Ферменты коэффициент диффузии

Рабочей частью химического реактора является колонка заполненная гранулами фермента, иммобилизованного в геле полиакриламида [Е]о=1 10 М). Через колонку пропускают раствор субстрата в концентрации 1-10- М. Ферментативная реакция, в растворе характеризуется параметрами кат=Ю сек-, /Ст(каж)= = 0,1 М. Каков должен быть размер гранул иммобилизованного фермента, чтобы диффузия не играла существенной роли в ферментативной реакции, если коэффициент диффузии субстрата в геле равен 10- см сек. [c.275]

При работе с биологически активными веществами (ферментами, антибиотиками) иногда определяют коэффициент диффузии по скорости проникновения биологической активности из раствора в растворитель через пористый диск, назначение которого заключается в предотвращении конвекционного переноса (Нортроп). Метод пористого диска значительно менее точен, чем оптические методы измерений величины О, но он не требует выделения исследуемого вещества в чистом виде, что иногда удобно при работе с биологически активными веществами. [c.29]

Кроме того [24], радиус действия радикалов вводных растворах ферментов Р= не превышает 30 А. В жидкой воде это соответствует коэффициенту диффузии /) = 2-10 см /сек и средней длительности жизни радикалов =10 сек. [c.129]

Ясно, что коэффициент диффузии D и величина связаны друг с другом. Установить связь между ними прямо из условия 5(л ) > >0 не удастся, т. к. нельзя аналитически решить уравнение с граничными условиями 5(0) =So, d5/dx =,=0. Попытаемся хотя бы грубо оценить необходимую величину кг через D. Если предположить, что 8 х) Кш, т. е. молекулы фермента в достаточной мере обеспечены субстратом, то кривая S x) на рис. 9 пройдет ниже кривой 5i(a ) и выше кривой 52(х), которые удовлетворяют [c.80]

Внешнедиффузионное торможение. К поверхности частицы носителя примыкает неперемешиваемый слой жидкости, в пределах которого перенос молекул происходит исключительно за счет молекулярной диффузии. Поскольку молекулярная диффузия в жидкостях проходит очень медленно (с коэффициентом диффузии 10 —10 см /с), массоперенос может стать лимитирующей стадией процесса, катализируемого иммобилизованным ферментом. [c.102]

При элюции 90% каждого компонента обычно выходит в объеме, составляющем 8—10% общего объема колонки, причем размывание пиков зависит в некоторой степени от положения пика элюции. Первые фракции, содержащие самые крупные молекулы, быстрее проходят через колонку и поэтому в меньшей степени подвержены эффектам турбулентности. Следовательно, размывание пика будет тем меньше, чем раньше выходит фракция. Кроме того, молекулы меньших размеров имеют более высокий коэффициент диффузии, что приводит к дополнительному размыванию. Идеализированный профиль элюции, отражающий эту ситуацию, показан на рис. 5.7. Если молекулы нужного фермента имеют небольшие размеры, то его пик будет в большей степени размываться при элюции и с большей вероятностью будет загрязнен белками сходных размеров. Если же фермент элюируется вначале, то пик будет острее, но при наличии большого количества высокомолекулярных примесных белков вполне вероятно, что они будут перекрываться с фракцией фермента (рис. 5.8). Таким образом, интервал фракционирования следует выбирать, принимая во внимание как размеры основных загрязняющих молекул, так и величину молекулы выделяемого фермента. [c.207]

Рассмотрим следующую модель. Имеется плоская мембрана, толщина которой равна I и площадь поверхности А, содержащая иммобилизованный фермент с концентрацией в мембране [Е]о. Мембрана погружена в раствор субстрата, концентрация которого равна [S]o. Коэффициент распределения субстрата между раствором и мембраной равен Р. Требуется найти зависимость между скоростью появления продукта в растворе и кинетическими параметрами ( кат И /Ст(каж)) ферментативной реакции. Подробный анализ этой модели приводится в работах [4, 5]. Если скорость ферментативной реакции мала по сравнению со скоростью диффузии и концентрация фермента мала по сравнению с концентрацией субстрата, начальная скорость ферментативной реакции на единицу объема мембраны будет равна [c.268]

В работе [17] исследовали гидролиз о-нитрофенилового эфира р-О-галактопиранозида под действием р-галактозидазы (мол. вес 540000), иммобилизованной в 15%-иом геле полиакриламида. Эксперимент проводили следующим образом в раствор субстрата ([3]о= 1,66-10 2 М) помещали пластинку определенной толщины, вырезанную из куска геля, с равномерно распределенным в ней ферментом, и регистрировали реакцию по образованию в растворе о-нитрофенолят-иона. Ферментативная реакция, катализируемая ферментом в гомогенном водном растворе, характеризуется значениями /гкат = 273 сек- Лт(каж)= 1,73-Ю М. Коэффициент распределения субстрата между водой и гелем равен единице, коэффициент диффузии субстрата в геле равен 1-10 см /сек. [c.274]

Кинетика гидролиза этилового эфира Ы-ацетил-Ь-тиро-зина, катализируемого а-химотрипсином, иммобилизованным в геле агар-агара, изучалась согласно методике, описанной в предыдущей задаче. Концентрация фермента в геле равна 1-10- М, концентрация субстрата в растворе равна 1-10- м. Коэффициент диффузии субстрата в геле агар-агара в условиях опыта равен 2-10- см7оек. Найти, при какой толщине пластинки геля реакция будет полностью (с ошибкой не более 5%) контролироваться диффузией, если кинетика ферментативного гидролиза в гомогенном [c.274]

Имеется раствор фермента с молекулярным весом 100000 Плотность фермента в кристаллическом состоянии равна 1,25 г/см . С помощью критерия Тиле оценить, при каких значениях кат/ 7п(каж) реакция ферментз с нейтральной молекулой субстрата небольшого размера начнет зависеть от диффузии, если коэффициент диффузии субстрата в растворе равен 3-10- см /сек. В расчетах учесть, что в растворе объем молекулы белка за счет гидратации увеличивается примерно на 30%. [c.275]

Диаметр частиц ферментов находится в пределах 1—ЮОжж/с, т. е. Лежит в коллоидной области. Следует учесть, что форма белковой молекулы фермента может быть различной. Так, например, коэффициент диффузии лактодегидразы при 20°С О = = 5,3 10- см 1сек) больше, чем у дегидразы (6 = 2,54 /0- см 1-сек), хотя молекулярный вес последней, как указывалось-выше, в 7 раз больше, чем у первой. [c.249]

Величину М необходимо определить с помощью статического или динамического эксперимента. При этом следует обратить внимание на обычно наблюдающееся постепенное снижение скорости межфазного обмена на ионитах с ограниченной проницаемостью для изучаемых крупных ионов. Опыты показывают, что значение коэффициентов диффузии в зерне сорбентов постепенно падает от 10" (10" ) до 10" (10 ) см /с. Для завершения процесса на зернах радиусом 200—300 мкм в этих системах требуется 5— 10 (20) ч. Степень ошибки в определении величины с при этом не превосходит нескольких процентов, что не искажает теоретического анализа препаративных, а тем более производственных процессов. Следует учитывать к тому же, что степень индивидуальности используемых для экспериментальной работы ионов антибиотиков, алкалоидов, гормонов и ферментов, как правп.по, не достигает 95—97 %, а чаще (особенно для белков, даже кристаллических) оценивается еще меньшей величиной. Естественно, возникает здесь и вопрос об оценке равновесия, которое может быть как истинным, так и метастабильным. [c.88]

Анализ [304] стационарного состояния приэлект-родного слоя показал, что стационарная концентрация продукта прямо пропорциональна [5] о только при условии [5]о С Кт и при постоянстве таких факторов, как коэффициенты диффузии субстрата и продукта в ферментном слое, коэффициенты массопере-дачи, активность фермента в ферментном слое, коэффициенты распределения субстрата и продукта между раствором и ферментным слоем, толщина мембраны. Все эти факторы в общем случае непостоянны—они зависят от состава исследуемого раствора и времени жизни иммобилизованного фермента. Этим, по-видимому, можно объяснить отклонения углового коэффициента калибровочных кривых от теоретического значения для некоторых ферментных электродов. По мере потери активности ферментом наблюдается уменьщение углового коэффициента калибровочных кривых и изменение абсолютных значений [c.137]

Метод стационарного состояния основан па интегрировании уравнения (1) (первый закон Фика), Измеряют скорость переноса растворенного вещества из одной камеры в другую через тонкую трубку или чаще через пористую стеклянную пластинку. Такой метод особенно удобен, если Ихмеется чувствительный метод анализа растворенного вещества, например в случае ферментов. Но в целом эта группа методов не является абсолютной и требует калибровки с помощью веществ с известным коэффициентом диффузии. [c.395]

N-6-7. Это в общем типично для ферментативных процессов. Оказывается, что в обычных условиях среднее время образования такой активной конфигурации составляет т 10 - 10 " с , что совпадает с временами оборота фермента в условиях субстратного насыщения. В растворе для аналогичной реакции это время намного больше даже при больших коэффициентах диффузии. Причина состоит в том, что, попав в ограниченную область в плотноструктурированной среде, функциональные группы "находят" друг друга и сближаются на короткие расстояния раньше, чем они "разбегутся" в разные стороны, как это происходит в растворе. Вместе с тем величина т 10 - 10 " с намного больше, чем времена релаксаций отдельных групп, что является следствием достаточно жестких стерических условий для протекания реакции. Увеличение числа функциональных групп и необходимых одновременных контактов между ними увеличивает время достижения многоцентровой активной конфигурации. Общая скорость ферментативного катализа определяется именно временем образования нужной конформации при спонтанном сближении соответствующих групп в активном центре. Последующие за этим электронные взаимодействия происходят гораздо скорее и не лимитируют общую скорость катализа. [c.129]

Согласно данным, полученным с помощью электронного микроскопа, фермент стрэйтаза (гипотетический) представляет собой вытянутый эллипсоид вращения с отношением осей, равным 20. После титрования его избытком п-хлормеркурибензоата (ПХМБ) коэффициент седиментации уменьшился в 1,58 раза, хотя и до и после титрования наблюдается всего одна седиментирующая зона. Коэффициент диффузии увеличился после титрования в 2,52 раза. [c.266]

В методе САФ тонкий слой забуференного раствора фермента в начале опыта (при скорости вращения ротора 1000— 2000 об/мин) наслаивается на однородный раствор субстратов-в том же буфере, но с добавленным низкомолекулярным веществом. Стабилизация достигается также с помощью градиента плотности, но в этом случае он образуется уже после наслоения благодаря диффузии низкомолекулярного вещества в слой — полосу с ферментом. Для эффективного протекания этого процесса самогенерации градиента в качестве низкомолекулярных веществ применяют нейтральную соль, D2O, глицерин и т. п., но не сахарозу, у которой для таких опытов недостаточно велик коэффициент диффузии. [c.177]

В растворе) контролируется диффузией. При уменьшении коэффициента диффузии вдвое время, требуемое для завершения данного процесса, удваивается, и, так как коэффициент диффузии для каждой данной молекулы зависит как от температуры, так и от вязкости среды, оба этих фактора имеют большое значение. Традиционно ферменты считаются настолько лабильными, что во время их выделения всегда стремятся поддерживать температу1ру около О °С большинство препаратов все еще получают при низких температурах. В то же время существует много (а возможно, и большинство) ферментов, которые обладают высокой устойчивостью к денатурации (кроме денатурации, происходящей в условиях фракционирования белков органическими растворителями) при комнатной температу1ре, особенно когда на фракционирование уходит относительно мало времени. Есл1и разница между температу рой холодной комнаты и средней температурой лаборатории составляет 20 °С, то это значит, что скорости химических реакций увеличатся в лаборатории в три-четыре раза. При 25 °С любая реакция окисления, протеолиз или какой-либо другой вредный для фе рментов процесс, кроме денатурации, происходят намного быстрее, чем при 4— 5 °С, однако из тех же соображений можно ожидать, что при любой процедуре фракционирования для достижения равновесия при 25 °С потребуется меньше времени. Это, имеет особое значение для колоночных методов, так как максимальная скорость опб раций на ионообменных или гель-фильтрующих колонках определяется скоростью достижения равновесия происходящих во время хроматографии П роцессов. Если коэффициент диффузии для белка в растворителе при 5 С в четыре раза ниже, чем при 25 °С, то и скорость потока через колонку должна быть в четыре раза меньше. Однако вязкость воды при 5 °С [c.263]

В 1,8 раза выше, чем при 25 °С уменьшение коэффициента диффузии при более низких температурах обусловлено главным образом повышением вязкости раствора. Поэтому более вероятно, что коэффициент диффузии уменьшится в два раза, а не в четыре. Таким образом, вследств1ие того, что скорость потока снижается вдвое, а скорость инактивации фермента — в четыре раза, желательно проводить все операции с ферментами на холоде. Многие исследователи, работающие с ферментами, спокойно оставляют раствор на холоде на ночь, но считают совершенно недопустимым оставлять его при комнатной темпе-рату ре на час или около того. Однако хранение ферментного раствора в течение 4—5 ч при комнатной температуре эквивалентно хранению его на холоде в течение ночи если нет уверенности в стабильности полученного препарата, то лучше не делать ни того ни другого, если только такое выдерживание ферментного раствора не является частью процедуры фракционирования. [c.264]

Рассмотренные теоретические модели важны для разработки биосенсоров, поскольку они позволяют выделить ряд подходов к обеспечению оптимальных условий для катализа любой заданной реакции [4]. Элбери и Хиллман [4] выделяют два различных подхода соответственно для случаев S/ " и LS/ . В случае протекания реакции на межфазной границе (S/ ") для того, чтобы модифицированный электрод обладал заметными каталитическими свойствами, значение / j (константа скорости гомогенной медиаторной реакции второго порядка) должно быть больше 10" дм -моль -с . В этих условиях реакция протекает на границе слой/раствор, и поэтому толщина слоя не имеет значения. На практике же, чем толще слой, тем более вероятно, что транспорт электронов через него будет затруднен, так что разумно использовать монослойный электрод. С другой стороны, при протекании реакции в слое (LS/ ) толщина последнего имеет большое значение. В идеале толщина слоя должна равняться толщине реакционной зоны Zl, а /с2 должна быть больше 10 дм -моль с Ч Неудивительно, что в данном случае требуется значение / j меньше, чем в предыдущем, поскольку теперь в реакции принимают участие значительно большее число каталитических центров. Однако для реализации этого преимущества коэффициент диффузии субстрата в слое должен быть достаточно велик (Dy 10" см с ). Это в свою очередь предполагает довольно открытую, пористую структуру слоя, что серьезно осложняет разработку слоистых электродов для катализа биоэлектрохимических редокс-реакций, особенно с участием больших молекул, например редокс-ферментов. [c.180]

Изменения активности некоторых белков коррелируются, как правило, с изменениями ряда физических свойств. Так, изменение формы белковой молекулы можно установить по изменению некоторых гидродинамических характеристик (например, коэффициента трения, инкремента вязкости), по изменению светорассеяния, поверхностных свойств, диффузии через полупроницаемые мембраны и скорости седиментации [90]. Изменения термодинамических свойств (энтальпии и энтропии), объема, растворимости, оптического вращения, поглощения в инфракрасной области, дифракции электронов, а также некоторые другие характеристики, приведенные Каузманом [90], используются для Оцейки изменений формы белковых молекул. Большинство этих измерений было проведено па макромолекулах неизвестной структуры, для которых не была установлена последовательность аминокислотных остатков. В настоящее время благодаря усовершенствованию методов деградации белков, аналитического определения Концевых групп, методов разделения и идентификации отдельных фрагментов можно успешно изучать белки с молекулярным весом порядка 20 ООО. Хотя эта работа еще не достигла молекулярного уровня, тем не менее она дает возможность лучше использовать значения физических констант белковой молекулы известной структуры для объяснения механизма взаимодействия фермента с субстратом. Структура такого белка, как фиброин (белковое вещество натурального шелка), в настоящее время хорошо изучена благодаря сравнению рентгенограммы и ИК-спектров нативного волокна с рентгенограммами [35, 38, 108, 140] и ИК-спектрами [168] небольших фрагментов белка известной структуры, полученных при деградации, а также синтетитегаихпмшнептидо [c.386]

Химическое сопротивление, как уже говорилось в гл. IV, является функцией света и температуры. Однако два эти фактора воздействуют на совершенно разные участки фотосинтетической химической системы. Скорости фотохимических реакций, как правило, почти не зависят от температуры общее количество образующихся в таких реакциях продуктов прямо пропорционально количеству поглощенного света, т. е. произведению интенсивности света на время. С другой стороны, скорости обычнык химических реакций (иногда называемых темповыми реакциями, потому что они не зависят от света) заметно изменяются с температурой, увеличиваясь обычно в 2—3 раза при каждом повышении температуры на 10° С (то же справедливо и для реакций, катализируемых ферментами, хотя и в более узких температурных пределах, зависящих от свойств данного фермента). Это отношение (отношение скорости при (0°+1О°) к скорости при 0°) называется температурным коэффициентом и обозначается через Ою- Отметим попутно, что Рю для таких физических процессов, как диффузия, равен приблизительно 1,1. Для фотохимических реакций, которые от температуры не зависят, Qio равен 1,0. Таким образом, величина Сю дает ключ к распознаванию типа исследуемого процесса, но только при условии, если у нас есть уверенность в том, что полученная в результате измерении величина не является усредненным значением Qlo для ряда процессов различных типов. При измерении скорости фотосинтеза -такое затруднение может встретиться. Обойти его удается в том случае, если сопротивление какой-либо из стадий процесса настолько велико по сравнению с сопротивлениями других стадий, что именно оно главным образом и лимитирует скорость всего процесса в целом. [c.195]

Подобрать такой рН-индикатор весьма не просто. Кроме того, при высокой скорости вращения ротора любой индикатор неизбежно во время опыта перераспределится в ультрацентрифуж-ной ячейке в соответствии со своими коэффициентами седиментации и диффузии, что в большей или меньшей степени исказит абсорбционную седиментограмму. Все это побуждает применять-в опытах с ферментами, которые сами не изменяют оптической плотности реакционной среды, сопряженные фермент-субстратные системы, подобранные так, чтобы выполнялись оба указанные условия. Пример такой системы будет приведен в разделе Некоторые результаты применения метода САФ . [c.179]