Молекулярные сита полиакриламидный гель

Электрофорез, процесс разделения молекул, основанный на разной скорости перемещения их в электрическом поле, проводят самыми разными способами. Очень небольшое количество раствора, содержащего смесь белков (например, белков сыворотки крови), наносят в виде тонкой полоски на лист фильтровальной бумаги или ацетата целлюлозы. Лист насыщают буфером и пропускают через него электрический ток. Напряжения в несколько сот вольт достаточно для разделения белков сыворотки в течение 1 ч. Для ускорения процесса и снижения диффузии низкомолекулярных веществ широко используют высоковольтный электрофорез. Прикладываемое напряжение составляет в этом случае 2—3 тыс. вольт. Образец постоянно охлаждают с помощью термостатируемых пластин иногда для той же цели всю систему погружают в сосуд с керосином. Электрофоретическое разделение больших количеств материала проводится в плоских лотках, заполненных крахмальным или каким-либо другим гелем. Одним из наиболее распространенных и чувствительных методов разделения белков является электрофорез в колонке, заполненной полиакриламидным гелем. Этот метод, в настоящее время сильно усовершенствованный, позволяет проводить разделение молекул одновременно и по размеру, и по электрическому заряду его называют методом электрофоретического молекулярного сита 127, 128]. [c.164]

Электрофорез в полиакриламидном геле представляет собой один из наиболее удобных методов для анализа смеси белков. Высокая разрешающая способность этого метода определяется тем, что разделение веществ по их электрофоретической подвижности удачно сочетается с эффектом молекулярного сита. Таким образом, скорость движения белковых молекул через гель определяется не только зарядом молекулы, но также ее размерами и формой. [c.32]

Что же произойдет если смесь белков, растворенных в ДСН, подвергнуть электрофорезу в блоке полиакриламидного геля. Каждая молекула белка связывает значительное количество негативно заряженных молекул детергента, общий заряд которых превосходит общий заряд белка. По этой причине белок после того, как будет приложено напряжение, начнет двигаться в направлении положительного электрода. Белки одного размера ведут себя сходным образом, поскольку, во-первых, их природная структура полностью нарушена ДСН так, что их форма идентична, во-вторых, они связывают одинаковое количество ДСН и приобретают одинаковый негативный заряд. Крупные белки, обладающие большим зарядом, подвергаются действию значительных электрических сил, а также более существенном торможению. В обычных растворах эти эффекты, как правило, взаимно погашаются, но в порах полиакриламидного геля, действующего как молекулярное сито, большие белки тормозятся значительно сильнее, чем малые белки. Вследствие этого сложная смесь белков делится на ряд полос, расположенных в соответствии с их молекулярной массой. Окрасив гель красителем кумасси синим, можно выявить основные фракции полипептидов Минорные белки идентифицируют серебрением минимальное [c.215]

С другой стороны, в результате денатурации белки часто приобретают свойства, значительно улучшающие их электрофоретическое разделение. Этот факт используется в тех методах электрофореза, в которых проводят предварительное восстановление белков и комплексирование их с ДСН. Электрофоретическая миграция таких комплексов зависит от эффекта молекулярного сита, свойственного полиакриламидному гелю, и размеров молекул, что создает основу для весьма простого и эффективного метода определения молекулярной массы белков (подробное описание метода см. в гл. И.2). [c.215]

Несмотря на высокую разрешающую способность, электро форез в гелях со свойствами молекулярного сита не нашел ши рокого применения в повседневной клинической практике. Он более трудоемок, чем электрофорез на ацетате целлюлозы или в агарозном геле. К тому же электрофорез в крахмальном или полиакриламидном геле труднее проводить в стандартных условиях. Проблемы стандартизации условий электрофореза в полиакриламидном геле подробно обсуждаются Маурером и Алленом [841]. Разумеется, необходимо сопоставлять стоимость метода с ценностью получаемой с его помощью информации. Основная причина того, что в повседневной практике до сих пор широко используются электрофоретические методы, обладающие ограниченной разрешающей способностью, заключается в следующем пока известна физиологическая роль лишь небольшого числа белков плазмы и те фракции, которые нельзя обнаружить простыми методами, дают мало полезной информации для диагноза. Методы электрофореза с высокой разрешающей способностью имеют исключительно важное значение в исследованиях белков плазмы, и после установления природы и физиологической роли остальных белковых компонентов эти методы, несомненно, займут свое место в клинической практике. [c.333]

В качестве среды для электрофореза нуклеиновых кислот чаще всего используют полиакриламидный гель. Размер пор полиакриламидного геля, а следовательно, и его свойства как молекулярного сита варьируют в широком диапазоне, благодаря чему в этой среде можно разделять нуклеиновые кислоты различной молекулярной массы. Так, например, в гелях, содержащих 2—3% Т, разделяют рибосомные РНК (мол. масса 0,5-10 —2-10 ) в гелях с Т, составляющим около 10%, —транс- [c.370]

В комбинированных гелях, приготовленных одним из описанных выше способов [984], агароза содержится в такой концентрации, которая достаточна лишь для поддержания формы полиакриламидного геля. Таким образом, разделение нуклеиновых кислот в комбинированном геле зависит в основном от свойств полиакриламидного геля как молекулярного сита. Соответственно нуклеиновые кислоты имеют близкие электрофоретические подвижности в комбинированном и чисто полиакриламидном гелях. [c.381]

Полиакриламидный гель заменил крахмальный гель потому, что при его использовании можно контролировать эффект молекулярного сита с помощью изменения концентрации геля, а адсорбция белков в нем весьма мала. Полиакриламид — наиболее эффективный носитель для электрофореза белков и небольших молекул РНК. (Для нуклеиновых кислот, размер молекул которых больше размера пор полиакриламида, лучше использовать агарозу или агарозу — акриламид.) Полиакриламидный гель получается при сшивании акриламида Ы,Ы -метилен-бис-акрила- [c.229]

Родбард и др. [1109] пришли к заключению, что гели с большим числом поперечных сшивок имеют более крупные поры, чем гели, содержащие малые количества сшивающего агента. Поэтому первые можно использовать в тех электрофоретических методах, в которых эффект молекулярного сита полиакриламидного геля нежелателен, например при изоэлектриче-ском фокусировании или нзотахофорезе. [c.76]

В качестве молекулярных сит используются гели, которые не взаимодействуют с исследуемыми веществами. Чаще всего применяются декстрановые (сефадексы О—10, 0—25, (7—75, (7—200), агарозные (сефарозы 2В и 4В, биогели А-0,5 М, А-15 М, А-150 М) и полиакриламидные гели (биогели Р-2, Р-6, Р-150, Р-300) для водных растворов, по-листирольные — для неполярных органических рйстворите- [c.109]

Общие сведения. Электрофорез в полиакриламидном ге 1е, как и другие виды аналогичных исследований, основан на использовании неодинаковой электрофоретической подвижности ралличных белковых фракций. Кроме того, гель играет роль молекулярного сита вещества, имеющие размеры молекул большие, чем диаметр кор геля, проходят чере гель, не проникая внутрь его частиц соединения же, хар0ктсризуюи1иеся размерами молекул меньшими диаметра пор геля, будут проходить гель по порам, и поэтому их. днижение окажется замедленным. Благоднря способности избирательно адсорбировать более мелкие молекулы молекулярное сито позволяет разделить фракции с различным молекулярным весом. [c.38]

Поддерживающей средой для электрофореза могут служить фильтровальная бумага, крахмальный или агаровый гели, аце-тат-целлюлозная мембрана, полиакриламидный гель и т. д. Создаваемое в смоченной буферным раствором поддерживающей среде электрическое поле заставляет различные компоненты смеси белков двигаться в определенном направлении со скоростью, соответствующей заряду молекул, что приводит к их разделению. Если электрофорез происходит в крахмальном или полиакриламидном геле, то разделение зависит не только от заряда, но и от величины и формы молекул, так как в этом случае поддерживающая среда выполняет роль молекулярного сита. При электрофорезе в щелочном буферном растворе белки сыворотки крови разделяются по меньшей мере на 5 фракций. При ионной силе 0,1 и pH 8—9 быстрее всех к аноду движется альбумин. За ним следуют в порядке уменьшения скорости миграции а-1-, а-2-, р- и 7-глобулиновые фракции. Подбирая соответствующую поддерживающую среду и буферный раствор, можно улучшить разделение. Поэтому даже в сравнительно малооснащенной больничной или клинической лаборатории зональный электрофорез позволяет проанализировать белки более детально, чем свободный. [c.10]

Число фракций, на которые разделяется исходный белок при зональном электрофорезе, можно увеличить не только с помощью специальных методов окрашивания. Простая замена буферного раствора или поддерживающей среды дает тот же эффект. Например, при электрофорезе сыворотки на бумаге в буферном растворе трис-ЭДТА получается не пять, а девять белковых фракций [1 ]. Еще лучшее разделение можно получить в поддерживающей среде, которая обладает эффектом молекулярного сита, например в крахмальном или полиакриламидном гелях. Малые размеры пор этих гелей задерживают миграцию высокомолекулярных белков, так как трение при этом увеличивается настолько, что даже большой электростатический заряд их молекул не может компенсировать замедляющего действия поддерживающей среды. Однако в других поддерживающих средах величина белковой молекулы мало влияет на скорость миграции, поскольку эффект увеличения трения обычно компенсируется ее большим электростатическим зарядом. [c.11]

Идеальная матрица должна работать только по принципу молекулярного сита. Сшитые декстраны и полиакриламидные гели нельзя считать идеальными матрицами, и это необходимо учитывать при проведении эксперимента. Во-первых, эти материалы сильно сорбируют пептиды, содержащие остатки ароматических аминокислот (триптофана, тирозина и фенилаланина). При элюировании буферными растворами, содержащими вещества ароматической природы, мочевину или роданид калия, адсорбция несколько снижается, однако полностью не исчезает. Известно также, что адсорбция на сефадексе несколько возрастает при увеличении ионной силы [19], однако удовлетворительного объяснения этому явлению не дано. Во-вторых, матрица содержит небольшое количество карбоксильных групп. Вследствие этого независимо от молекулярного веса пептидов может наблюдаться ускорение компонентов, несущих отрицательный заряд, и удерживание или необратимая адсорбция основных пептидов. Этот эффект подавляется в том случае, если ионная сила буферного раствора превышает 0,02. [c.396]

В 1962 г. Хьёртен и Мосбах [8] выдвинули ряд гипотез, призванных объяснить эффект молекулярного сита, наблюдаемый на колонках с полиакриламидным гелем. Об одной из них упоминалось в предыдущем разделе. В основу другой гипотезы положено предположение (пока не доказанное), что хроматография на молекулярных ситах является разновидностью распределительной хроматографии, где стационарную и подвижную фазы можно рассматривать как компоненты фазовой системы, т. е. должна выполняться формула Брёнстеда [31, 32]. Эту формулу можно записать в следующем виде [c.240]

