Антитела преципитация антигена

Рис. 4.4. Реакция преципитации антиген-антитело Аг — раствор антигена Ат — антитела иммунной сыворотки или одного из препаратов IgG, содержащего антитела Б — буферный раствор.

Высокая специфичность антител по отношению к антигену делает их гибким и действенным инструментом, который можно использовать для выявления, количественного определения и локализации множества разнообразных веществ, представляющих интерес для биолога. Но как можно обнаружить или измерить взаимодействие антитела с антигеном Начальная реакция связывания антигена с антителом-так называемая первичная реакция-может быть измерена многими различными способами. При радиоиммунном анализе, позволяющем определять даже ничтожные количества материала, известное количество радиоактивного антигена вместе со стандартным количеством антител добавляют к образцу, содержащему неизвестное количество того же антигена в нерадиоактивной форме. Немеченый антиген конкурирует с меченым за связывающие участки антител, и чем больше данного антигена в образце, тем меньше радиоактивного антигена будет связано с антителом. Свободный радиоактивный антиген можно отделить от связанного, а затем измерить количество того и другого с помощью ряда методов, использующих различия в свойствах свободных и связанных молекул один нз общих подходов состоит в осаждении (преципитации) комплексов антиген-антитело антителами к иммуноглобулинам (рнс. 17-28). [c.27]

Нефелометрию используют для изучения взаимод. р-ри-мого антигена с антителом (преципитация). При этом смешивают настолько разбавленные р-ры антигена и антитела, чтобы образовавшиеся иммунные комплексы антиген-антитело оставались во взвешенном состоянии. О кол-ве комплексов судят по интенсивности рассеянного света с длиной во.тны 450 нм. [c.224]

Способы специфической преципитации антиген — антитело [c.99]

Если к кроличьим антителам добавить антиген ЛМ, который мы вводили кроликам, и получить положительную серологическую реакцию (специфическую преципитацию), то мы не будем знать, обусловлена ли эта преципитация реакцией между М и анти-М или между Л и анти-Л или той и другой одновременно. Если же присоединить диазотированную метаниловую кислоту к белкам сыворотки курицы [c.19]

ТАБЛИЦА 2 Подавление различными разведениями гаптенов реакции преципитации антитела с антигеном [c.30]

Простейшие молекулы антител имеют форму буквы V с двумя идентичными антиген-связывающими участками - по одному на конце каждой из двух ветвей (рис. 18-12). Поскольку таких участков два, эти антитела называют бивалентными. Такие антитела могут сшивать молекулы антигена в обширную сеть, если каждая молекула антигена имеет три или большее число антигенных детерминант (рис. 18-13). Достигнув определенных размеров, такая сеть выпадает из раствора. Тенденция больших иммунных комплексов к осаждению (преципитации) удобна для выявления антител и антигенов. Эффективность реакций связывания и сшивания антигена значительно возрастает благодаря гибкому шар- [c.229]

Как правило, антигены мигрируют в гель, содержащий антитела. Раствор антигенов помещают в лунки, вырезанные в геле. Во время электрофореза образуются зоны преципитации, имеющие форму пиков (рис. 88). Передний край преципитата перемещается с постепенно уменьшающейся скоростью по направлению к одному из электродов до тех пор, пока мигрирующий антиген не перестает поступать в избытке. [c.248]

Б геле при расположении лунок в виде кольца демонстрирует, как различные соотношения антигенов и антител влияют на расположение и четкость линий преципитации. Антиген (IgG человека в концентрации 1 мг/мл) помещен в центральную лунку антитела к IgG, исходное разведение 1 20 (верхняя правая лунка), двукратные разведения по часовой стрелке вокруг лунки антигена [c.205]

Козьи антитела против КК-ММ титровали также по их способности к преципитации антигенов. Контрольный препарат сыворотки человека, содержащий 80% очищенного изофермента КК-ММ и 20% очищенного КК-МВ (общая ферментативная активность 1300 МЕ/л при 37 °С), инкубировали 5 мин при комнатной температуре с различными разведениями антисыворотки. Далее добавляли избыток иммобилизованных вторых антител и инкубировали еще 5 мин. После центрифугирования полноту удаления КК-ММ и КК-МВ из супернатанта проверяли с помощью электрофореза, предварительно сконцентрировав образец в 5 раз. Для эффективного ингибирования и преципитации, как правило, требовалось разведение антисыворотки в 50—200 раз. [c.328]

Различают реакции агглютинации, преципитации, нейтрализации, реакции с участием комплемента, с использованием меченых антител и антигенов (радиоиммунологический, иммуноферментный, иммунофлюоресцентный). Перечисленные реакции отличаются по регистрируемому эффекту и технике постановки, однако все они основаны на реакции взаимодействия антигена с антителом и применяются для выявления как антител, так и антигенов. [c.176]

Если раствор антигена (например, раствор белка) в адекватных пропорциях смешать с сывороткой, содержащей специфические антитела иммунной сывороткой), то в результате реакции образуется преципитат, образованный молекулами антигена и антител. Наибольшее разведение иммунной сыворотки, при котором еще происходит реакция преципитации с антигеном, присутствующим в постоянной концентрации, называют титром данной сыворотки. Титр отражает ее активность например, сыворотка с титром 1 25 ООО считается в пять раз активнее сыворотки, имеющей титр 1 5000. [c.16]

На первом этапе реакции преципитации происходит связывание молекул антигена с антителами, но видимых преципитатов не образуется. На втором этапе реакции происходит агрегация возникших ранее комплексов антиген — антитело с образованием больших нерастворимых частиц, видимых невооруженным глазом. Первый этап реакции протекает быстрее, более обратим и специфичен, чем второй. [c.16]

Выделение чистых И. проводится с помощью ионообменных смол с послед, гель-фильтрацией. Для мн. целей используют препараты миеломных И., особенно минорных классов. Антитела выделяют с помощью иммуносорбентов - фиксированных на нерастворимых носителях (напр, целлюлозе) антигенов. Обнаружение и количеств, определение И. разных классов проводят иммунологич. методами с помощью соответствующих антисывороток. Для определения кол-ва антител используют методы преципитации (иммунная р-ция осаждения антигена антителом), агглютинации (взаимод. антитела с двумя клетками), нейтрализации бактерий и вирусов и др. Широкое распространение получают радиоиммунные и ферментно-иммунные методы, обладающие исключительно высокой чувствительностью и позволяющие определять очень малые кол-ва антител (или антигенов) в смесях с др. в-вами. [c.217]

Изучение явления специфической преципитации, возникающей при взаимодействии антител с антигенами in vitro, в конце прошлого столетия привело к возникновению новой научной дисциплины — иммунохимии, которая включает изучение химических аспектов иммунитета, в первую очередь химии антигенов, антител и их взаимодействия. Высокая чувствительность и специфичность иммунологических реакций позволили применить их с большой пользой для исследования белков. Иммунохимия не только увеличила методические возможности изучения белков, но и создала новое направление их анализа. [c.15]

Однако многие методы анализа основаны на торичнмх реакциях, т. е. ка-, ких-то последствиях первичного взаимодействия антитела с антигеном К этим вторичным реакциям относятся преципитация, агглютинация клеток и связывание комплемента. Последнюю реакцию можно использовать пото му, что компоненты системы комплемента связываются только с антителоц находящимся в комплексе с антигеном при этом исчезновение компоненто комплемента может служить мерой количества образующегося комплекса антиген-антитело. Однако чаще всего применяют реакцию преципитации антигена с антителом в жидкостях или гелях. Например, в методе Ухтермни антиген и антитело помещают в отдельные лункн, вырезанные в агаровом геле, Реагенты диффундируют из лунок до тех пор, пока не встречаются друг с другом в оптимальных соотношениях для образования преципитата, который становится видимым как непрозрачная полоса, рассеивающая свет (рис. 17-29). [c.28]

При изучении преципитации спин-меченых антител специфическим (яичный альбумин) и неспецифическим (сульфат аммония) антигенами были обнаружены резкие различия в спектрах ЭПР преципитатов. Если преципитация антител специфическим антигеном не приводила к резкому изменению подвижности парамагнитной метки, то осаждение у-глубулина сульфатом аммония, напротив, вызывало сильную иммобилизацию свободных радикалов. [c.173]

Вопрос о механизме реакции антител с антигенами еще не получил полного разрешения. Несомненна, однако, существенная роль в этом процессе ионных, водородных и ван-дер-ваальсовых связей. Реакция эта, по крайней мере, двухстадийна. Первая стадия протекает очень быстро и не сопровождается видимыми изменениями. Она характеризуется довольно существенным тепловым эффектом ДЯ от 2 до 40 ккал/моль. Вторая стадия взаимодействия антигена с антителом длится часами. В различных системах она может протекать по-разному, сопровождаясь преципитацией (выпадением образовавшегося комплекса в осадок), агглютинацией (слипанием антигенных частичек), лизисом (растворением клеток), нейтрализацией токсинов и вирусов и т. п. [c.112]

В реакции антигена с антителом существенно то, что все антитела полифункциональны, т. е. каждое антитело содержит. чаще всего два центра, соединяющихся с молекулами антигенов. Отсюда реакция преципитации антигенных белков и реакция аглютинации клеток под действием антител. Антитела служат клеем , скрепляющим макромолекулы инородных белков или оболочки чуждых клеток, и вызывают их выпадение из среды в осадок. В организме эти осадки образуются главным образом в почках и печени. [c.502]

Первые анализы такого рода были проведены Ву [93]. Исследования с применением более усовершенствованных методов показали, что отношение антитело/антиген в преципитате увеличивается с увеличением этого отношения в смеси антитела с антигеном перед преципитацией [46, 94—96]. Отношение аптитело/ан- [c.342]

Применение иммунологических методов в препаративных целях осложняется прочностью и специфичностью комплекса антиген— антитело. Некоторые комплексы можно разложить только с одновременной деструкцией одного из компонентов, обычно антигена при этом освобождается антитело [371—373]. Антитела против полисахаридных (пневмококковых) антигенов можно отделить [374—376] в концентрированном растворе Na l (1,8 М), причем получаются растворы антител различной степени чистоты. Как показывают результаты измерения содержания азота в осажденных антителах, степень чистоты таких растворов нередко приближается к 100% . Успех применения этого метода, повидимому, частично зависит от эффективности антисыворотки, применявшейся для преципитации. Антитела белковых антигенов, например дифтерийный антитоксин, не могут быть выделены при помощи такого простого метода. Оказалось целесообразным гад-ролизовать белковый антиген пепсином или трипсином в определенных условиях при этом удается выделить только 30—60% указанного антитоксина [377]. Сырой дифтерийный антитоксин, полученный в результате обработки трипсином, не является, как показывает проба на постоянство растворимости, чистым, хотя токсином можно осадить 95% его. Этот препарат был разделен [c.79]

Реакция антиген-антитело. Преципитация. Образование нерастворимого комплекса при смешивании высокодисперсного антигена с антителами называют преципитацией. Этот феномен достаточно сложен по своему механизму. Выяснено, что наиболее эффективно преш1-питируют антиген антитела М-класса. К ним приближаются по активности антите- [c.251]

Количественный вариант реакции связывания комплемента в одной из принятых модификаций (И. Тарханова, А. Коников, 1957) основан на связывании комплемента в зоне эквивалентности системы антиген-антитело. К равным количествам антител добавляют антиген в возрастающей концентрации и ко.мплемент. Пробы оставляют на 1 ч при 37°С или на 18 ч при О С. Затем в каждой пробе определяют количество свободного комплемента по способности последнего лизировать эритроциты барана, сенсибилизированные IgG-антителами кролика против эритроцитов барана. Количество связанного комплемента выражают в СН50, т. е. количестве комплемента, необходимом для 50%-ного гемолиза сенсибилизированных антителами эритроцитов. Если выразить графически зависимость между количеством антигена в пробе и количеством связанного комплемента, полученная экспериментальная кривая окажется подобной кривой, описывающей зависимость между количеством белка преципитата и количеством добавленного антигена (см. рис. 55 и 59). В одной и той же системе антиген-антитело соотношение реагентов, соответствующее образованию максимального количества преципитата, с одной стороны, и максимальному количеству связанного комплемента, с другой, обычно совпадают. Однако в отличие от реакции преципитации РСК чувствительнее по меньшей мере в 50—100 раз, т. е. во столько раз можно развести анти- [c.259]

Молекулы (В растворе, помещенные в лунки агарового геля, радиально диффундируют и образуют иммунные комплексы с комплементарными молекулами антител или антигенов, содержащихся IB жидкой фазе агара. В стандартной РИД агар содержит моноспецифические антитела, а радиально диффундирующий антиген, встречаясь с ними, образует кольцо преципитации. До тех пор пока в лунке сохраняется избыток антигена, процсходит постепенное увеличение диаметра кольца преципитации. Реакция протекает в течение нескольких дней, причем время проведения определяется молекулярными размерами антигена. В случае IgM (мол. масса 900 000) времени требуется по крайней мере вдвое больше, чем для IgG (мол. масса 150 000). На практике, если молекулы имеют размер IgG или менее, для построения количественной кривой с использованием Стандартных разведений антигена достаточно 24-часо-вой инкубации при 4°С или 16-часовой при комнатной температуре. Количественная оценка основана на том, что размеры кольца преципитации прямо пропорциональны количеству антигена IB лунке ( при равных объемах препаратов в лунках). По квадрату диаметра колец преципитации (D ) можно судить о соотношении концентраций антигена в лунках даже при сокращении времени инкубации. Для построения калибровочной кривой используют стандартные разведения антигена, концентрация которых отличается в 10—20 раз и может достигать 5 м кг/мл. Образцы соотносят с калибровочной кривой, измеряя размеры кольца преципитации на еще влажном геле. [c.208]

Количество антител или антигенов, смешиваемых с агаром подбирают таким образом, чтобы образовались кольца преципитации, диаметр которых можно измерить на еще влажной пластине, причем размер кольца вокруг лунки с максимальной концентрацией стандартного антигена (или контрольных антител) по завершении реакции должен быть порядка 1 см. Чувствительность метода можно увеличить, снижая концентрацию реагента, вносимого в агар, и пропорционально уменьшая количества образцов в лунках. При уменьшении количеств взаимодействующих реагентов образуются более бледные кольца преципитации во влажрюм агаре. Можно увеличить контрастность, если окрасить отмытые и высушенные иластины. Таким способом можно повысить чувствительность метода определения антигена до 1 мкг/мл. [c.210]

Индивидуальные антигены электрофоретически мигрируют из лунок, расположенных у основания геля, в агарозу, содержащую специфические антитела. С помощью специальных условий обеспечивается миграция антигена к аноду и неподвижность антител (IgG). По мере связывания антител мигрирующим антигеном образуются заостренные дуги преципитации (ракеты). Высота ракет пропорциональна концентрации антигена. Если на пластину нанесено несколько разведений стандартного антигена, то концентрации неизвестных (опытных) образцов легко определить, сравнивая их со стандартной кри- [c.222]

Включившие метку иммуноглобулины можно удалить из диализованного лизата следующим образом. Для усиления преципитации меченых иммуноглобулинов к лизату прибавляют нормальную сыворотку того вида, клетки которого взяты в опыт. Количество этой сыворотки (обычно 25 мкл на 10 клеток) должно быть равным объему прибавляемой позже специфической антисыворотки (см. ниже) или немного большим. Затем добавляют анти-глобулиновый реагент в наименьшем количестве, достаточном для полной преципитации иммуноглобулинов. [Это количество определяют в предварительном титровании, в котором 25 мкл нормальной сыворотки смешивают с возрастающими объемами (например, 100, 200... 1000 мкл) антиглобулииового реагента, доводят общий объем до 1 мл, добавляя сыворотку с ЗФР, и оставляют для образования преципитата на ночь находят то минимальное количество реагента, после добавления которого в надосадочной жидкости больше не остается иммуноглобулинов (т. е. новое добавление 100 мкл реагента уже не вызывает преципитации).] Реакцию преципитации в основном опыте проводят в течение 4—16 ч при 4°С, после чего преципитат удаляют центрифугированием при 2000g в течение 15 мин. После удаления меченых иммуноглобулинов к двум пробам лизата прибавляют соответственно специфическую и контрольную сыворотки и инкубируют 1—2 ч при 37°С. Обычно на 10 клеток прибавляют 20 мкл антисыворотки. Если, предположим, сыворотка содержит 50 мкг/мл антител к антигену, представленному в количестве 5-10 молекул на 1 клетку, то каждая молекула антигена будет в среднем иметь по два участка, связывающих антитело. Целесообразно в предварительных опытах (используя разные объемы, например 5, 20 и 50 мкл на 10 клеток) определить то количество сыворотки, которое дает наибольшее соотношение между радиоактивностью преципитатов в опыте и в контроле. Наконец, ко всем пробам прибавляют соответствующее количество антиглобу-линового реагента и инкубируют 4—16 ч при 4°С. [c.190]

Другим плодотворным приемом оказалось использование двойных и тройных иммунных систем, когда, например, к первоначальным комплексам антиген—антитело присоединяются антитела, полученные от другого животного, иммунизированного сывороткой первого донора. Эти так называемые вторичные антитела узнают антитела, входящие в состав первичного иммунного комплекса, поскольку для второго животного первичные антитела являются антигенами. Кроме того, в систему можно ввести еще и белок А, способный присоединяться к одинарному или двойному иммунному комплексу, поскольку константная часть соответственно первичного или вторичного антитела в этих комплексах остается свободной. Белок А можно иммобилизовать Hii некоей матрице, создав тем самым сорбент для антител и иммунных комплексов. Этот белок можно использовать и прямо в составе бактериальной стенки. Убитые, но не разрушенные бактерии Staphylo o us aureus, за счет белка А способны связывать иммунные комплексы, в результате чего преципитация этих комплексов из раствора сводится к осаждению бактерий низкоскоростным центрифугированием. [c.270]

Преципитация (агрегация) антигена антителами происходит не всегда, даже если сам факт высокоаффинного связывания имеет место. Агрегация требует соблюдения нескольких условий. Во-первых, и антитело, и антиген должны быть, как минимум, бивалентными (т. е. каждая молекула антигена должна иметь не менее двух идентичных детерминант, а каждая молекула антитела не менее двух активных центров, специфичных к этим детерминантам). На рис. 28 легко увидеть, что моновалентность любого из двух партнеров запрещает образование мультимолекулярных комплексов. [c.72]

Состояние агрегации иммунных комплексов не должно препятствовать фиксации на Рс-фрагменте компонентов комтемента и, следовательно, их диффузии в преципитате. Изучение структуры специфического преципитата антител с антигенами бьпо проведено с помощью спиновых меток (Григорян и др., 1969). Для мочения белка исполь овали нитроксильный радикал, синтезированный на базе малеинимида. Он ковалентно реагировал с SH-группами кроличьих антител после восстановления 2-мсркаптоэтанолом межцепочечных дисульфидных связей. При этом активность антител сохранялась. В результате преципитации спин-меченых антител яичным альбумином метка продолжала вращаться свободно, не испытывая стерических препятствии. С другой стороны, неспецифическое осаждение спин-меченых антител сульфатом аммония приводило к сильной иммобилизации метки. Эти данные указывают на решетчатую, рыхлую структуру преципитата, образованного иммунными комплексами. [c.32]

Активные центры (центры связывания) антител расположены в вариабельных областях пептидных цепей. Антитела класса IgG двухвалентны, т. е. имеют два центра связывания антигена. Таким образом, каждая молекула антитела может присоединить две молеьсулы антигена. С другой стороны, к каждой молекуле антигена может присоединиться несколько молекул антител, поскольку на антигене есть несколько антигенных детерминант и к каждой из них образуются антитела. В результате возникают сложные молекулярные комплексы (см. рис. 20.1, г). Такие комплексы могут выпадать в осадок на этом основана реакция преципитации для обнаружения антител или антигенов. Если антиген не свободен, а содержится в мембране клеток, то происходит склеивание (агглютинация) клеток антителами. Реакция агглютинации также используется для обнаружения антител и антигенов (в частности, при определении групп крови). В результате действия антител может разрушаться клеточная оболочка — происходит лизис клеток. В лизисе клеток, помимо антител, участвует комплемент — сложная ферментная система, находящаяся в плазме крови. [c.477]

Б случае иммуноэлектрофореза [49 — 51] принцип электрофореза сочетается с биоспецифической аффинностью белка (рис. 3-5). Белки-антигены сначала разделяются гель-электрофоретически. При встрече с диффундированными внутрь геля антителами происходит образование комплексов антиген — антитело, наблюдаемых в виде серповидных полос преципитации. Иммуноэлектрофорез имеет особое значение в медицинской диагностике (разделение и идентификация сывороточных белков и др.). Рис. 3-6 поясняет эффективность этого метода по сравнению с другими видами электрофореза. [c.352]

Реакция специфической преципитации между антигенами и антителами в жидкой или гелеобразной среде использовалась уже свыше полувека в самых разных методах. Пионерами методов, основанных на преципитации в геле, были Оудин [87], Ухтерлони [85], Грабарь и Уильямс [41]. Эти методы имеют множество модификаций с самым разнообразным их применением. [c.99]

Добавление раствора белкового антигена к соответствующей антисыворотке нередко вызывает медленную преципитацию. Факторы, влияющие на скорость появления и количество образующегося осадка, многочисленны классы используемых иммуноглобулинов, характер антигена, относительная доля участия и концентрация агентов, температура, ионная сила, pH [53]. Представляется, что после быстрого образования комплекса антиген — антитело формируются агрегаты, которые, теряя определенцое число полярных группировок, становятся нерастворимыми. [c.100]

Этот особый аспект реакции иммунопреципитации может бь[ть охарактеризован кривой преципитации, представляющей количество осадка как функцию возрастания количества антигена, добавленного к тому же количеству антител (рис. 4.4). Количество этого осадка вначале увеличивается, проходит через максимум, называемый точкой эквивалентности, а затем умень[цает-ся. При избытке антигена часть комплекса антиген—антитело не осаждается это может быть обусловлено разной природой решетки, образованной в этих условиях (см. рис. 4.2 А). При большом избытке антигена осаждение может ингибироваться. В некоторых случаях, например с лошадиной антисывороткой, аналогичный эффект можно наблюдать не только при избытке антигена, но также при избытке антител. [c.100]

А. Иммуноэлектрофоретический анализ (ИЭА) [41], Антигены вначале разделяют путем электрофореза в агарозном геле, Верхняя часть рисунка демонстрирует классическое расположение ИЭА нижняя часть ИЭА называется тандемной стрелки показывают положение лунок, в которые заливают перед электрофорезом растворы антигенов. После электрофореза в геле параллельно направлению электрофоретической миграции прорезается канавка, которая заполняется иммунной сывороткой. Антитела и антигены диффундируют в гель, встречаются и образуют дуги преципитации, [c.102]

В начале текущего столетия систематики первыми использовали информацию, получаемую при исследовании растений серологическими методами [77, 116]. Интенсивное применение этих методов до 50-х годов могло показаться довольно бесперспективным, так как иногда получали необъяснимые результаты из-за методического несовершенства, поскольку могли тогда учитывать (с помощью реакций преципитаций, оцениваемых турби-диметрией мутных сред) только крупномасштабные, глобальные явления, отражаемые реакциями между системами — комплексами антигенов и антител. В то время иммуноадсорбция явилась ценным подспорьем в этих исследованиях [82]. Применение антител для изучения растений вновь вызвало интерес после разработки методов осаждения в геле благодаря прогрессу в очистке белков и открывающейся возможности производить и контролировать полиспецифические и моноспецифические сы- [c.111]

В сущности все методы иммунодиффузии основаны на явлении, которое наблюдал Бекхольд взаимодействии антиген — антитело в геле. Растворимый белковый антиген и иммунная сыворотка диффундируют в геле навстречу друг другу. В месте встречи обоих реагентов возникает полоса преципитации, которую можно легко наблюдать и регистрировать. [c.18]

В агаровом геле или на ацетат-целлюлозной мембране белковый антиген и специфические антитела диффундируют навстречу друг другу и образуют в месте контакта линии преципитации, которые можно видеть невооруженным глазом или выявить специальным окрашиванием. При анализе двух белковых смесей, например двух разных сывороток или выделенных нативных белков, с помощью этого метода можно не только узнать число индивидуальных белков, присутствующих в нашей системе, но и получить данные об их имму-нохимической идентичности, родственности или различиях. Все эти выводы могут быть сделаны на основании числа и взаимного расположения линий преципитации. [c.20]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология