат — лиганд (С—Л)] играет двойную роль а) как аналог лиганда С—Л успешно конкурирует за связывание с антителами к лиганду б) как эффективный аналог субстрата С—Л участвует в индикаторной реакции III с образованием продуктов. [c.17]

М КС1 и 0,015 М Mg b). Полноту насыщения контролируют, определяя наличие антител в надосадочной жидкости методом двойной диффузии в агаре (А. И. Гусев, 1968) или по реакции кольцепреципитации. Готовые сэндвич-сорбенты суспендируют в стандартном буфере из расчета 5 мг/мл. Сэндвич-сорбенты рекомендуется готовить небольшими порциями, рассчитанными на 1— [c.295]

В рассмотренном методе обнаружения антигенов после электрофореза в ПААГ путем их диффузии в слой агаройы иммунная реакция следовала за окончанием этой диффузии, когда снятую с ПААГ агарозную реплику вымачивали в специфической антисыворотке. Два процесса можно совместить во времени, если антисыворотку заставить диффундировать в гель навстречу диффузии антигена из белковых зон, полученных в результате электрофореза [Grabar, Williams, 1953]. При этом можно ожидать образования полос преципитации комплексов антиген — антитело, подобно тому как это имеет место при двойной радиальной иммунодиффузии по методу Ухтерлони. Для удобства наблюдения раствор антисыворотки следует заливать не сверху, а рядом с треком электрофореза, на некотором расстоянии от него, с тем чтобы оставалась свободная полоса ПААГ, где и будет происходить диффузия антигенов и антител навстречу друг другу. Поскольку расположение полос антигенов после электрофореза заранее неизвестно, антисыворотку, очевидно, придется заливать не в лунку, а в канавку, идущую вдоль всего трека. Кроме того, антисыворотку следует вносить в такую канавку только после окончания электрофореза, иначе преждевременная диффузия антител в гель может помешать завершению процесса электрофоретического фракционирования смеси белков. [c.134]

Высокая специфичность и малый размер dAb делают их особенно удобными для получения путем отбора из комбинаторных клонотек последовательностей, а также для осуществления аффинного созревания и наработки в большом количестве с помощью генно-инженерных методов. Кроме того, небольшие молекулы легче доставляются к мишеням внутри организма при терапевтических воздействиях. В то же время короткие полипептиды значительно менее стабильны в биологических жидкостях по сравнению с полноразмерными антителами, что ограничивает их клиническое применение. Для преодоления этого затруднения проводятся работы по созданию конъюгатов dAb с полиэтиленгликолем, сывороточным альбумином, а также Рс-фрагментами или целыми константными частями молекул антител. По предварительным данным каждый из таких методов существенно улучшает свойства dAb как потенциальных лекарственных препаратов. Так же, как и в случае s Pv-фрагментов антител, dAb удобно димеризовать для повышения авидности и создания миниантител двойной специфичности. Альтернативно, гетеродимеризацию можно проводить, используя дисульфид-ную связь между доменами Сн1 и l, которая приводит к обра- [c.421]

Встречный электрофорез проводят в агаровом геле, pH которого устанавливают так, чтобы антитела (Ат) несли суммарный отрицательный заряд, а исследуемый антиген (Аг) - положительный. В электрическом поле антиген и антитела движутся навстречу друг другу и преципитируют. Принцип метода тот же самый, что и при двойной иммунодиффузии, однако чувствительность выше в 10 - 20 раз. Ракетный электрофорез позволяет количественно определять антиген в антителосодержащем геле, pH которого подбирают с таким расчетом, чтобы движения антител не происходило, а антиген нес суммарный отрицательный заряд. Линия преципитации очерчивает область в виде ракеты, длина которой пропорциональна концентрации антигена. Определить эту концентрацию можно по калибровочной кривой. Внизу справа - фотография окрашенного геля. Оба метода основаны на различии суммарных зарядов антигена и антител при выбранном pH для большинства антигенов такие различия существуют, так как антитела имеют более высокую изоэлектрическую точку (т. е. несут нейтральный заряд при более высоком значении pH, чем большинство антигенов). Если заряды антигена и антител существенно не различаются, можно химически модифицировать антиген, чтобы сдвинуть изоэлектрическую точку. Ракетный электрофорез проводят и в обратной постановке, если требуется определить концентрацию антител здесь важно подобрать правильно гель и pH для иммобилизации антигена, чтобы не нарушалась его структура и не возникло препятствий для реакции антиген-антитело. (Р - диаметр кольца преципитации.) [c.530]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология