Ферменты количественное определение активности

Одним из активаторов амилазы, т. е. веществом, повышающим ее активность, является хлористый натрий (точнее, ион хлора), а одним из ингибиторов — ион меди. Для количественной оценки влияния активатора или ингибитора на амилазу определение активности фермента проводится в присутствии каждого из них в отдельности и результаты [c.115]

Рис. 9-7. Количественное определение ферментативной активности. Эта процедура проводится в три этапа 1) определение /С (рис. 9-4 и дополнение 9-2), 2) измерение начальных скоростей (А) при различных концентрациях фермента и при концентрации субстрата, близкой к насыщающей, например при концентрации, равной 10 Км.

Фосфатазы — ферменты, ускоряющие гидролиз эфиров фосфорной кислоты. Щелочной фосфатазой называют фосфа-тазу, оптимум pH которой находится в щелочной среде. В организме субстратом действия этого фермента является фосфоглицериновая кислота, однако специфичность фос-фатаз не велика и они гидролизуют многие другие эфиры фосфорной кислоты. Для обнаружения фосфатаз и их количественного определения используют в качестве субстратов такие бесцветные эфиры фосфорной кислоты, которые под действием фосфатаз распадаются на фосфат и окрашенное соединение. Активность фосфатазы оценивают по интенсивности окраски. Примером такого субстрата является нитрофенилфосфат, распадающийся при участии фосфатазы на фосфат и нитрофенол, имеющий желтый цвет [c.234]

Перед тем как приступить к выделению и очистке того или иного фермента, необходимо выбрать удовлетворительный тест для его идентификации и количественного определения. Прямые методы существуют лишь для очень ограниченного круга ферментов, поэтому используют способность ферментов катализировать специфическую реакцию. Чтобы иметь возможность контролировать степень очистки фермента, его активность относят на 1 мг общего белка (так называемая удельная активность ). [c.198]

Принцип метода. Методы выделения амилаз из покоящихся и проросших семян основаны на настаивании размолотых семян с водой или слабым раствором нейтральных солей. При этом большая часть амилаз переходит в вытяжку. Очищают ферменты чаще всего высаливанием из растворов сульфатом аммония. Раздельное количественное определение активности амилаз основано на различной термолабильности а- и -амилаз. -амилаза разрушается нагреванием до 70°, при этом а-амилаза сохраняет свою активность. Некоторое снижение активности а-амилазы, которое может быть в таких условиях, практического значения не имеет. [c.149]

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ДЕЙСТВИЯ И АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ [c.67]

Методы обнаружения в слюне амилазы и мальтазы, а также метод количественного определения амилазной активности слюны рассматривались при изучении свойств ферментов. Ферменты, выделяемые в слюну бактериями, например альдолаза и щелочная фосфатаза, могут быть обнаружены в слюне теми же методами, что и в тканях или сыворотке крови животных (см. стр. 177 и 234). [c.260]

Электрофоретический метод отличается простотой выполнения и избирательностью. Это единственный из известных методов оценки активности рестриктаз, в результате применения которого имеется возможность судить о характере расщепления субстрата — каждая специфическая эндонуклеаза генерирует уникальный набор фрагментов ДНК субстрата, который после проведения электрофоретического их разделения дает определенный, характерный для этого фермента набор зон в геле. Рассмотрение таких картин позволяет судить не только о наличии рестриктазы в исследуемом растворе, но отчасти и об ее активности и субстратной специфичности. Последнее свойство обсуждаемого метода оказывается очень важным в тех случаях, когда в фракционируемой смеси содержится более чем одна рестриктаза. Кроме того, снижение интенсивности и четкости зон ДНК позволяет судить о наличии в фракциях неспецифических нуклеаз. Однако, электрофоретический метод наряду с отмеченными достоинствами имеет существенный недостаток, выражающийся в том, что количественное определение активности исследуемых ферментов проводится путем оценки перехода неполное расщепление—полное расщепление субстрата. Для того, чтобы идентифицировать этот переход, необходимо проводить обработку субстрата различными количествами фермента, что значительно увеличивает число анализируемых проб. Если учесть, что в ходе хроматографической очистки такой оценке подлежат многие десятки фракций, трудоемкость количественного определения активности рестриктаз электрофоретическим методом в таких опытах становится очевидной. Однако использование именно этого метода оправдывает себя в случае определения активности конечного препарата, предназначенного для применения в качестве аналитического реагента. В этом случае необходимо знать количество фермента, обеспечивающее исчерпывающее специфическое фрагментирование [c.127]

Нетрудно также видеть, что все рассмотренные методы количественного учета ферментов дают представление не об абсолютном количестве фермента, но лишь об относительном его содержании. Однако для практических целей и эти относительные показатели имеют большую ценность. Так, при количественном определении пепсина в. желудочном соке по методу Метта полученные величины ничего не говорят об абсолютном содержании пепсина в желудочном соке больного, но они все же достаточно ясно-показывают, насколько исследуемый сок по своей активности, т. е. по своей способности растворять денатурированный яичный альбумин, отличается от нормального л<елу-дочного сока здорового человека. Очевидно, эти величины для клиники представляют большой интерес и вполне заменяют цифры, характеризующие содержание пепсина в желудочном соке в абсолютных весовых единицах. Точно так же для характеристики осахаривающей (амилолитической) способности слюны или вытяжки из проросших зерен ячменя (солода) совершенно достаточно для практических целей выражать эту способность в условно принятых единицах. [c.124]

Значение pH в оптимуме отвечает наилучшему связыванию субстрата ферментом и наибольшей скорости катализа. Оптимум pH для большинства ферментов лежит в пределах от 6 до 8, однако есть и исключения например, пепсин имеет наибольшую активность при pH около 2. Количественное определение активности ферментов проводят при оптимальном для данного фермента значении pH. [c.112]

В основе всякого количественного определения ферментативного действия или активности действия фермента лежат те изменения, которые происходят с субстратом соответствующей ферментативной реакции. Об этих изменениях и об их скорости можно судить либо по исчезновению исходных веществ, подвергающихся ферментативному воздействию, либо по образовани и накоплению продуктов ферментативной реакции. [c.67]

Эти методы часто -являются наиболее..специфическими и тонкими методами обнаружения и количественного определения индивидуальных белков и некоторых других компонентов в смеси. В последующих томах настоящего сборника, а также в большом числе монографий [4, 43, 112, 113] описаны методы, пригодные для измерения активности таких белков, как ферменты, гормоны, токсины, антитела и т. п. [c.23]

Кроме того, эти авторы обнаружили изменения в количестве или активности некоторых печеночных ферментов. Количественных определений не производилось сдвиги регистрировались по интенсивности специфических гистохимических цветных реакций на эти ферменты, с помощью обычных методов связывания азокрасителей. Активности кислой фосфатазы, неспецифической эстера-зы и сукциндегидразы в паренхиматозных клетках печени были значительно снижены, тогда как щелочная фос-фатаза в купферовских и тучных клетках была повышена. [c.525]

Приготовление вытяжки пероксидазы. 2—4 г растительного материала (в зависимости от ожидаемой активности фермента) тщательно растирают с чистым песком, не содержащим соединений железа, или битым стеклом. Растертую массу количественно переносят в мерную колбу емкостью 200 мл, доводят водой до метки, взбалтывают и настаивают 2 ч, а затем фильтруют. Фильтрат служит для определения активности. Активность пероксидазы можно также определять непосредственно в болтушке, не фильтруя ее. [c.108]

Нетрудно также видеть, что все рассмотренные методы количественного учета ферментов дают представление не об абсолютном количестве фермента, но лишь об относительном его содержании. Однако для практических целей и эти относительные показатели имеют большую ценность. Так, при количественном определении пепсина в желудочном соке по методу Метта полученные величины ничего не говорят об абсолютном содержании пепсина в желудочном соке больного, но они все же достаточно ясно показывают, насколько исследуемый сок по своей активности, т. е. по своей способности растворять денатурированный яичный альбумин, отличается от нормального желудочного сока здорового человека. Очевидно, эти величины для клиники представляют боль- [c.131]

Для того чтобы исследовать ферменты, необходимо располагать методами для количественного определения их каталитической активности. Вещество, на которое воздействует фермент, называют его субстратом. Активность фермента определяют по количеству субстрата, которое под действием этого фермента превращается в продукт реакции за единицу времени. Рассмотрим в качестве примера р-галактозидазу — фермент, субстратом которого служит лактоза (дисахарид). Под действием р-галактозидазы лактоза расщепляется на галактозу и глюкозу [c.80]

Коренным вопросом изучения ферментов является определение их активности. Обычно о количестве имеющегося в системе фермента судят по быстроте осуществляемой им реакции. Поэтому важнейшим моментом следует считать количественное измерение скорости реакции. [c.41]

Препараты фермента были получены путем гомогенизирования свежих или лиофильно высушенных тканей с вероналовым или трис-буфером и последующего центрифугирования при 3000 g. Особенностью этих препаратов являлось высокое содержание в них сахаров и неорганического фосфата, что характерно как для проводящих, так и для паренхимных тканей. Поэтому определение активности гексокиназы по убыли глюкозы в опытной смеси или по убыли суммы легкогидролизуемого фосфата АТФ неорганического фосфата оказалось невозможным. Мы определяли действие гексокиназы непосредственно по количеству образующегося в течение опыта глюкозо-6-фосфата (и фруктозо-6-фосфата). Гексозомонофосфаты были выделены из опытной смеси путем фракционирования по Умб-рейту. Их количественное определение производили с помощью хроматографии на бумаге. Пятна глюкозо-6-фосфата и фруктозо-6-фосфата были элюированы с бумаги, и фосфорные эфиры определены по их сахарному компоненту с антроном [18]. [c.249]

В практике очистки сточных вод для характеристики напряженности окисления применяют определение дегидрогеназной активности микроорганизмов. Процесс биологического окисления, схематично показанный реакциями (4.140) и (4.141), состоит из множества ступеней и начинается с расщепления органического вещества с выделением активного водорода. Этот вид окисления называется непрямым. Водород передается ферментами дегидрогеназами на цитохромную систему дыхательной цепи ферментов, где соединяется с кислородом, образуя воду (частично перекись водорода). Количественное определение ферментов дегидрогеназ в ряде случаев позволяет получать быструю характеристику условий процесса и его особенностей и используется в качестве одного из технологических параметров управления процессом. [c.333]

Используя ДНК-содержащие микрогели и галлоцианин как краситель, можно обнаружить 0,1 нг дезоксирибонуклеазы [1482]. Применение для фракционирования дезоксирибонуклеаз полиакриламидного геля, содержащего Н-ДНК, улучшает результаты их количественного определения. После электрофореза гели разрезают и инкубируют в соответствующем буфере. Ферментативную активность определяют по количеству выходящих в среду радиоактивных фрагментов. Величина этой радиоактивности пропорциональна количеству фермента в пределах от 10 до 0,1 нг, а воспроизводимость определений составляет 5%. [c.295]

В результате фермент теряет активность. Сродство ионов Ае+ к тиольным группам настолько велико, что АдЫОз можно использовать для количественного определения —5Н-групп методом титрования. [c.360]

В области препаративной биохимии рестриктаз практически, только в случае выделения гомогенных препаратов этих ферментов описание схем очистки сопровождается количественными данными, позволяющими оценить эффективность отдельных стадий и выход целевого продукта. Приложение усилий для получения таких сведений в определенной степени диктуется и необходимостью подбора эффективных стадий, обеспечивающих получение необходимых количеств гомогенных препаратов рестриктаз. Однако, при оценке схем их получения в целом следует отметить, что в связи с присутствием в бесклеточных экстрактах неспецифических нуклеаз количественное определение активности целевых ферментов во многих случаях оказалось возможным проводить только после частичной их очистки. Это исключает возможность оценки эффективности первых стадий и всей схемы в целом. Тем не менее наличие количественных данных последующих стадиях очистки является полезной информацией, позволяющей оценивать эффективность сорбентов. [c.163]

Биоэлектрокаталитические эффекты применяются в настоящее время при создании сенсоров — электрохимических датчиков, необходимых для количественного определения различных химических соединений. Использование биоэлектрокатализа на основе прямого переноса электронов с активного центра фермента на электрод может существенно упростить создание такого рода систем. [c.71]

Большой вклад в изучение пищеварительных ферментов внес И. П. Павлов и его сотрудники. Им были разработаны физиологические методы, позволяющие получать чистые пищеварительные соки и изучать в них активность ферментов. Далее он исследовал условие , влияющие на образование ферментов в пищеварительных железах животных. В лаборатории Павлова были разработаны методы количественного определения некоторых ферментов. И. П. Павлов впервые указал на белковую природу ферментов. [c.168]

Определение тиамина. В большинстве природных источников тиамин встречается в виде дифосфориого эфира — кокарбоксилазы. Последняя, являясь активной группой ряда ферментов углеводного обмена, находится в определенных связях с белком. Для количественного определения тиамина необходимо разрушение комплексов и выделение исследуемого витамина в свободном виде, доступном для физико-химического анализа. Освобождение тиамина из связанного состояния обычно осуществляют с помощью кислотного гидролиза л под воздействием фос-фатазных и протеолитических ферментов. В качестве источника фосфатаз применяют различные ферментные препараты такадиастазу, амилоризин ПЮх, фосфа-ваморин [И, 19]. При pH 4,5 под действием амилаз, содержащихся в этих ферментных препаратах, одновременно происходит и расщепление крахмала, который, адсорбируя на себе витамины, мешает их количественному определению. [c.198]

Как упоминалось выще, длину цепи полинуклеотида можно определить количественным определением концевых звеньев. В случае некоторых небольших полимеров гидролиз концевого фосфата (фосфатов) под действием очищенной фосфомоноэстеразы дает независимую оценку длины цепи из соотношения количества общего фосфора к количеству фосфора, выделенному в виде неорганического фосфата исследование оставшегося полинуклеотида уточняет природу концевых звеньев. Применение такого рода методов до некоторой степени ограничено высокой степенью чистоты, необходимой для применяемых ферментов, и изменением активности моноэстераз (и диэстераз) с изменением длины цепи полимера. Однако нуклеиновые кислоты второго и третьего типов все же были обнаружены (хотя и в гетерогенных смесях рибонуклеиновых кислот), причем нуклеиновые кислоты последнего типа, возможно, возникали главным образом в результате процессов расщепления [92]. [c.389]

Мы поставили задачу разработать доступный и высокочувствительный метод определения указанных дефолиантов, использовав для этого энзимный метод, основанный на способности фосфорорга-нических соединений определенного типа угнетать фермент холин-эстеразу. Используя микрохимический титрационный метод определения активности холинэстеразы в присутствии яда, опубликованный Смирновой [5] для меркаптофоса, мы разработали количественное определение фолекса и бутифоса в растительном материале. [c.130]

Изучение кинетики действия ферментов важно не только с теоретической, но н чисто практической стороны. При выборе единицы активности фермента надо знать наилучшне условия его действия, а также то, как влияют на его активность различные факторы. Подобное предварительное исследование кинетики действия обычно необходимо и для успешного осуществления очистки фермента, так как этот процесс должен количественно контролироваться путем систематических определений активности ферментативного препарата на разных стадиях его очистки. [c.108]

Поскольку ретровирусные частицы содержат РНК-зави-снмую-ДНК-полимеразу, определение активности этого фермента может служить удобным критерием титра вирусного препарата. Однако этот метод неприменим к препаратам, не содержащим хелперных элементов, поскольку нетрансфицированные упаковывающие клетки спонтанно продуцируют заметные количества частиц, несущих обратную транскриптазу [17]. Для препаратов, в которых присутствует хелперный вирус, тест на активность обратной транскриптазы представляет собой наиболее простой способ качественого анализа большого числа образцов. Количественное титрование требует приготовления серии стандартов для построения калибровочной кривой. [c.297]

Как правило, реактивы, способные вступать в соединение с SH-группами, содержат активный атом галогена или реакционноспособную двойную связь. Хотя на протяжении многих лет такие соединения широко применялись в качестве блокирующих агентов для SH-ферментов и других белков, их использование для количественного определения SH-rpynn было ограниченным. [c.102]

Первые попытки мануального выделения нервных клеток были предприняты в 1953—1957 гг. (Lowry, 1953, 1957). Применив микроманипу-ляционные и микрохимические методы, Лоури получил ценный материал по количественной гистохимии мозга. Однако метод замораживания и оттаивания тканей, применяемый этим автором, часто дает искаженную картину из-за артефактов, которые трудно устранить. Это относится в основном к определению активности ферментов и в меньшей степени к неферментным компонентам. [c.132]

Так как ферменты — катализаторы определенных химических реакций, то следует количественно изучать их по влиянию на кинетику соответствующей реакции. Для получения сколько-нибудь ясных и новторимых результатов необходимо пользоваться высокоочищенньши, в частности кристаллическими, препаратами ферментов. Сама по себе ферментативная реакция изучается на чистой системе, состоящей из буфера, субстрата (или субстратов) и фермента. Следует всегда помнить, что подобный модельный эксперимент весьма далек от обстановки, в которой ферменты действуют в клетке. В клетке ферменты часто включены в форменные образования, или в так называемую структуру . Одно время полагали, что, измеряя кинетику реакции в присутствии добавки чистого кристаллизованного фермента, мы выясняем максимальную каталитическую активность, на которую способен данный белок. На самом деле это может быть и неверно. Вполне возможно, что, будучи включен в форменные элементы, фермент усиливает свое действие, так как может произойти благоприятное изменение его вторичной и третичной структуры. [c.155]

Алкогольдегидрогеназы, выделенные из разных источников, отличаются по составу и свойствам. Алкогольдегидрогеназа дрожжей (мол. в. 150 ООО) содержит четыре молекулы НАД и четыре атома цинка на молекулу белка В связи с этим высказано предположение, что атомы цинка участвуют в связывании кофермента с белком. По-видимому, данный фермент проявляет активность в макроструктуре, состоящей из четырех или двух субъединиц. Алкогольдегидрогеназа дро>кжей используется для количественного определения очень малых количеств спирта. [c.290]

Уилсон и Коэн нашли, что около 25"о общей холинэстеразы является внутренней , а остальная часть — наружной . Однако количественные определения в этих условиях очень затруднены, потому что в опытах на интактных препаратах никогда нельзя уверенно оценить концентрацию субстрата в местах расположения фермента, а насытить систему субстратом невозможно, так как известно, что избыток субстрата тормозит активность холинэстеразы. На рис. 33 представлены некоторые результаты исследования действия ингибиторов на холинэстеразу нерва краба (данные для ДФФ не приведены). Авторы считают, что ингибиторы могут быть разбиты на два класса а) простигмин, ТЭПФ и декаметоний, которые избирательно тормозят внешний фермент, и б) ДФФ и эзерин, которые угнетают как внутреннюю , так и внешнюю холинэстеразу. По мнению авторов, это объясняет тот факт, что вещества класса б блокируют нервную передачу, в то время как соединения класса а лишены этой способности. Необходимо отметить, что различие между простигми-ном и декаметонием, с одной стороны, и эзерином—с другой, выражено недостаточно четко (ТЭПФ является исключением). Приведенные данные трудно интерпретировать потому, что в них не видно зависимости между ионизацией и проницаемостью. Так, эзерин, который при pH 7 ионизирован на 91% (его рКа = 8,0 [143]), проникает легко, в то время как ТЭПФ не проникает, хотя он не ионизирован и, как известно, способен проникать через ионные барьеры [144]. Было бы интересно провести аналогичное исследование с более тщательным подбором условий в отношении концентрации веществ и времени их воздействия. При рассмотрении рис. 33 создается впечатление, что оба эти фактора выбраны несколько произвольно. Более серьезной проблемой является отсутствие данных [c.219]

Ферментативная активность церулоплазмина была впервые описана Холмбергом и Лоуреллом [46], которые показали, что это единственный фермент, катализирующий окисление полиаминов и полифенолов в плазме. Катализируемая церулоплазмином реакция окисления п-фенилендиамина и других аналогичных соединений используется обычно для количественного определения белка в растворе [31, 47, 48]. Однако не было замечено, чтобы церулоплазмин играл сколь-нибудь существенную физиологическую роль при окислении таких важных биологических субстратов, как адреналин, норадреналин, серотонин, катехоламин или допамин [49]. [c.369]

В большинстве случаев способ обнаружения фермента состоит в том, что электрофореграмму разрезают на небольшие участки, элюируют из них фермент и определяют его активность обычными методами. Такая методика позволяет проводить количественное определение ферментативной активности, однако иногда при этом снижается степень разрешения, поскольку фрагменты геля, как правило, шире, чем зоны разделенных белков. С точки зрения разрешающей способности более предпочтительными являются методы локализации ферментов in situ. Краткое описание таких методов дается в настоящей главе. [c.279]

Фриц и др. 408] обнаружили, что соотношение между изоферментами ЛДГ, выявленными с помощью электрофореза в геле и последующего специфического окрашивания разделенных зон, зависит от количества нанесенного на гель белка. Более того, соотношение изоферментов, определенное при электрофорезе, отличается от их соотношения при измерении другими методами. Меньшие количества фермента обнаруживали более высокую относительную активность, что, вероятно, объясняется медленным проникновением в гель субстрата и сопрягающего агента. При электрофорезе в микрогелях изоферментов глюко-зо-6-фосфатдегидрогеназы подобных отклонений не наблюдалось [257]. В этом случае субстраты, коферменты, сопрягающие агенты и другие низкомолекулярные соединения очень быстро проникают в гель, благодаря чему обеспечивается постоянный избыток субстрата и других реагентов. Таким образом, микрогель можно рассматривать как микрокювету и использовать его для количественного определения пикограммовых количеств ферментов, а также для изучения кинетики ферментативных реакций. Детальное описание этих методов дается в работе Нейхоффа [915]. [c.283]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология