Ферменты седиментации

Правильная ориентация активированных аминокислот на матричной РНК—м-РНК достигается в частицах с молекулярной массой около 3-10 —так называемых рибосомах. На поверхности рибосомы определенные участки фиксируют в оптимальном расположении активированные аминокислоты (включающие и т-РНК, и м-РНК) и продукт реакции, т. е. белковую цепочку. Для синтеза кроме особых ферментов требуется еще присутствие ионов магния. Рибосома — двойная частица рибосома кишечной палочки имеет общий размер около 20,0 нм, причем одна из составляющих рибосому частиц примерно в два раза больше другой свойства этих частиц (константы седиментации) не вполне одинаковы. Оба типа частиц содержат РНК и белки в основном структурного типа. Матричную функцию выполняют лишь м-РНК, доля которой от общего содержания РНК в рибосомах довольно мала (несколько процентов). [c.392]

На рис. 20.8 приведены теневые фотографии для опыта с ферментом фумаразой в ультрацентрифуге, имеющей скорость 50400 об/мин. Обе нижние фотографии сделаны через 35 и 70 мин после верхней. При наличии дополнительных компонентов с различными скоростями седиментации на фотографии появятся дополнительные пики. Поэтому ультрацентрифуга используется в анализе сложных смесей, например плазмы крови. [c.614]

Поразительная специфичность действия ферментов привела к созданию теории замка и ключа, согласно которой для протекания реакции необходимо точное структурное соответствие между субстратом и активным центром фермента. Проведенные эксперименты убедительно доказали адекватность этой идеи, однако сама теория претерпела существенное изменение. Считается, что если фермент — это замок , а субстрат — ключ , то введение ключа в замок часто индуцирует конформационные изменения в молекуле белка. Имеется множество работ, в которых показано, что фермент укладывается вокруг субстрата, обеспечивая более точное соответствие подгоняемых структур. В пользу этого говорят данные по изменению спектров кругового дихроизма, спектров поглощения в УФ-области и констант седиментации, а также результаты исследования структуры комплексов ферментов с ингибиторами методом рентгеноструктурного анализа. Как мы уже видели ранее (гл. 4, разд. Д, I), идея индуцированного соответствия оказывается весьма плодотворной и при обсуждении взаимодействий субъединиц. [c.42]

При малых ионных силах РНК-полимераза — димер с м. м. около 10 и константой седиментации 23 S. При ионных силах, больших 0,1 М, фермент обратимо распадается на два мономера 13 S. Мономер 13 S состоит из четырех субъединиц (м. м. 15 000), (165000), двух а (по 40 000) и а-фактора (80000). Сложное строение полимеразы связано с многообразием функций этого фермента. [c.266]

При низких ионных силах РНК-полимераза является димерным ферментом с молекулярным весом, несколько меньшим 10 и константой седиментации 23 5. При ионных силах, больших 0,1 М, фермент обратимо распадается на два мономера 215 2-13 5. Показано, что мономер 13 5 является ферментативно активной формой [35], но относительно димера 21 5 мнения расходятся (см. [14]). [c.565]

Велик и сотрудники [39, 76] использовали аналитический метод для изучения взаимодействия между ферментами В и ко-ферментами А. Две пробирки для центрифугирования, содержащие одинаковые концентрации А в присутствии и в отсутствие В, центрифугировались до тех пор, пока большая часть фермента не осела на дно пробирки. Было сделано предположение, что при седиментации равновесие не смещалось, и поэтому можно было рассчитать концентрацию свободного кофер-мента по разности общих концентраций А в верхнем слое жидкости в каждой пробирке. [c.386]

В табл. 26 перечислены 29 ферментов, молекулярный вес которых был установлен с помощью гель-хроматографии. Расхождения с данными, полученными с помощью методов, основанных на седиментации и диффузии, в большинстве случаев очень незначительны. [c.174]

Мочевина или гуанидингидрохлорид вызывают обратимую диссоциацию р-галактозидазы на четыре компонента, которые, судя по измерениям диффузии и седиментации, должны быть одинаковыми по размеру (М компонента около 130 000, а М нативного фермента 518 000) [79]. Были получены гибриды легких молекул этого белка ( С, Ы) и тяжелых молекул ( С, Н) й сопоставлены их плотности при центрифугировании в градиенте [c.402]

Взаимодействующие системы- могут быть исследованы количественно также с помощью аналитической ультрацентрифуги, если за связыванием лиганда можно проследить с помощью абсорбционной оптической системы [105, 107]. На рис. 9 представлены седиментационные диаграммы серии опытов с различными смесями НАД-Н (ДПМ-Н) лактатдегидрогеназы. Диаграмма, относящаяся к раствору НАД-Н (слева), показывает, что весь материал, поглощающий свет при длине волны 340 нм, мигрирует медленно, тогда как после добавления фермента часть или весь кофермент, в зависимости от концентрации фермента, седиментирует с тем же коэффициентом седиментации, что и нативный фермент. Из распределения поглощения света в кювете ультрацентрифуги в процессе седиментации можно рассчитать концентрацию связанного и свободного кофермента на основе этих данных рассчитывается среднее число связанных с ферментом молекул кофермента и по уравнению (3)—число связывающих, участков и константы диссоциации. [c.409]

Растворимая РНК играет роль адаптера и переносчика аминокислот. Поэтому ее называют также транспортной РНК. На ее долю приходится около 10% клеточной РНК. Каждая аминокислота имеет, помимо своего собственного специфического активирующего фермента, по меньщей мере одну специфическую 5-РНК. Коэффициент седиментации 5-РНК равен примерно [c.371]

Изменение (повышение) pH экстракта ферментов до 8,2— 8,6 путе.м добавления аммиака или едкого натра вызывает образование изоэлектрического состояния многих входящих в вытяжку неактивных белковых соединений, в результате чего резко уменьшается их устойчивость, т. е. растворимость. Происходит агрегация молекул этих белков с последующей седиментацией их. [c.72]

Для определения чистоты (или гомогенности) ферментных препаратов в настоящее время наиболее широко используются ультрацентрифугирование и диск-электрофорез. В основе первого из них лежит различная скорость седиментации в ультрацентрифуге белков с различной молекулярной массой (и различной формой молекул). Одним из ограничений данного метода является то, что разные белки могут иметь одну и ту же величину седиментации и не разделяться при ультрацентрифугировании. С другой стороны, белок в растворе может находиться в виде нескольких форм, различающихся по степени агрегации, а следовательно, и по молекулярной массе. Если эти формы не превращаются одна в другую или превращения осуществляются достаточно медленно, на седиментограмме обнаружится несколько пиков, что, однако, не будет свидетельствовать о наличии примесных белков в исследуемом препарате фермента. Недостатком метода является также его невысокая чувствительность, что не позволяет обнаруживать малые количества примесных белков. [c.205]

Плотность супервитков (степень суперспиральности) молекулы ДНК обычно выражают величиной а, равной числу супервитков на 10 пар оснований [80, 82]. Для встречающихся в природе кольцевых молекул ДНК а чаще всего отрицательна наиболее типичное ее значение —0,05 ( 5 супервитков на 1000 пар оснований). Присутствие супервитков в кольцевых молекулах ДНК можно легко установить, поскольку при этом меняется константа седиментации ДНК [81]. Так, суперспираль-ная природная ДНК вируса полиомы седиментирует довольно быстро. После внесения разрыва в одну из цепей двойной спирали посредством кратковременной обработки ее ферментом образуется релаксирован- [c.139]

Изменения активности некоторых белков коррелируются, как правило, с изменениями ряда физических свойств. Так, изменение формы белковой молекулы можно установить по изменению некоторых гидродинамических характеристик (например, коэффициента трения, инкремента вязкости), по изменению светорассеяния, поверхностных свойств, диффузии через полупроницаемые мембраны и скорости седиментации [90]. Изменения термодинамических свойств (энтальпии и энтропии), объема, растворимости, оптического вращения, поглощения в инфракрасной области, дифракции электронов, а также некоторые другие характеристики, приведенные Каузманом [90], используются для Оцейки изменений формы белковых молекул. Большинство этих измерений было проведено па макромолекулах неизвестной структуры, для которых не была установлена последовательность аминокислотных остатков. В настоящее время благодаря усовершенствованию методов деградации белков, аналитического определения Концевых групп, методов разделения и идентификации отдельных фрагментов можно успешно изучать белки с молекулярным весом порядка 20 ООО. Хотя эта работа еще не достигла молекулярного уровня, тем не менее она дает возможность лучше использовать значения физических констант белковой молекулы известной структуры для объяснения механизма взаимодействия фермента с субстратом. Структура такого белка, как фиброин (белковое вещество натурального шелка), в настоящее время хорошо изучена благодаря сравнению рентгенограммы и ИК-спектров нативного волокна с рентгенограммами [35, 38, 108, 140] и ИК-спектрами [168] небольших фрагментов белка известной структуры, полученных при деградации, а также синтетитегаихпмшнептидо [c.386]

Как следует из данных табл. 17, наибольшей молекулярной активностью обладает ацетилхолинэстераза нервной ткани электрического органа В. ele tri us. Значение УмЗ-Ю минГ , найденное Нахманзоном и Розенбергом на основании определения молекулярного веса методом седиментации и измерения удельной активности очищенного препарата фермента, отличается от других данных, приведенных в таблице. Причина этого расхождения состоит в том, что другие авторы использовали для расчета величины молярной концентрации каталитических центров, независимо от того, сколько этих центров приходится на молекулу фермента. Так, Мичел и Крон [104] определяли концентрацию каталитических центров по количеству Р -диизопропилфторфосфата, присоединившегося к ферменту. Лоулер [106] применяла для этих целей [c.171]

Пируватдекарбоксилаза (М 660 ООО) состоит из четырех молекул биотина и четырех иоцов магния. Молекула этого фермента диссоциирует при низкотемпературной инактивации на четыре субъединицы с молекулярным весом по 165 000. Этот процесс обратим и может быть прослежен с помощью электронной микроскопии и седиментации, как показано на рис. 4. Каждая субъединица М 165 ООО) состоит из трех полипептидных цепей [c.399]

ДО 2,0 М (в присутствии 0,1 М р-меркаптоэтанола при pH 6,3 и температуре 20 °С) коэффициент седиментации АТФ-креа-тинтрансфосфорилазы, 5 изменялся от 5,1 до 1,9 5. При концентрации гуанидингидрохлорида 0,25 М и ниже ( о, что характерно для ассоциированной формы молекулы нативный фермент имеет коэффициент седиментации 5° , = 5,3 5), а также выше 2,0 М в растворе имеется только по одному компоненту (полностью ассоциированная и полностью диссоциирован- ная, 1,4 5, формы молекулы соответственно). В промежуточном диапазоне концентраций система, кроме того, проявляла тенденцию к образованию агрегатов с коэффициентами седиментации вблизи 20 5 [148]. [c.425]

Свойства. Суспензия белых кристаллов в воде. Не растворима в водЬ, плохо растворима в разбавленных буферных растворах. Растворяется в 0,2 растворе Ва(0Н)2. Гидролизует концевые L-аминокислоты многих пептидов, з> исключением тех, у которых С-концевым остатком является дкаминокислот или пролин. Оптимальное действие фермента при pH = 7,0—10,0 изоэлектр] ческая точка при pH = 6,0 константа седиментации 3,07 ингибиторы ферментной активности ионы S , N , РЫ+, u +, оксалат, цитрат. . [c.181]

В Хромосоме Salmonella. Тонкая структура этих генов была подробно изучена и нанесена на карту [112]. Было подсчитано, что если отдельная молекула т-РНК соответствует целому гистидн-новому оперону, то ее константа седиментации должна составлять приблизительно 38 S. Если Hie каждому отдельному ферменту соответствует своя т-РНК, то молекулярные веса таких пг-РНК будут ниже. Экспериментальные данные показали, что коэффициент седиментации т-РНК для этой системы составляет 34 S. Полученная величина слишком велика для т-РНК, кодируюш,ей какой-либо один из известных ферментов, и хорошо согласуется с величиной, предсказанной для т-РНК, соответствующей целому оперону [113]. Отсюда следует, что т-РНК может образовать с рибосомами комплекс, который способен синтезировать все полипептиды, закодированные в одном опероне. [c.286]

Более крупная субъединица катализировала образование карбамоиласпартата, но не ингибировалась ЦТФ. Меньшая субъединица не катализировала эту реакцию. При смешивании этих двух типов субъединиц и инкубировании их с меркаптоэтанолом (5Н-соединение) происходила реассоциация исходного фермента, который обладал не только каталитической активностью, но и ингибировался ЦТФ. Наличие у меньшей субъединицы центра для связывания ЦТФ было показано в опытах по седиментации с 5-бромцитидинтрифосфатом — соединением, которое поглощает при 298 нм, что дает возможность определить локализацию связанного с ним белка. [c.59]

Ферменты, молекулы которых состоят из нескольких полипептидных цепей, диссоциируют на субъединицы под влиянием тех же агентов, какие обычно используются для денатурации белков. Для некоторых белков хорошо исследован процесс ассоциация — диссоциация. Рассмотрим два наибо-,п ее подробно изученных в этом отношении белка — глутаматдегидрогеназу и альдолазу. Молекула глутаматдегидрогеназы обладает тремя типами организации на уровне четвертичной структуры. Непосредственно после выделения ее молекулярный вес составляет от 1,0-10 до 1,3-10 (определения по скорости седиментации и диффузии). В результате диссоциации фермента, которая стимулируется восстановленным НАДФ, некоторыми пуриновыми нуклеотидами или просто разбавлением фермента, получаются субъединицы [c.116]

Наиболее удобный метод состоит в сравнении (при идентичных условиях, желательно в той же центрифужной пробирке) неизвестного вещества со стандартом, который имеет сходный состав и для которого значение s известно. Такие стандарты в настоящее время доступны, а некоторые из них даже поступают в продажу. В качестве белковых стандартов мон ет служить ряд ферментов (лизоцим М = 17 200, ао.ш = 2,15 3 дрожжевая алко-гольдегидрогеназа М = 150 000, S2o,w — 7,6 S каталаза М = 250 ООО, 2o,гй = 11,35 S). Для транспортной РНК из печени, из дрожжевых клеток и из клеток Е.соИ величина s равна 4,5 8, а для двух типов рибосомной РНК из E- oli она равна соответственно 16 и 23 S. Все эти типы РНК могут быть использованы в качестве стандартов для РНК. ДНК из фагов Л, и Т7 относительно легко получается в неповрежденном виде в двух формах — с константами седиментации 33,6 и 32,5 S соответственно их можно использовать в качестве стандартов для нормальных типов ДНК. Для любой пары стандарт—неизвестное вещество с идентичным v выполняется следующее простое соотношение [c.138]

Насколько близка структура продукта, образующегося в ДНК-полимеразной реакции, к структуре ДНК-затравки Ответ на этот вопрос служит одновременно и ответом на вопрос о роли ДНК-затравки. Затравка может просто инициировать удлинение предсуществующих полинуклеотидных цепей или она может использоваться в качестве матрицы для фермента, катализирующего удвоение матрицы. Физические свойства синтезированного продукта явно противоречат нервому из этих двух предположений. Исследование в ультрацентрифуге показало, что синтезированный продукт поли-дисперсен и что среднее значение его константы седиментации приблизительно равно константе седиментации ДНК-затравки. Молекулярные веса и характеристические вязкости синтетической и затравочной ДНК приблизительно одинаковы. Наконец, присутствие 3, 5 -фосфодиэфирных связей в динуклеотидах, полученных при неполном ДНК-азном гидролизе синтезированного полимера, а такн е тот факт, что синтезированный полимер гидролизуется ДНК-азой, в свою очередь указывают на близость структур синтетической и затравочной ДНК. Таким образом, синтезированный поли- [c.509]

При ингибировании треонином скорость седиментации гомосериндегидрогеназы Rhodospirillum rubrum увеличивается [3]. Результаты седиментационного анализа подтверждают, что активный фермент существует в виде мономера, треонин же вызывает агрегацию с образованием неактивного димера. Характер кривых элюции неингибированного и ингибированного ферментов с колонок, заполненных сефадексом, также говорит о том, что треонин (конечный продукт, оказывающий ингибирующее действие) вызывает образование неактивного димера. В отсутствие треонина изолейцин и метионин увеличи- вают активность фермента, по-видимому вызы-J вая диссоциацию димера, образовавшегося при действии треонина. [c.17]

Даниэльссон [25] показал, что основная масса запасных белков в развивающихся и созревающих семядолях гороха (фиг. 202 и 203) состоит из двух глобулинов — вицилина и легу-мина. Эти два запасных белка не только различаются по растворимости, константам седиментации и аминокислотному составу, но и откладываются также с неодинаковой скоростью в период развития. Какое значение может иметь для растения наличие двух запасных глобулинов, не ясно. То, что оба эти белка играют запасную роль, подтверждается их исчезновением во время прорастания. Ферментативная активность у этих запасных глобулинов не обнаружена. Предполагают, что ббльшую часть альбуминовой фракции составляют ферменты, не связанные с частицами. На эту фракцию приходится небольшая часть общего азота гороха, и в процессе развития и прорастания семян эта фракция незначительно изменяется. [c.472]

Высокомолекулярная фракция была сконцентрирована в нативном состоянии с помощью сефадекса приблизительно в 30 раз, и при исследовании ее в ультрацентрифуге ФИВЕ на диаграмме седиментации был обнаружен один пик с константой седиментации ( 20,ж), равной 5,94 5. Таким образом, из секрета печеночных митохондрий выделено два усиливающих фактора, из которых один оказался адениннуклеотидом, а другой — белком. По-видимому, в первую очередь, когда гиалоплазма еще лишена коэнзимов гликолиза, действует аденнннуклеотид. Это действие дает гликолизу первый импульс. Затем, после насыщения ферментов коэнзимами, наступает действие белкового фактора это действие вызывает дальнейший подъем гликолиза. [c.115]

Все это показывает, как широко используется ультрацентрифугирование при изучении нуклеиновых кислот и биосинтеза белка. Ультрацентрифугирование незаменимо также при все более расширяющемся изучении смежных проблем — в частности при изучении механизмов регуляции ферментативных реакций. Метаболические потребности клетки удовлетворяются, как известно, благодаря тонкой согласованности скоростей различных биохимических последовательностей. Такая согласованность возможна благодаря чувствительности аллостерических ферментов к изменениям концентраций отдельных метаболитов, что в свою очередь зависит от конформационных изменений, вызываемых соответствующим метаболитом и, очевидно, передающихся путем взаимодействия субъединиц ферментного белка. Успехи, достигнутые в изучении свойств аллостериче-ского фермента — аспартат-карбамоилтрансферазы, хорошо иллюстрируют большое значение ультрацентрифугирования — особенно когда оно используется в сочетании с другими методами анализа. Так, Герхарт и Шахман [5] показали, что этот фермент, представляющий собой глобулярный белок с молекулярной массой около 3-10 , после обработки соединениями ртути распадается на субъединицы двух типов. Каталитической активностью обладают лишь субъединицы одного типа, в субъединицах же другого типа, не обладающих каталитической активностью, находится центр по которому происходит присоединение цитидинтрифосфата. С этой регуляторной субъединицей связывается 5-бромцитидин-трифосфат, о чем свидетельствует соответствующая картина седиментации. Позже Вебер [6] определил аминокислотный состав и Ы-концевые остатки субъединиц обоих типов и установил, что одна молекула фермента содержит четыре регуляторных и четыре каталитических субъединицы. [c.9]

Каждый биохимик, получив исследуемый фермент в кристаллическом виде, испытывает большое и вполне законное удовлетворение. Однако не следует забывать, что одна только кристаллизация фермента не может служить полной гарантией его чистоты. Так, Джекоби, в лаборатории которого за три года было выделено в кристаллическом виде 50 белков [7], сообщил о кристаллизации препаратов всего лишь 30%-ной чистоты. Он еще раз подчеркнул необходимость применения иных критериев гомогенности, таких, например, как ультрацентрифугирование и электрофорез. Однако следует иметь в виду, что при некритичном отношении к постановке эксперимента и на ультрацентрифуге можно получить один пик для гетерогенной смеси. На скорость седиментации частиц в центробежном поле и характер получающихся на седиментационных диаграммах пиков влияет ряд факторов, которые рассматриваются в настоящей книге и которыми некоторые исследователи часто на собственный риск пренебрегают. Именно по этой причине, несмотря на большие возможности применения этого метода в упомянутых выше областях, во многих лабораториях к работе на ультрацентрифуге допускается лишь ограниченный круг лиц, умеющих правильно использовать приборы и интерпретировать получаемые данные. Люди, владеющие этими знаниями, охотно принимаются в исследовательские коллективы, и можно надеяться, что предлагаемая книга послужит увеличению числа таких специалистов. Материал, изложенный в данной книге, рассмотрен достаточно глубоко, но вместе с тем не слишком сложно, что является результатом многолетнего опыта замечательного лектора, читающего курс физико-химических концепций студен-там-биохимикам. [c.10]

Если указанные условия не соблюдаются, то для определения значения 5 можно воспользоваться косвенными методами. Мартин и Эймес [16] использовали в качестве маркеров ферменты с известными коэффициентами седиментации, Стэнворс с сотр. [17] — белки, меченные красителем, а Черлвуд [18] — белки, меченные радиоактивным изотопом. Если присутствие такого маркера мешает движению исследуемого компонента, его седиментацию можно наблюдать в отдельной контрольной пробирке. [c.69]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология