Влияние концентраций субстрата и фермента на скорость ферментативной реакции

Рис. 22. Влияние ограничения диффузии субстрата на кинетику действия иммобилизованного фермента, подверженного ингибированию субстратом прямые 1, 2 к 3 — зависимости скорости диффузии субстрата к ферменту от [5] о кривая 4 —. зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в отсутствие диффузионных ограничений точки А, В, С, О, Е) — стационарные состояния, когда скорость диффузии субстрата к ферменту равна скорости реакции для иммобилизованного фермента

Рис. 25.7. Зависимость скорости образования продукта от концентрации субстрата для типичной ферментативной реакции. Скорость образования продукта пропорциональна концентрации субстрата в области низких концентраций. При высоких концентрациях субстрата все активные центры фермента оказываются связанными в комплексы дальнейшее добавление субстрата не оказывает влияния на скорость реакции.

Скорость ферментативной реакции зависит от концентрации субстрата (субстратов), pH, температуры, присутствия активаторов или ингибиторов, природы буфера, его ионной силы и др. Ряд факторов оказывает влияние на стабильность фермента, вызывая необратимые-изменения его нативной конформации. Это необходимо учитывать, подбирая условия измерения активности (pH, температура, время инкубации). Подробное исследование стабильности ферментов описано, ниже. [c.206]

Влияние концентраций субстрата и фермента на скорость ферментативной реакции [c.144]

Ряд факторов влияет на скорость ферментативной реакции, и некоторые из них оказывают глубокое влияние таковы концентрации субстрата, концентрация фермента, концентрация ионов водорода или электролита, присутствие активаторов или ингибиторов и температура. , [c.70]

В работе [10] изучали влияние н-бутаиола на-кинетику реакций гидролиза сложных эфиров, катализируемых карбокси-пептидазой В. На основании зависимости скорости ферментативной реакции от начальной концентрации субстрата (табл. 11) предложить кинетическую схему реакции (приняв двухстадийный механизм действия фермента) и определить константу ингибирования н-бутанолом. [c.91]

Одним из характерных проявлений жизни является удивительная способность живых организмов кинетически регулировать химические реакции, подавляя стремление к достижению термодинамического равновесия. Ферментативная кинетика занимается исследованием закономерностей влияния химической природы реагирующих веществ (ферментов, субстратов) и условий их взаимодействия (концентрация, pH среды, температуры, присутствие активаторов или ингибиторов) на скорость ферментативной реакции. Главной целью изучения кинетики ферментативных реакций является получение информации, которая может способствовать выяснению молекулярного механизма действия фермента. [c.134]

Давайте рассмотрим влияние изменения концентрации субстрата на начальную скорость ферментативной реакции при постоянной концентрации фермента [c.231]

Рис. 88. Отрицательная температурная модуляция ферментативной активности.. 4. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата для одного и того же фермента при двух различных температурах. Сродство фермента к субстрату (измеряемое величиной, обратной кажущейся величине К ), при снижении температурыумепьшаегся, Область физиологических концентраций субстрата, заштрихована. Обратите внимание па то. что дестабилизирующее влияние отрицательной температурной модуляции на скорость реакции возрастает с уменьшением концентрации субстрата. Б. Зависимость кажущейся величины от температуры — одно из проявлений отрицательной температурной модуляции.

Исследования фермент-субстратных взаимодействий, особенно проведенные в последние 25 лет, подтвердили и расширили эти идеи. Ферменты, обладающие подлинной специфичностью и использующие только один субстрат, трудны для систематических исследований. Существует, однако, много ферментов с весьма широкой специфичностью. Для них становится возможным измерение влияния изменения структуры субстрата на /Скат и /(м в условиях, оптимальных для природного субстрата. Другим полезным подходом является использование соединений — конкурентных ингибиторов реакции. Последние представляют собой соединения, связывающиеся в том же участке фермента, что и субстрат, обычно в силу близости их структур, и тем самым мешающие протеканию реакции между ферментом и субстратом, так как занимают места, в обычных условиях занимаемые субстратом. Эффект ингибирования четко зависит от концентрации, и каждый отдельный ингибитор можно охарактеризовать, измеряя влияние изменения его концентрации на скорость ферментативной реакции. Эффективность процесса выражается посредством константы ингибирования /С , которая, подобно Кч, в пределе равняется константе диссоциации. [c.511]

Из приведенного ранее материала вытекает важное заключение одним из наиболее существенных факторов, определяющих скорость ферментативной реакции, является концентрация субстрата (или субстратов) и продукта (продуктов). При постоянной концентрации фермента скорость реакции постепенно увеличивается, достигая определенного максимума (см. рис. 4.12, 4.13), когда дальнейшее увеличение количества субстрата практически не оказывает влияния на скорость ферментативной реакции. В таких случаях принято считать, что субстрат находится в избытке, а фермент полностью насыщен, т.е. все молекулы фермента связаны с субстратом. Ограничивающим скорость реакции фактором в последнем случае становится концентрация фермента. Именно при этих условиях определяют величину максимальной скорости (У ) и значения константы Михаэлиса (К (см. рис. 4.13 4.14). [c.144]

Для ферментативных реакций Qig изменяется в пределах от 1 до 2, что обусловлено белковой природой ферментов, особенностями протекания ферментативной реакции и внутренней среды организма. Влияние температуры на скорость ферментативной реакции очень многообразно. Она может прежде всего влиять на стабильность фермента, ускоряя денатурацию ферментативного белка, что связано с инактивацией фермента на сродство фермента к субстрату скорость распада фермент-субстратного комплекса, всегда образующегося при ферментативной реакции на сродство фермента к активаторам и ингибиторам, если они имеются в системе. Повышение температуры, с одной стороны, ускоряет саму ферментативную (каталитическую) реакцию с другой стороны, ускоряется инактивация фермента. Таким образом, с повышением температуры при ферментативных реакциях, как и вообще при химических процессах, растет реакционная способность, истинная каталитическая активность. Но ферменты представляют собой белки, которые необратимо денатурируют при увеличении температуры выше 50° С, причем скорость денатурации при нагревании увеличивается во много раз быстрее, чем скорость любого химического превращения. Поэтому процесс инактивации, связанный с уменьшением концентрации фермента в системе, обусловливает при дальнейшем повышении температуры замедление реакции. [c.129]

Ферменты крайне чувствительны к изменению концентрации водородных ионов. Это обусловлено такими причинами, как степень ионизации функциональных группировок, особенно в активном центре фермента, изменениями структуры белковой макромолекулы, а также влиянием pH на степень связывания фермента с субстратом. Так же как и температурная зависимость, pH-зависимость скорости ферментативной реакции имеет колоколообразную форму (рис. 6.9). [c.75]

Под ферментативной кинетикой понимают закономерности изменения скорости реакции в зависимости от химической природы реагирующих веществ и условий их взаимодействия. Под условиями взаимодействия понимают влияние концентрации реагирующих веществ, температуры, давления, присутствия ингибиторов или активаторов и т. п. В настоящем разделе из всех перечисленных факторов рассматривается только влияние концентрации субстрата и фермента. [c.374]

Большинство реакций, катализируемых ферментами, являются бимолекулярными, включающими, например, перенос группы между двумя субстратами или гидролиз субстрата. Однако на основании исторических данных можно сказать, что при кинетическом рассмотрении ферментативных реакций на ранних стадиях исследования преобладало формулирование кинетических уравнений, учитывающих только субстрат. В широко изучавшихся реакциях гидролиза вода как реагент находится в таком большом избытке, что ее концентрация изменяется незначительно, оказывая очень слабое влияние на скорость реакции только в концентрированных растворах хорошо растворимых в воде субстратов, подобных сахарозе, или в смешанных растворителях изменения концентрации воды становятся достаточными для того, чтобы влиять на скорость реакции [31]. Если скорость гидролиза не зависит от концентрации растворителя, можно написать схему реакции с образованием промежуточного комплекса между субстратом и ферментом. [c.115]

Кинетика ферментативных реакций часто является весьма сложной, и порядок реакции может изменяться в ходе реакции. В начале реакции при высоких концентрациях субстрата реакция может обладать кинетикой нулевого порядка. Эта стадия относится к васыЩению поверхности фермента субстратом. Если реакция идет дальше,, концентрация субстрата падает, и реакция обычно превращается в реакцию первого порядка. Нельзя недооценить значения правильного измерения скорости реакции при сравнении влияния различных факторов на скорость ферментативных реакций. Этот вопрос уже рассматривался в начале главы. [c.70]

Все факторы, оказывающие влияние на образование или расщепление фермент-субстратного комплекса, естественно, оказывают влияние и на скорость ферментативной реакции. Как и в случае обычных химических реакций, для ферментативной реакции имеет значение концентрация фермента, субстрата, температура, pH, присутствие активаторов или ингибиторов. [c.229]

Изложенное выше, по-видимому, применимо и к отщеплению продуктов ферментативной реакции из связи с активным центром и регенерации свободного фермента. Видимо, и в этом случае происходит последовательный разрыв связей, в ходе которого может освобождаться функциональная группа активного центра, способная к реакции с ингибитором (например, гидроксил серина). Другие группировки, оказывающие влияние на реакционноспособность этой группы, могут оказаться в момент реакции с ингибитором еще занятыми. Очевидно, что при этом фосфорорганический ингибитор будет реагировать с ферментом с иной скоростью, чем при полностью свободном активном центре. Такое явление особенно должно сказываться на кинетике ингибирования при концентрациях субстрата, значительно превышающих величину константы Михаэлиса, т. е. тогда, когда активные центры насыщены молекулами субстрата и для реакции с фосфорорганическим ингибитором доступны лишь те, которые освобождаются в ходе ферментативной реакции. При этом, естественно, скорость ингибирования фермента будет зависеть от соотношения констант скорости к+х (реакция с субстратом) и к1 (реакция с ингибитором). Это соотношение будет неизменным, если реакция идет с полностью свободным активным центром. Оно будет изменяться (при избытке субстрата), если ингибитор будет взаимодействовать с неполностью освобожденным активным центром. Если эти соображения выразить языком кинетики, то можно получить уравнение, вполне аналогичное уравнению (Х.8). Для этого достаточно считать, что с ингибитором реагирует не ацилированный фермент, а продукт его превращения, в котором гидроксил серина уже свободен, но фермент еще не принял исходного структурного состояния. Такое предположение в равной мере объясняет различие соотношения констант скорости ингибирования в отсутствие и в присутствии субстрата для разных по структуре ингибиторов. [c.231]

Однако легко видеть, что в системе (2.21). при увеличения концентраций хиу субстратов этих реакций скорости V2 и V3 растут неограниченно. Между тем хорошо известно, что при увеличении концентрации субстрата скорость нормального биохимического процесса вначале растет, а затем достигает насыщения. Указанная особенность отражает ферментативную природу биохимических процессов. Насыщение скорости есть следствие связывания всех молекул фермента в фермент-субстратный комплекс, после чего увеличение концентрации субстрата уже не оказывает влияния на скорость реакции. Это и описано в известном уравнении Михаэлиса-Ментен (см. лекцию 3), в котором скорость зависит от субстрата как [c.33]

Зависимость скорости реакции от удельной концентрации иммобилизованного фермента (количества активного фермента на 1 г носителя). Как видно из анализа уравнения (7), скорость реакции в диффузионной области не должна изменяться при возрастании удельной концентрации иммобилизованного фермента. Кроме того, скорость диффузионно-контролируемых реакций не должна также зависеть от таких факторов, как изменение pH, ионной силы, добавление ингибиторов и активаторов, которые оказывают специфическое влияние исключительно на ферментативные стадии (что легко проследить в случае нативного фермента). Следует, однако, учитывать, что для одного и того же препарата иммобилизованного фермента реакция со специфическим (высокореакционноспособным) субстратом может быть диффузионно контролируемой, а с неспецифическим субстратом (менее реакционноспособным) протекать в кинетической области. [c.104]

Исследование механизма ферментативной реакции кинетическими методами основано на изучении функциональной зависимости скорости реакции от различных факторов. Скорость реакции представляет собой функцию многих переменных концентрации фермента и субстрата, pH, температуры, воздействия модификаторов и др. Обычно уравнение стационарной скорости вводят для случая, когда скорость можно считать функцией одного переменного. В самом деле, подобрав специальным образом условия протекания реакции, можно пренебречь влиянием различных факторов и параметров реакции (агрегация белковых молекул фермента, значительное накопление продуктов и т. д.). [c.13]

Под ферментативной кинетикой в широком смысле понимают зависимость скорости реакции, ускоряемой ферментом, от химической природы реагирующих- веществ (субстраты, фермент) и условий их взаимодействия (концентрация, температура, pH среды, наличие активаторов или ингибиторов и т. п.). Однако зависимость скорости ферментативного процесса от температуры, pH среды и влияния ингибиторов и активаторов в значительной мере связана с изменением свойств фермента как белкового тела. Поэтому здесь будет освещен только вопрос о закономерностях, определяемых природой и концентрацией реагирующих веществ и их изменением. [c.105]

Скорость ферментативной реакции измеряется количеством субстрата, расщепившегося в единицу времени. На скорость фер1ментативной реакции оказывает влияние ряд факторов, как, например, концентрация фермента, концентрация субстрата, накопление продуктов расщепления, pH среды, присутствие активаторов и парализаторов, температура. [c.145]

Регуляция Ю аболических процессов может осуществляться на разных уровнях постепенно возрастающей сложности. Простейший путь регуляции — это влияние на скорость ферментативной реакции компонентов реагирукодей системы внутриклеточная концентрация субстрата (субстратов) ферментов, коферментов каждого промежуточного продукта, ионов металлов, внутриклеточное значение pH. Каждый фермент в мультнферментной системе характеризуется определенным оптимумом pH и сродством к своему субстрату (субстратам), продукту (продуктам), а также к своему ко-ферменту или активатору (иону металла). [c.124]

Энергия активации субстрата, например сахарозы, под влиянием ферментов снижается вследствие некоторой деформации молекул субстрата, которая происходит при образовании промежуточного комплекса фермент — субстрат. Эта деформация ослабляет внутримолекулярные связи, и молекула становится более способной к определенной реакции. В основе каталитического действия ферментов лежит сильное поляризующее влияние двух или нескольких групп различной природы, входящих в состав активного центра фермента, на реагирующие связи субстрата. К основным факторам, определяюи1,им начальную скорость ферментативной реакции, относятся концентрация ферментов и субстрата, pH, температура и присутствие активаторов или ингибиторов. Для многих ферментов температурн-ый оптимум нх действия близок к 37°С. [c.75]

Использование графиков, построенных в двойных обратных координатах для анализа данных, полученньк при исследовании ингибирования ферментативных реакций, позволяет легко отличать конкурентные ингибиторы от неконкурентных. Проводятся две серии опытов по определению скорости реакции при одной и той же концентрации фермента. В одной серии концентрация субстрата тоже остается постоянной и соответствующими экспериментальными методами определяется влияние повышения концентрации ингибитора на начальную скорость реакции Го. В другой серии, наоборот, концентрация ингибитора поддерживается постоянной, но используются разные концентрации субстрата. На основе данных, полученных в опытах той и другой серии, строят графики в координатах 1/И [c.247]

После того как было выяснено, что константа скорости реакции расщепления S—S-связи в тиосульфате является лимитирующим фактором, ограничивающим максимальную скорость всего процесса, появилась возможность решить вопрос о вероятном участии сильной нуклеофильной группировки фермента в этой реакций. Этот вопрос возник в связи с весьма значительным выигрышем в энтропии, который давала ферментативная реакция по сравнению с некатализированной реакцией тиосульфата с цианидом. Механизм двухтактного замещения благоприятствует реакции между двумя одноименно заряженными ионами, поскольку в этом случае заряд первого субстрата уходит в раствор вместе с продуктом реакции до того, как происходит реакция со вторым субстратом. Для реакции тиосульфата с цианидом этот электростатический энтропийный фактор сам по себе дает разницу в свободной энергии активации около 6 ккал/моль. Помимо того-, замена бимолекулярной реакции на мономолекулярную на стадии, лимитирующей общую скорость, должна снижать AG на 1,4— 2,4 ккал/моль за счет вклада неэлектростатической энтропии, определяющегося либо в соответствии с гипотезой о повышении концентрации до 10 AI (стр. 102), либо в соответствии с представлением об энтрЬпийном факторе отбора , равном 8 э. е. Если учесть небольшой дополнительный вклад строгой ориентации тиосульфат-иона в комплексе, то общий выигрыш энтропии будет весьма близок к величине общего изменения ДС. Если бы все перечисленные составляющие выигрыша энтропии могли быть реализованы, то для расщепления связи в субстрате с помощью нуклеофильной группировки фермента такой же силы, как цианид, было бы достаточно небольшого электрофильного смещения альтернативно реакция могла бы проходить с очень слабым нуклеофилом, но тогда должно было бы существовать сильное электрофильное влияние, например со стороны иона металла, связанного с ферментом. [c.208]

Влияние pH на ферментативную активность иногда можно объяснить в рамках модели, предполагающей, что катализ зависит от состояния ионизации некоторых аминокислот. Тогда, если зависимость кат//См от pH описывается колоколообразной кривой, по ней можно определить константы ионизации Ки и К е каталитически важных групп в свободном ферменте. Константы ионизации, относящиеся к комплексу Е5, можно получить из зависимости кат от pH [101]. В случае КПА определение величин К е и Кге было бы полезным для установления роли тирозина и других остатков, расположенных вблизи субстрата. Однако имеющиеся данные довольно скудны. Пептидный субстрат КБЗ-01у-01у-РЬе был исследован недавно в условиях, при которых интерпретация результатов не осложняется ингибированием или активацией [7]. Кривые зависимости кат/-/См от pH оказались колоколообразными, что предполагает участие в катализе как кислой, так и основной групп. Кривые, описывающие влияние pH на кат, для этого субстрата имеют точку перегиба около pH 6. В щелочной области (до pH 10,5) кат практически постоянна . Отсутствие данных, указывающих на титрование второй группы в комплексе Е5, не исключает возможности участия в реакции кислотного катализа, если предположить, например, что соответствующая стадия не лимитирует скорость реакции (ср., однако, работу [103]). Зависимость гидролиза КГФ от pH представлена в нескольких ранних работах. Данные, полученные при высокой концентрации субстрата, указывают на с./южный характер влияния pH на кат и [26]. По зависимости начальной скорости от pH [104] были определены величины р/Се51 равные 6,5 и 8,6, однако сравнение с ацилтрипептидами показывает, что эти данные нуждаются в уточнении. При более низкой концентрации КГФ влияние pH на кат менее выражено [85]. [c.536]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология