ХРОМАТОГРАФИЯ АМИНОКИСЛОТ И ПЕПТИДОВ НА БУМАГЕ

Глава VII ХРОМАТОГРАФИЯ АМИНОКИСЛОТ И ПЕПТИДОВ НА БУМАГЕ [c.187]

Хроматография аминокислот и пептидов на бумаге [c.189]

Хроматографию на бумаге в сочетании с применением органических реактивов широко используют для разделения близких по свойствам соединений аминокислот, пептидов, нуклеиновых кислот, углеводов. Кроме того, ее применяют для определения следов хлорорганических, фосфорорганических и других пестицидов в пищевых продуктах и в биологическом материале. Этим методом также разделяют пигменты листьев. [c.460]

В установках другого типа, где бумага зажата между твердыми поверхностями или погружена в непроводящую жидкость, испарение полностью предотвращается. В этом случае легче добиться воспроизводимости положения зон и измерить подвижность, но зоны часто получаются более широкими, вероятно, из-за влияния слоя жидкости, образующегося между поверхностью бумаги и оболочкой, даже если последняя и не смачивается водой. При такой конструкции прибора легче осуществить хороший теплоотвод и можно резко повысить напряженность поля до 50 в см и более, уменьшив время разделения до десятков минут. Такой высоковольтный электрофорез, часто в сочетании с хроматографией, успешно применяется для быстрого разделения аминокислот, пептидов и других низкомолекулярных объектов. Белки этим методом разделяются плохо. [c.94]

Первое разделение заряженных молекул на бумаге под действием электрического поля было проведено в 30-е годы незадолго до открытия метода бумажной хроматографии. С тех пор в литературе появилось большое число сообщений о разделении аминокислот, пептидов, белков и нуклеотидов [1—3] методом электрофореза на бумаге. Электрофорез на бумаге оказался не очень эффективным способом разделения высокомолекуляр- [c.132]

В книге изложены современные химические методы, применяемые в исследованиях по биохимии белка. В сжатой форме автор дает описание различных методов и на конкретных примерах показывает возможности их успешного использования. Большое внимание уделяется описанию методов исследования состава и структуры индивидуальных белков хроматографии на бумаге, ионообменной хроматографии аминокислот и пептидов (на смолах), высоковольтного электрофореза на бумаге, определения последовательности аминокислот в белках и др. Описание отдельных методов сопровождается большим числом иллюстраций, изображающих используемую аппаратуру. [c.4]

Распределительная хроматография на бу-№ маге в сочетании с применением органических реактивов является микроаналитическим методом, очень полезным для биохимических исследований. Она широко применяется в тех случаях, когда обычные химические методы малопригодны, например для разделения 0 2+ близких по свойствам соединений аминокислот, пептидов, нуклеиновых кислот, углево-дов. Кроме того, хроматографию на бумаге с успехом используют для определения следов хлорорганических, фосфорорганических и [c.250]

Кроме хроматографии на силикагеле и бумаге, существует также метод распределительной хроматографии аминокислот на крахмале . Сырой картофельный крахмал служит хорошим носителем для водной фазы, содержащей смеси свободных аминокислот и пептидов. Этот метод позволяет избежать необходимости предварительного ацетилирования смеси аминокислот и дает возможность работать с большими количествами их. В то время как полоски бумаги содержат разделяемые вещества в количестве микрограмм, в колонках крахмала количество разделяемых веществ выражается миллиграммами, что значительно облегчает количественное определение. [c.161]

Хроматографию на бумаге используют для разделения близких по свойствам соединений аминокислот, пептидов, нуклеиновых кислот, углеводов. С ее помощью определяют фракции белков сыворотки крови. [c.240]

