Введение в ферментативную кинетику

Сущность этого метода состоит в следующем. В систему, содержащую фермент и субстрат, вводят ингибитор в концентрации, существенно превышающей концентрации фермента, и измеряют кинетику ферментативной реакции по скорости превращения субстрата или образования продукта. При этом наиболее удобны методы измерения ферментативной кинетики, основанные не на отборе проб по времени и их анализе, а такие, которые позволяют непрерывное измерение скорости процесса в реагирующей системе (например, спектрофотометрические, потенциометрические и т. п. методы). При этом целесообразны такие условия эксперимента, когда реакция в отсутствие ингибитора имеет нулевой порядок. Тогда в отсутствие ингибитора ход ферментативной реакции выражается прямой (рис. 27, 1), тангенс угла наклона которой представляет скорость (и) процесса. Если в момент времени и в систему введен ингибитор, то скорость ферментативной реакции постепенно будет падать, причем для бимолекулярной реакции с избытком ингибитора это падение выражается экспоненциальной кривой (рис. 27, 2). Скорость ферментативной реакции (у / ) в присутствии ингибитора для любого момента времени (принимая и за нуль) может быть найдена как тангенс наклона касательной к кривой 2 = = tg 02. Расчет константы скорости взаимодействия фермента с ингибитором может быть проведен по уравнению [c.117]

В гл. 3 были рассмотрены основные принципы анализа формы кинетических кривых в наиболее распространенных координатных системах, традиционно применяемых в ферментативной кинетике. С точки зрения информации, которую можно получить о форме кривой, эти системы считаются эквивалентными, и отдать преимущество какой-либо из них затруднительно. Однако следует отметить, что для анализа дробно-рациональных функций может оказаться целесообразным введение новых координатных систем. [c.48]

Введение в ферментативную кинетику [c.31]

Как мы видим, обратимое взаимодействие с субстратом приводит к тому же самому результату (фиг. 9), что и классическое конкурентное ингибирование это вполне естественно, поскольку можно считать, что О конкурирует с ферментом за субстрат. Значение этогО вывода для практики зависит от того, как исследуется кинетика ферментативной реакции. Если- начальная концентрация субстрата Ло принимается просто равной концентрации, введенной в реакционную смесь, а скорость реакции оценивается по скорости образования продукта X, отличить кинетически О от истинного конкурентного ингибитора невозможно. Обнаружить отсутствие взаимодействия О с самим ферментом можно только в том случае, бели Ло действительно измеряется в реакционной смеси с помощью метода, позволяющего отличать свободный А от [c.72]

Биохимия изучает метаболизм лекарственных веществ, привлекая методы клинической биохимии анализ лекарств и их метаболитов в биологических материалах, измерение активности и кинетики ферментов и т. д. Нужно отметить, что метаболизм лекарств зависит не только от таких факторов, как генетические, возрастные, органоспецифические, нейроэндокринные особенности организма, но и от способа введения лекарства в организм и от состояния внещней среды. Например, способ введения лекарства в организм определяет путь его метаболизма. Энтеральный способ введения лекарства обеспечивает его быстрый ферментативный гидролиз в желудочно-кишечном тракте, продукты которого при всасывании с кровью воротной вены сразу поступают в печень. Нужно отметить, что печень — это самый главный орган переработки неродственных организму [c.506]

Введение и гл. 1 и 2 являются как бы вступлением к основному материалу, они помогут читателю вспомнить основные сведения о мембранном транспорте, кинетических схемах ферментативных реакций и традиционных способах анализа уравнений скорости. При этом предполагается, что читатель уже знаком с некоторым материалом по энзимологпи, в частности с книгой Э. Корниш-Боуден Основы ферментативной кинетики . По этой причине многие понятия вводятся без детального обсуждения. В гл. 3 более подробно представлен анализ дробно-рациональных функций в координатах, обычно применяемых в кинетике. В основу этой главы положены работы У. Бэрдсли и его коллег из Манчестерского университета, поэтому в тексте сохранены оригинальные символы и обозначения, чтобы заинтересованный читатель мог разобраться в исходных публикациях. [c.6]

Соединения, которые при добавлении их в реакционную смесь вызывают уменьшение скорости ферментативной реакции, называются ингибиторами. Ингибирование может возникать по многим причинам, и поэтому суш ествует много различных типов ингибиторов. Один из классов ингибиторов, не представляющих, впрочем, особого интереса для ферментативной кинетики (за исключением случаев, когда они выступают как фактор, искажающий результаты эксперимента), это необратимые ингибиторы, или каталитические яды. Ингибиторы этого типа, взаимодействуя с ферментом, снижают его активность до нуля. Многие ферменты отравляются следовыми количествами ионов тяжелых металлов, и поэтому кинетические исследования обычно проводят в присутствии комплексообразующих агентов, например этилендиаминтетраук-сусной кислоты. Это обстоятельство особенно важно учитывать при очистке ферментов в неочищенных препаратах общая концентрация белка довольно высока и многие примеси белкового происхождения связывают почти все присутствующие ионы металлов, однако по мере очистки препарата фермента защитное действие других белков уменьшается и добавление дополнительных связывающих агентов становится необходимым. В некоторых случаях введение необратимых ингибиторов, напротив, может оказаться полезным. Например, отравление ферментов соединениями двухвалентной ртути часто используется для выяснения вопроса о роли сульфгид-рильных групп в активности ферментов. Однако этот аспект применения необратимых ингибиторов носит сугубо качественный характер и не имеет отношения к кинетике. Поэтому каталитические яды в дальнейшем обсуждаться не будут. [c.78]

Изучение начальных скоростей многосубстратных реакций в обоих направлениях, проводимое в присутствии и в отсутствие продуктов реакции, обычно позволяет исключить многие возможные типы механизмов и выяснить основные свойства механизма изучаемой реакции. Однако этот подход, как правило, не дает никакой информации о второстепенных путях реакции, которые вносят настолько малый вклад в общую скорость, что обнаружить их практически невозможно. Поэтому для окончательного решения вопроса о механизме реакции требуется дополнительная информация. Даже в том случае, когда результаты исследования начальных скоростей и ингибирования продуктом ясно указывают на определенный механизм, справедливость вывода целесообразно подтвердить независимым путем. Зачастую при этом весьма полезным оказывается метод изотопного обмена, который был введен в ферментативную кинетику Бойером [17 ]. [c.134]

Главный недостаток, которым страдали ранние работы по ферментативной кинетике, состоял в том, что в них не придавали значения влиянию на ферментативный катализ Н" -ионов. В водных растворах концентрация Н -ионов может меняться от 1 М до приблизительно М. Этот огромный интервал обычно сжимают до разумных размеров введением логарифмической шкалы pH = —lg[H ]. Свойства всех ферментов очень сильно зависят от pH, и механизм их действия невозможно понять, если не ввести как непременное условие проведения любого серьезного исследования контроль pH, что и было сделано Михаэлисом и его сотрудниками. На самом деле первый шаг в этом направлении сделал несколькими годами ранее Сёренсен 11341, который ввел представление о шкале pH и описал использование буферных растворов в своей классической работе, показавшей, насколько важна концентрация водородных ионов в исследованиях ферментов. Несмотря на разногласия при интерпретации рН-эффектов в ферментативной кинетике, совершенно ясно, что любая попытка провести кинетическое исследование без соответствующего контроля pH бессмысленна. [c.142]

В последнее время работами Хесса с сотрудниками [5—7] на примере а-химотрипсина был развит новый метод изучения кинетики начальных стадий ферментативных реакций, получивший название метода вытеснения профлавина . Метод основан на том факте, что краситель профлавин (3,6-диаминоакридин) при связывании с а-химотрипсином в водном растворе изменяет свой спектр поглощения в ультрафиолетовой области. Величина разностного спектра поглощения, имеющего максимальное значение при длине волны 465 нм, пропорциональна -концентрации комплекса фермент-профлавин. Введение в систему фермент-профлавин субстрата, конкурирующего с красителем за связывание на активном центре а-химотрипсина, приводит к двум последовательным процессам вытеснения профлавина. Первый, очень быстрый процесс, заключается в обратимом вытеснении красителя из комплекса его с ферментом за счет образования нековалентного фермент-субстратного комплекса. Второй процесс, времена прохождения которого лежат обычно в пределах разрешения установок типа остановленной струи , вызван химическим взаимодействием субстрата с ферментом (например, образованием ацилферментного промежуточного соединения), что приводит к дополнительному уменьшению концентрации комплекса фермент-профлавин. Изучение кинетики второго процесса при различных концентрациях субстрата в дополнение к изучению кинетики ферментативной реакции в стационарном режиме позволяет сделать заключения о стадийности изучаемой реакции, а также найти значения констант скоростей промежуточных стадий ферментативной реакции. [c.188]

Ясно, что эти данные могут быть интерпретированы более простым образом, а именно что способ действия фосфорилазы (априорно принятый в цитируемой работе [16] как канонический для неупорядоченного действия фермента) несколько отличается от способа действия р-амилазы, что приводит к различному распределению продуктов деструкции полимерного субстрата по молекулярным массам (степени полимеризации). Как неоднократно указывалос . выше, это наиболее характерный признак действия деполимераз, и в рамках кинетики и субстратной специфичности действия ферментов он обусловлен различной зависимостью кинетических параметров ферментативной реакции от степени полимеризации (длины цепи) олигосахаридов. С точки зрения термодинамики действия деполимераз этот характерный признак объясняется различным числом сайтов в активном центре фермента, различным их сродством к мономерным остаткам субстрата и положением каталитического участка в активном центре. Как видно, и в этом случае введение гипотезы о множественной атаке было излишним и преждевременным, так как экспериментальные данные, полученные авторами работы [16], не были подвергнуты тщательному анализу. [c.91]

Автор допускает возможность существования множественной атаки при действии деполимераз. Более того, он убежден, что этот механизм может играть важную роль в ферментативной деструкции нерастворимых биополимеров, где продвижение адсорбированного фермента по поверхности субстрата происходит с участием периферийных частей белковой (гликопротеиновой) глобулы, что легко представить условно как перекатывание фермента по поверхности нерастворимого субстрата. Наконец, при гидролизе нерастворимых биополимеров важную роль играет своеобразный клеточный эффект , когда молекула фермента последовательно действует на один и тот же участок субстрата, не успевая диффундировать от него на достаточное расстояние и снова адсорбируясь в определенной близости от места предыдущей атаки. Иначе говоря, автор не против множественной атаки, как и других неординарных механизмов ферментативного катализа. Однако в любом случае они должны быть строго обоснованы, и следует обязательно учитывать альтернативные и более тривиальные механизмы. В противном случае и без того сложная картина кинетики и механизмов действия деполимераз дополнительно усложняется введением надуманн 1х-эффектов и необоснованных концепций. [c.104]

Можно, однако, исследовать кинетику ингибирующего действия продукта реакции, не прибегая к предварительному его введению в реагирующую систему, а на основе измерения кинетики са-мотормозящейся ферментативной реакции во времени. Естественно, для этого должна быть использована интегральная форма кинетического уравнения реакции. [c.100]

Теплый прием, оказанный нашему первому учебнику — Биологической химии ,— побудил нас написать эту вторую книгу, рассчитанную на несколько иной круг читателей, но вместе с тем сохраняющую в какой-то степени главные особенности своей предшественницы. Опыт показал, что с успехом пользоваться Биологической химией могут лишь студенты, имеющие хорошую подготовку как по физической, так и по органической химии. Кроме того, эту книгу оказалось довольно трудно приспособить не только для односеместрового, но даже и для более длительного курса обучения, в котором наряду с основным материалом рассматривается значительное количество сведений частного характера, не имеющих] прямого отношения к главным проблемам биохимии. Слабо подготовленные по химии студенты и короткие учебные курсы — явление совершенно обычное, но вряд ли этим можно извинить настолько поверхностное изложение предмета, чтобы студент так и не приобрел в конечном итоге знаний, необходимых для понимания тех проблем, с которыми ему предстоит иметь дело. Учитывая это, мы попытались подготовить своего рода адаптированное издание Биологической химии , которое удовлетворяло бы предъявляемым требованиям. Таким образом, главные различия между Основами биологической химии и Биологической химией касаются не содержания или композиции, а самого подхода к предмету. Математический анализ данных во всех тех случаях, когда он представлялся нам слишком трудным, заменен простым описанием основной упор сделан не на физическую химию макромолекул или кинетику и механизм ферментативных реакций, а на рассмотрение процессов метаболизма и на проблемы молекулярной биологии опущены слишком подробные описания экспериментов и, наконец, для введения студентов в новые области биохимии в меньшей степени используются оригинальные экспериментальные данные. Мы надеемся, что при таких изменениях нам удастся донести материал, составлявший содержание Биологической химии , до новой группы студентов, сделав его понятным и для них. Глубина изложения, разумеется, приносится при этом в жертву как из-за сокращения объема книги, так и потому, что мы вынуждены считаться с возможностями нашей новой аудитории. Однако нам кажется необходимым подчеркнуть, что и в таком новом виде освещение каждого раздела останется достаточно серьезным и глубоким. Читатели старого и нового учебников будут, очевидно, пользоваться разным языком, но общее понимание предмета будет у них приблизительно одинаковым. [c.7]

Для простоты обсуждения механизмов целесообразно введение системы их классификации. В работе Варфоломеева, Наки, Ярополова, Побочина (1981) для описания механизмов сложных химических и ферментативных реакций предложена и использована система, основанная на записи последовательности различных стадий процесса. Важно то обстоятельство, что в стационарном состоянии в уравнение скорости реакции входят лишь параметры лимитирующих стадий и стадий, предшествующих скоростьопределяющей. Быстрые, нелимитирующие стадии процесса, следующие за наиболее медленной, не оказывают влияния на скорость реакции и не проявляются в кинетике процесса. [c.152]

Для выяснения роли ионов металлов в ферментативном катализе было изучено изменение начальных скоростей реакции как функции концентрации субстрата и иона металла. Хотя Малмстрём и Розенберг [3] показали, что реакции образования комплексов Е — М + — субстрат и Е — субстрат — М + для односубстратных систем имеют сходные кинетические уравнения, в случае многосубстратных систем можно определить порядок присоединения иона металла и субстрата по методу Клеланда [59, 60] с введением соответствующих поправок на взаимодействие металл — субстрат. Некоторые примеры с использованием этого подхода будут обсуждаться в следующих разделах (см. также гл. 18). В этой связи необходимо заметить, что часто неудовлетворительной является практика поддержания постоянной и насыщающей концентрации иона металла в ходе изучения кинетики при выяснении влияния порядка присоединения субстрата и (или) отщепления продуктов. Во многих системах незакомплексованный М + действует как активатор или как ингибитор реакции. Более того, в случае слабых комплексов, например MgAДф-, относительная концентрация промежуточных соединений является функцией общей концентрации обоих компонентов комплекса [16]. [c.450]

Другой областью применения гель-хроматографии в биохимии является отделение белков от низкомолекулярных мешающих анализу примесей, например аминокислот, сахаров, стероидов или реагентов, используемых для химической модификации белка. Методом гель-хроматографии чаще всего удаляют реагенты, предназначенные для введения в белок радиоактивной и флуоресцентной меток. Гель-хроматография позволяет также быстрее и эффективнее, чем диализ, осуществить обессолива-ние или смену буфера, требуемые в определенных схемах фракционирования, а также удаление кофакторов и ингибиторов, используемых при изучении кинетики ферментативных реакций. Кроме того, с помощью этого метода можно изучать связывание белков с низкомолекулярными соединениями, например лекарственными веществами, ионами металлов и красителями [10]. Коэффициент распределения Ка некоего стандартного белка с из- [c.106]

Введение новых методических приемов каждый раз поднимало биохимическую науку на более высокую ступень познания закономерностей жизнедеятельности организмов, открывало новые уровни исследования живого. Своеобразной чертой последнего периода в развитии биохимии является широкое применение скоростных методов анализа в соединении с автоматическим контролем. Это в значительной мере облегчает и ускоряет выполнение намечаемых научных программ. В настоящее время полностью автоматизированы количественное определение ряда соединений—аминокислот в белковых гидролизатах, MOHO- и дисахаридов в биологических жидкостях (кровь, моча и др.) выяснение первичной структуры пептидов, белков и нуклеиновых кислот проведение исследований по кинетике ферментативного катализа и при серийных определениях энзиматической активности элементарный анализ природных соединений синтез пептидов, олигонуклеотидов и белков [c.5]