Изоэлектрическое фокусирование в геле имеет определенные преимущества по сравнению с ИФ в среде со стабилизованным градиентом плотности. Эти преимущества состоят в следующем 1) сокращается длительность разделения 2) полностью подавляется термическая конвекция 3) применяется простое оборудование для ИФ 4) возможно одновременное разделение нескольких образцов 5) возможно обнаружение с помощью различных красителей и различных методик 6) возможно объединение ИФ и зонного электрофореза в двухмерном варианте 7) достаточно небольшого количества образца 8) возможно обнаружение белков методом иммунодиффузии. Однако при применении геля возникают проблемы, связанные с молекулярноситовым эффектом, который имеет место в основном при разделении больших молекул. Другой недостаток метода — это низкая точность определения pH в зонах. В настоящее время этот метод (сокращенное обозначение ИФПАА или ПАГИФ) является общепринятым и широко используется. В отдельных случаях, согласно данным [73], при проведении дискретного трубчатого электрофореза в полиакриламидном геле доо пска-ется окрашивание. Для снижения молекулярно-сито<вого эффекта рекомендуется [23] концентрация геля 3,7%. Типичный градиент напряжения для 8-часового разделения составляет 200 В на 60 мм. Если тепло отводится, то напряжение можно увеличить и соответственно сократить длительность разделения. Градиент pH можно измерить после разрезания столбиков с гелем и последующего элюирования сегментов небольшим коли- [c.323]

Наряду с ионообменной хроматографией для разделения белков широко применяют зонный электрофорез, основанный на различной подвижности заряженных белковых молекул в поле постоянного тока. Обычно деление происходит при прохождепии тока через буферный раствор, содержащий смесь белков, причем используется как электрофорез в растворе так и электрофорез на носителях. Для быстрого предварительного анализа белковой смеси удобен бумажный электрофорез В препаративных целях используют электрофорез в блоке В качестве носителя в этом случае можно применять крахмал, стеклянный и целлюлозный порошки, поливинилхлорид. Наибольшей разрешающей способностью для белков обладает электрофорез в геле По-видимому, здесь играет роль не только заряд частиц, но и их величина, т. е. гель действует и как опорная среда, и как молекулярное сито. Наряду с крахмальным используют агар-агаровый и полиакриламидный гели. [c.20]

Самый простой способ обеспечения стабильности электрофоретических зон заключается в том, что в среду для электрофореза вводят вещества, образующие капиллярную структуру. Ан-тиконвекционные свойства такой системы весьма высоки, если площадь поперечного сечения капилляров достаточно мала, так как в канале круглого сечения скорость потока снижается пропорционально четвертой степени радиуса. В качестве поддерживающей среды чаще всего используются фильтровальная бумага, пленки из ацетата целлюлозы, колонки или блоки целлюлозного порошка, гранулированный крахмал или гранулы поливиниловых полимеров, а также агаровый, агарозный, крахмальный или полиакриламидный гели. Зональный электрофорез в поддерживающей среде имеет ряд важных преимуществ. При его проведении можно использовать какой-либо простой и сравнительно недорогой прибор и анализировать одновременно несколько различных препаратов. Процедуры визуализации зон и выделения фракций осуществляются довольно легко. Вещества, обладающие биологической активностью, можно выявить непосредственно на электрофореграммах. Метод легко приспособить как для крупномасштабного разделения веществ, так и для микроразделения. Удается достигнуть очень высокой разрешающей силы, особенно в среде, характеризующейся одновременно антикон векционными свойствами и эффектом молекулярного сита. [c.34]

Полиакриламидный гель служит при электрофорезе не только поддерживающей средой, но и сам принимает активное участие в процессе разделения макромолекул благодаря так называемому эффекту молекулярного сита. Многими экспериментами было доказано, что чем выше концентрация акриламида, тем 1 еньше средний размер пор в геле. [c.78]

Результаты, получеиные из анализа графика Фергюсона, позволяют выбрать наиболее перспективный метод для разделения компонентов данной смеси. Если мы имеем дело с изомерами, имеющими одинаковые размеры, то следует применягь. методы разделения по заряду, например электрофорез или понообмениую хроматографию. Если же молекулы различаются-по размеру, но не по заряду, то целесообразно использовать гель-фильтрацию или препаративный электрофорез в полиакриламидном геле, основанные на эффекте молекулярного сита. Метод анализа соотношений размер — заряд у белков был распространен также и на случаи связывания ими лигандов [539]. [c.85]

С тех пор как полиакриламидно-агарозные составные гели были предложены [984, 1324] в качестве поддерживающей среды при исследовании полимеров с очень высокой молекулярной массой, эти гели часто используются при изучении нуклеиновых кислот и нуклеопротеидных частиц. Разделение в них также зависит от размеров н заряда макромолекул. При этом агароза лишь улучшает механические свойства разбавленного полиакриламидного геля и не влияет существенно на свойственный ему эффект молекулярного сита. [c.90]

Концентрирующий гель можно с успехом использовать в препаративной колонке (для которой иногда требуются большие количества геля), чтобы устранить нежелательные эффекты, вызванные наличием солей и отсутствием преэлектрофоре-за [1184]. Концентрация этого геля должна быть такой, чтобы белки до. вхождения в разделяющий гель подверглись предварительному фракционированию в соответствии с размерами их молекул. Подобным способом можно предотвратить закупоривание разделяющего геля концентрированным раствором белков. Если же исследуемая проба очень разбавлена, то рекомендуется применить более разведенный концентрирующий гель,, не обладающий свойствами молекулярного сита. Это даст возможность сконцентрировать белковые компоненты ири помощи изотахофореза. Таиим образом, концентрирующий гель играет довольно существенную роль при препаративном электрофорезе в полиакриламидном геле. [c.115]

Для изотахофореза белков желательно испольэовать узкие трубки и проводить его в полиакриламидных гелях, не проявляющих по отношению к исследуемым веществам свойства молекулярного сита. Изотахофорез обладает почти таким же хорошим разрешением, как и диск-электрофорез или изоэлектрическое фокусирование. Изо-тахофореграммы белковых смесей очень похожи на картины изоэлектрофокусирования [1116], так как компоненты таких смесей в кислотной системе разделяются главным образом в результате различий в значениях их ИЭТ [501]. Преимущество же изо тахофореза заключается в том, что в отличие от изо- [c.175]

В данном методе используют эффект молекулярного сита, свойственный полиакриламидным гелям различной концентрации. Чтобы улучшить разрешение, рекомендуется на первом этапе проводить электрофорез в геле с низкой концентрацией полиакриламида, а на втором — электрофорез в градиенте концентрации полиакриламида. Такие системы были применены при разделении белков сыворотки крови [821, 1452]. Марголис и Кенрик 821] для электрофореза в первом направлении использовали 2,7%-ный гель, а Райт [1452]—4,75%-ный. Электрофорез во втором направлении проводили в градиенте концентрации 4—20%-ного 1[821] или 2—30%-ного [1452] полиакриламида. Применение в первом направлении 2,7%-ного полиакриламидного геля [821] улучшало разделение белков с большой молекулярной массой, тогда как при электрофорезе во втором направлении разделение было лучше при использовании более крутого градиента [1452]. Об эффективности указанных методов свидетельствует то, что при разделении с их помощью белков сыворотки человека на электрофореграмме было обнаружено более ста зон [1452]. [c.229]

В исходном методе Кальтшмидта и Уитмена [654] разделение рибосомных белков в первом направлении проводили при pH 9,6 или 8,6 в стеклянных трубках длиной 180 мм и диаметром 5 мм. Образец белка (1—4 мг) помещали в середину трубки, включая его в слой геля, образующегося путем фотополимеризации. В этих условиях одни рибосомные белки мигрировали к катоду, а другие — к аноду. Использованный на первом этапе 8%-ный полиакриламидный гель не обладал сколько-нибудь заметным свойством молекулярного сита. По окончании электрофореза примерно через 36 ч гели извлекали из стеклянных трубок и вымачивали в ацетатном буфере для стартового геля,, применяемом при электрофорезе во втором направлении. Этот [c.312]

Для электрофореза гемоглобинов широко используют также крахмальный и полиакриламидный гели. При разделении разных форм гемоглобина характерный для этих гелей эффект молекулярного сита не играет никакой роли, в то же время их превосходные стабилизирующие свойства имеют очень важное значение, так как благодаря этим свойствам диффузия в гелях ограниченна, что облегчает разделение компонентов, лишь слегка различающихся по электрофоретической подвижности. Для повседневных анализов гемоглобинов рекомендуется использовать систему трис-борат-ЭДТА, а для разделения минорных гемоглобинов с низкой подвижностью лучше применять неоднородную систему трис-цитрат-ЭДТА [334]. Для обнаружения аномальных метгемоглобинов все присутствующие в образце гемоглобины переводят в восстановленную форму и затем проводят электрофорез при pH 7,0—7,1 [430]. Гемоглобин Н можно отделить от гемоглобина Барта и гемоглобина I с помощью электрофореза в фосфатном буфере при pH 7,7 (это значение pH является критическим) [592]. [c.323]

Необходимо отметить, что метод электрофореза белков сыворотки в крахмальном и однородном полиакриламидном гелях имеет некоторые недостатки. Они связаны с тем, что размеры и заряд молекулы белка нередко оказывают противоположное влияние на его подвижность. Это приводит к тому, что аран-титрипсин сливается с альбумином (в средах, не обладающих свойствами молекулярного сита, он отделяется от альбумина), а церулоплазмин, гемопексин и другие важные компоненты перекрываются другими белками и не образуют четких зон [371, 716]. Высокомолекулярные а- и р-глобулины часто сливаются с широкой зоной иммуноглобулинов. Однако эти недостатки можно устранить путем использования градиентов концентрации геля. С помощью таких методов некоторые авторы доби- [c.332]

При нейтральных и щелочных значениях pH в полинуклеотидах отношение заряда молекулы к ее массе является постоянной величиной [1085, 1087]. Поэтому полинуклеотиды нельзя фракционировать на основе различий в их зарядах [940]. Введение в практику электрофореза поддерживающих сред, обладающих свойствами молекулярного сита, позволяет проводить фракционирование полинуклеотидов в зависимости от размеров их молекул. В ряде работ [778, 857, 1085] было показано, что электрофоретическая подвижность нуклеиновых кислот в полиакриламидном геле обратно пропорциональна их коэффициентам седиментации. Аналогичные данные были получены и при электрофорезе в агаровом геле [498]. Левицки и Сински [762] установили, что электрофоретическая подвижность полинуклеотидов линейно зависит от логарифма коэффициента седиментации (в единицах Сведберга). Поскольку коэффициент седиментации пропорционален квадратному корню из средней молекулярной массы нуклеиновых кислот, должна существовать обратная зависимость между относительной подвижностью и логарифмом молекулярной массы. Этот вывод был подтвержден экспериментальным путем [123, 778, 984, 1099]. [c.390]

Молекулярное сито. Свойствами молекулярного сита обладает применяемый в гель-электрофорезе полужесткий носитель (гель) такие его сюйства способствуют разделению смесей заряженных макромолекул, например белков, которые различаются не только по электрофоретической подвижности, но также формой и размерами. Гели состоят из беспорядочно переплетающихся молекулярных цепей, распределенных по всему объему геля и образующих ситоподобную структуру. В соответствии с конкретными требованиями разделения размер пор гелей можно варьировать в некоторых пределах. Принцип действия молекулярного сита в агаровом, крахмальном и полиакриламидном гелях заключается в том, что крупные молекулы движутся сквозь него тем медленнее, чем меньше размер пор, который определяется числом поперечных сшивок в геле. При использовании гелей типа сефадекса ситуация обратная— в соответствии со спецификой их природы миграция малых молекул тормозится сильнее, чем крупных (разд. 3.7.2). [c.119]

Электрофорез нуклеиновых кислот в полиакриламидном и по-лиакриламид-агарозном гелях. При электрофорезе нуклеиновых кислот основным фактором разделения является эффект молекулярного сита, поскольку отношение заряд/масса приблизительно одно и то же для всех полинуклеотидов. Следовательно, [c.232]