Оси. работы посвящены исследованию адсорбции и электрофореза. Создал (1931 —1935) метод фронтальной адсорбционной хроматографии, с помощью которого смог анализировать качественно и количественно смеси, содержащие аминокислоты, пептиды, углеводы. В результате проведенных им (с 1935) исследований электрофореза разработал метод электрофоретического анализа биоколлоидов с его различными модификациями (микроэлектрофорез, электрофорез на бумаге, иммуноэлектрофорез). Применил электрофоретический метод для решения ряда прикладных задач биохимии — исследования и разделения нормальной и патологической сывороток, изучения чистых белков и их смесей, ферментов, нуклеопротеидов, нуклеиновых и аминокислот и др. С помощью иммуноэлектрофореза заложил основы изучения белковой структуры нормальной сыворотки крови, выделив из нее три различных белка (теперь их обнаружено более 20). [c.428]

Несмотря на то что количества веществ, разделяемых на бумажной хроматограмме, обычно не превышают нескольких микрограммов, их можно подвергнуть некоторым химическим превращениям, позволяющим более точно идентифицировать отдельные пятна. Автор ограничивается приведением примеров из химии аминокислот и пептидов, хотя аналогичные принципы можно применять и к другим веществам, для разделения которых используют хроматографию на бумаге. [c.479]

По другому способу на свободную аминогруппу в дипептиде действуют динитрофторбензолом [127] (см. также стр. 473), а полученное производное гидролизуют способом, описанным выше. Остаток гидролизата после упаривания на бумажной хроматограмме дает пятно аминокислоты, которая была связана в дипептиде своей аминогруппой, и пятно динитрофенильного производного аминокислоты, которая была связана в дипептиде карбоксильной группой. Существует еще несколько аналогичных способов,позволяющих найти последовательность аминокислот в молекулах пептидов с применением хроматографии на бумаге. [c.480]

Разновидностью распределительной хроматографии является хроматография на бумаге, широко используемая в биохимических лабораториях, в том числе клинических, для разделения пептидов, аминокислот и других веществ (рис. 1.4). В качестве стационарной фазы при этом служит вода, адсорбированная целлюлозными цепями фильтровальной бумаги. Образец помещают на одном конце бумажной полосы, этим же концом бумагу погружают в подходящую смесь органических растворителей (например, бутанол-уксусная кислота-вода в определенных соотношениях). При движении растворителя по бумаге благодаря силе капиллярности происходит разделение компонентов смеси. Проявленную хроматограмму высушивают, а местоположение каждого из разделяемых веществ определяют химическими или физико-химическими методами. [c.28]

Аминокислоты и пептиды можно легко разделить на бумаге или в тонком слое целлюлозы, используя небольшие количества материала. В табл. 20.1 приведены примеры растворителей различных типов или буферов для ионофореза, при использовании которых достигается разделение аминокислот при одномерном фракционировании. Неопределенности могут быть разрешены в результате проведения хроматографии или ионофореза при других pH во втором (перпендикулярном) направлении. [c.388]

Тонкие различия в первичной структуре родственных белков часто удается выявить методом отпечатков пальцев . Метод этот состоит в том, что белок подвергают частичному перевариванию с помощью одного или нескольких протеолитических ферментов, а затем разделяют продукты гидролиза и идентифицируют их, пользуясь для этого либо электрофорезом, либо хроматографией на бумаге. На фиг. 32 приведены полученные таким способом отпечатки пальцев , или пептидные карты , нормального и аномального гемоглобинов. Детальное изучение этих пептидных карт показывает, что все пептидные пятна, за исключением одного, идентичны. Таким способом генетически измененный структурный элемент выявляется очень легко, и для установления природы структурного изменения нет надобности устанавливать полную аминокислотную последовательность всей молекулы. Действительно, в ряде случаев весьма определенные указания относительно природы имеющегося замещения можно получить просто исходя из результатов анализа аминокислотного состава соответствующих пептидов, выделенных из двух белков. Но, конечно, однозначные доказательства замены одной аминокислоты на другую получают только после установления аминокислотной последовательности анализируемых пептидов. [c.96]

Сложные смеси аминокислот или пептидов можно разделять либо с помощью двумерного электрофореза на квадратных листах бумаги, либо проводя одномерный электрофорез в одном направлении, а хроматографию в перпендикулярном направлении (рис. 5.1). [c.134]

Резкая интенсификация научной деятельности за последние десятилетия вынуждает исследователя отказаться от чтения множества узкоспециальных публикаций и большую часть информации получать из заслуживающих доверия обзоров. Эта ситуация наблюдается и в области анализа аминокислот, пептидов и белков, где каждые пять лет появляются новые эффективные методы, способные заменить уже существующие. Например, в настоящее время газожидкостная хроматография успешно конкурирует с автоматической ионообменной хроматографией аминокислот по Муру и Стейну, которая полностью заменила микробиологический анализ, хроматографию на бумаге и другие методы количественного анализа, существовавшие до 1958 г. Определение последовательности пептидов — трудоемкая задача при использовании обычных методов — производится на данном этапе автоматически на секвенсере Эдмана, а последовательность небольших пептидов удобно определять с помощью масс-спектрометрии. [c.6]

Одним нз основных объектов хрОхматографии на бумаге явились с самого начала различные аминокислоты, пептиды и белки. На примере разделения аминокислот была разработана техника распределительной хроматографии отбор проб для анализа, получение и проявление хроматограммы, состав растворителей, и установлена определенная зависимость между структурой аминокислоты и их хроматографическими характеристиками при различном химическом составе и соотношении растворителей в их смеси. Было изучено разделение различных производственных аминокислот, комплексных соединений с катионами металлов, определение аминокислот в микробиологическом материале, после гидролиза, в растительном материале, в тканях животных, в крови, плазме, сыворотке крови, кровяных тельцах, моче, лимфе, эксудатах, спинномозговой жидкости, жидкости глазной камеры, желудочном соке, сперме, молоке, в органах, мускулах, в насекомых, животных, хромозомах, нуклеопротеинах, гисто-нах, протаминах, кератине, при различиях в группах крови и в других объектах. Хроматография помогла также при изучении энзиматических реакций и метаболизма аминокислот, галогени-рованных аминокислот и в других случаях. [c.202]

Техника получения бумажных хроматограмм была уже изложена в общих чертах выше. При хроматографировании аминокислот на бумаге было замечено (Консден и др., 1944), что аминокислоты вступают в реакцию с металлами (например, медью), которые способны образовывать соли с аминокислотами. Это обстоятельство мешает получению достаточно четких хроматограмм. Для устранения указанного дефекта к растворителям добавляют в небольшом количестве такие соединения, которые осаждали бы подобные металлы или образовывали с ними комплексные соедипепия. Такими добавками могут служить HgS, H N, NHg, а-бензоиноксим (купрон). Можно также предварительно обработать бумагу слабым раствором K4Fe(GN)g. Наиболее употребительными растворителями для бумажной хроматографии аминокислот и пептидов являются фенол и коллидин, предварительно насыщенные водой. [c.147]

Иелостатко.лг метола 63 мажной хроматографии в иримене-нии к разделению аминокислот, пептидов и аминов яв.шется то, что бумага ваттман Ai 4 из различных пакетов дает неодинаковые флуоресцентные хроматограммы. Обработка бумаги водой, раствором едкого натра и друпши реагента.ми не устраняет этого недостатка. [c.22]

Если белок подвергать расщеплению в стандартных условиях с использованием различных протеиназ (ферменты, разрываю-1цие пептидные связи), в качестве продуктов образуются небольшие пептиды. Число и типы получающихся пептидов зависят от строения данного белка и вида использованной протеиназы (например, конкретная протеиназа может осуществлять разрыв пептидных связей только после определенной аминокислоты или класса аминокислот). Пептиды можно затем разделить с помощью двумерной хроматографии на бумаге, получая при этом распределение пятен, которое практически никогда не совпадает для различных белков. Такая пептидная карта называется отпечатками пальцев (рис. 8-10). [c.185]

По сравнению с хроматографией на бумаге разделение веществ при помощи электрофореза происходит гораздо быстрее (время разделения при высоковольтном электрофорезе составляет от 1 до 2 час). Подбором соответствующего pH при помощи буфера можно добиться разделения даже очень близких веществ. На рис. 486 показаны примеры разделения смеси аминокислот и пептидов на приборах со средним и высоким напря кением. [c.541]

Впервые хроматография на бумаге была предложена для качественного и количественного определения аминокислот и пептидов, полученных прн гидролизе белка. До настоящего времени этот способ пригодеь для разделения природных веществ — углеводов, липидов, нуклеотидов и др. [c.498]

Полученные таким обраэом липиды Содержат часто также свободные аминокислоты и пептиды, сахар и другие гидрофильные природные вещества, которые попадают в экстракт при добавлении веществ, способствующих растворению, например лецитинов. Отделение этих примесей затруднительно. Для отделения липидов от нелипидов пригодна хроматография на колонках с целлюлозой по Леа и Родесу [70] и препаративная хроматография на бумаге с применением растворителей, описанных Вестлеем, Вреном и Митчеллом [139]. Рекомендуется противоточное распределение [9, 53, 105]. [c.146]

Ионофоретическое разделение смеси веш еств на тонком неорганическом-носителе — ионофорез в тонком слое — было описано независимо друг от друга Пастуска и Тринксом [195] и нами [123]. После того как ХТС была, разработана Шталем [196—200] в виде простой и стандартной методики,, с таким исключительным успехом использованной в первую очередь для разделения липофильных и гидрофильных веществ и превосходящей метод, хроматографии на бумаге, казалось соблазнительным распространить эту методику на метод ИТС. В принципе при осуществлении этой методики не возникает трудностей Консден, Гордон и Мартин [99] уже в 1946 г. успешно применили силикагель в качестве носителя для разделения аминокислот и пептидов методом ионофореза. Их еще слишком сложная методика не нашла широкого распространения по сравнению с ионофорезом на бумаге.. [c.430]

Окисление надмуравьиной кислотой приводит к разрыву этих мостиков с образованием групп SOgH. При этом получаются две фракции А и Б, каждая из которых подвергалась систематическому расщеплению с образованием пептидов. Последние были разделены при помощи метода бумажной хроматографии и другими методами после установления их строения оказалось возможным определить последовательность аминокислот в канедой из двух цепей. Цепь А содержит 21, а цепь Б — 30 аминокислот. Гидролиз природного инсулина химотрипсином, экстрактом поджелудочной железы и кислотами, т.е. в условиях, в которых не разрушаются связи S—S, привел в дальнейшем к получению пептидов, в которых эти мостики сохраняются. Эти пептиды разделяли ионо-форезом на бумаге и определяли их строение. При этом пришли к заключению, что из шести цистеиновых остатков инсулина четыре находятся в цепи А и два — в цепи Б. Последние обеспечивают связь с цепью А при помощи двух цистеиновых остатков цепи А, тогда как два остальных цистеиновых остатка цепи А образуют меньший цикл. Кроме того, было установлено, что из шести амидных групп молекулы три принадлежат аспарагиновым, а три — глутаминовым остаткам. Таким путем пришли к следующему строению инсулина быка [c.432]

Определение различий в молекулах Г. производят путем комбинированного применения хроматографии и электрофореза иа бумаге для разделения нептидов, получаемых при непо1[ном ферментативном гидролизе Г. пептиды разных Г., положение к-рых на двухмерной хроматограмме не совпадает, выделяют, определяя затем последовательность аминокислот в этих отрезках (метод дактилограмм и.ди отпечатка пальцев ). Небольшие отклонения в строении белкового компонента Г. заметно сказываются на физич., физико-химич., химич. и биологич. свойствах Г. [c.419]

Для обнаружения рацемизации можно с успехом использовать ферментативные методы. С этой целью применяли ферменты, специфичные для гидролиза пептидных связей в таких пептидах, в которых вновь образующиеся карбоксильные группы взаимодействуют с а-аминокислотными остатками Ь-конфи-гурации [43]. Гистидилфенилаланиларгинилтриптофилглицин был синтезирован из Ь-аминокислот с применением в качестве конденсирующегося реагента N. М -дициклогексилкарбодиимида [44]. После обработки пентапептида трипсином произошло образование гистидилфенилаланиларгинина и триптофилглицина вместе с большим количеством негидролизованного вещества, как это было показано с помощью хроматографии на бумаге. Расщеплению подверглось только 37 /о пентапептида. Фермент лейцинаминопептидаза привел к образованию гистидина, фенилаланина, аргинина, триптофана и глицина в следующих молярных соотношениях 1 1 0,4 0,4 0,4. Таким образом, оба ферментативных метода показывают, что в продукте реакции содержалось только около 40% от исходного оптически чистого Ь-изомера. Лейцинаминопептидаза также применялась для того, чтобы показать, что октапептид, занимающий положения б—13 в молекуле АКТГ, был синтезирован без рацемизации [45]. [c.182]

Высокоэффективным методом разделения является сочетание электрофореза на бумаге с обычной хроматографией. При этом сначала через влажную бумагу, на которую нанесена смесь, пропускают ток высокого напряжения, а затем смесь хроматографируют с помощью подходящего растворителя в направлении, перпендикулярном направлению электрофореза. В результате достигается разделение первоначальной смеси в двух измерениях. Применение такого метода к продуктам ферментативного расщепления белков позволяет получить двухмерную картину, которую называют пептидной картой. Каждый белок дает характерную для него при каждом конкретном способе расщепления картину. Локализацию отдельных компонентов во многих случаях определяют с помощью специфических красителей. При определении аминокислот и пептидов в качестве такого красителя используют, например, нингидрин. Если производится элюция адсорбированных компонентов, то удобнее всего устанавливать их присутствие в элюате спектрофотометрически. Вероятно, наиболее тонким методом разделения белков следует считать иммуноэлектрофорез, при котором эффект достигается за счет использования различий в двух свойствах электрофоретической подвижности и иммунологической специфичности. [c.220]

Метод пептидных карт на одном листе бумаги сейчас следует рассматривать скорее как аналитический, чем как препаративный. При препаративном разделении пептидов в тех же условиях обычно смесь пептидов последовательно разделяется методами электрофореза и хроматографии в несколько приемов, каждый раз нанося пробу во всю ширину бумаги. После проведения электрофореза вырезают полосы бумаги таким образом, чтобы в середине и по трем краям оставались узкие полоски бумаги. После проявления этих полосок нингидрином вырезанные полосы вставляются обратно, и на них карандашом отмечаются пептидные зоны. Пептиды соответствующих зон с нескольких листов бумаги после смывания объединяются и хроматографируются опять же на полном листе (каждая объединенная зона отдельно). Подобные трудоемкие операции связаны с необходимостью иметь достаточное количество вещества для дальнейшего анализа. Повышение чувствительности методов анализа концевых групп даст возможность определять всю аминокислотную последовательность пептида после получения пептидной карты на одном листе бумаги. Для анализа К-концевых аминокислот уже разработан [8] флуоресцентный метод с 1-диметиламинонафталин-5-сульфонилхлЬри-дом, который в сто раз чувствительнее (достаточно 10 — 10" мкмоль пептида) обычно используемого метода с динитро-фторбензолом [9]. [c.237]

Для определения N-концевых групп пептидов и белков ус-пепшо используют наряду с динитрофенильными производными также фенилтиогидантоины аминокислот [346], которые можно разделять п идентифицировать хроматографией на бумаге [266] или тонкослойной хроматографией на силикагеле [584, 585]. Ванг и сотр. [711] сообщили о применении полиамидных слоев для разделения фенилтиогидантоинов (табл. 35). Распределение Rf очень хорошее, за исключением лейцина и изолейцина. [c.100]

Электрофорез аминокислот и пептидов на бумаге проводили методом Михля с охлаждением инертными жидкостями [69], который может быть успешно использован даже для получения пептидных карт. Примеры разделения пептидов приведены на рис. 12.25, а состав буферов для разделения —в табл. 12.13. Аминокислоты и пептиды разделяли также методом электрофореза в тонком слое целлюлозы [28] и силикагеля [42]. В этом методе хроматография (в основном ТСХ) предшествует электрофорезу, который применяется для анализа во втором направлении (см. табл. 12.5). [c.333]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология