Белки иммобилизация

Поставленные задачи решаются на основе современных методов исследования ферментов. Практическая направленность занятий связана с освоением различных методов регистрации скоростей ферментативных реакций, включающих использование сопряженных ферментных систем и метода радиоактивного анализа. С целью определения активности мембранных ферментов осваиваются техника получения различных субклеточных структур и приемы работы с различными типами детергентов. Проблемы структурного анализа ферментов решаются с привлечением методов избирательной химической модификации белков, флуоресцентных методов, а также методов ковалентной и адсорбционной иммобилизации на различных носителях, включая искусственные фосфолипидные мембраны (липосомы). Кроме того, осуществляется практическое знакомство с различными аспектами кинетического исследования ферментов осваиваются различные способы оценки кинетических параметров, ингибиторный анализ, проводится исслс- [c.329]

Синтез полимерных суспензий с заданным комплексом свойств. В процессе работы были получены устойчивые полимерные суспензии с узким распределением частиц по размеру и заданной поверхностной концентрацией функциональных групп. Иммобилизацию белков на латексе проводили двумя способами - физической сорбцией белка или ковалентным связыванием макромолекулы с поверхностью активированного латекса. Первый способ использовали для иммобилизации антител к наркотикам и конъюгированных антигенов К-ОВА и Г-ОВА на поверхность латекса, не [c.201]

ПодготоЕ ленная путем модифицирования реакцией с -амино-пропилтриэтоксисиланом поверхность достаточно крупнопористого силохрома или силикагеля может быть использована для иммобилизации белков и, в частности, ферментов, нужных для проведения -биокаталитических реакций. Для этого, как указывалось в лек-дии 5, надо провести дальнейшее модифицирование поверхности адсорбента-носителя прививкой агента (глутарового альдегида), способного вступить в реакцию с аминогруппами как модификатора, так и балка. Адсорбент-носитель с привитыми теперь уже альдегидными концевыми группами вводится в реакцию с различными белками. Ра ссмотрим иммобилизацию уреазы — важного фермента, находящего также применение в аналитическом определении мочевины и в аппарате искусственная почка . На рис. 18.9 представлена зависимость активности иммобилизованной уреазы от количества иммобилизованного белка. Адсорбентом-носителем является макропористый силохром со средним диаметром пор 180 нм. Этот размер пор значительно превышает размер глобулы уреазы. Вместе с тем удельная поверхность этого силохрома еще достаточно высока (5 = 41 м /г), чтобы обеспечить иммобилизацию значительного количества уреазы. Из рис. 18.9 видно, что при этом удается иммобилизовать до 120 мг белка на 1 г сухого адсорбента-носителя (это составляет около 3 мг/м ). Активность уреазы снижается не более, чем наполовину, даже при большом количестве уреазы в силикагеле, зато иммобилизованный так фермент можно многократно применять в проточных системах, и он не теряет активности при хранении по крайней мере в течение полугода. [c.341]

Предложено большое число разнообразных методов иммобилизации, основанных как на физической сорбции, так и на ковалентном присоединении белков к носителям. Одним из наиболее полулярных химических приемов является обработка глутаровым альдегидом смеои фермента и полимерного носителя, содержащего аминогруппы. При этом молекулы глутарового альдегида образуют основания Шиффа с аминогруппами белка (в первую очередь е-аминогруппами остатков лизина) и носителя, которые далее могут быть восстановлены до соответствующих аминов [c.159]

При издании книги Введение в биотехнологию на русском языке текст несколько переработан и дополнен новейшими данными. Дана характеристика новых видов сырья, применяемого для приготовления питательных сред для культивирования микроорганизмов. Показана возможность производства богатой белком микробной биомассы не только на средах, содержащих растворимые углеводы, но и на средах, содержащих углеводороды нефти, природного газа, этанол, целлюлозу сельскохозяйственных отходов и др. Расширен раздел о получении ферментных препаратов, в частности показаны принципы иммобилизации ферментов и клеток микроорганизмов, приведены новые данные по микробиологической трансформации органических соединений. Раздел об использовании микробиологических процессов для защиты окружающей среды дополнен последними работами в области утилизации навоза. [c.6]

Иммобилизация на носителях, обладающих активированными производными карбоксильной группы. Наиболее часто для соединения аминогрупп белка с ацильными группировками носителя используют ангидриды, галогенангидриды, активированные эфиры и другие производные карбоновых кислот. Например, [c.92]

Иммобилизованные ферментные препараты обладают существенными преимуществами при использовании их в прикладных целях по сравнению с нативными соединениями, что определяется легкостью отделения от пищевого продукта, многократностью использования дорогостоящего препарата, возможностью осуществления технологических процессов производства и переработки пищевой продукции в непрерывном потоке. Для иммобилизации белков в качестве носителей применяют природные, синтетические полимеры и др. [1]. [c.213]

Рис. 7.8-16. Иммобилизация связывающего белка в мертвом объеме для конкурентного анализа.

Иммобилизация ЛДГ на активированной бромцианом агарозе позволяет достаточно легко получать различные формы ЛДГ, в частности мономер. В зависимости от условий эксперимента и степени активации носителя в образовании ковалентных связей между белком и агарозой может участвовать различное число субъединиц фермента. Необходимым условием получения мономерной формы является наличие препарата ЛДГ, иммобилизованного через одну субъединицу. [c.386]

Иммобилизация липидов может происходить в результате латерального фазового разделения, приводящего к образованию гелевой фазы, или при их взаимод. с белками. Предполагается, что интегральные белки окружены пограничным слоем липидных молекул (т. наз. аннулярные липиды), подвижность к-рых ограничена или, по крайней мере, нарушена в результате контакта с неровной пов-стью белковой глобулы. [c.30]

Э. Гриффин, 1916), но и сейчас не потеряла своего значения и стала наиболее широко распространенным способом получения иммобилизованных ферментов в промышленности. В литературе описано получение адсорбционным способом более 70 иммобилизованных ферментов с использованием главным образом таких носителей, как кремнезем, активированный уголь, графитов сажа, различные глины, пористое стекло, полисахариды, синтетические полимеры, оксиды алюминия, титана и других металлов. Последние применяются наиболее часто. Эффективность адсорбции молекулы белка на носителе определяется удельной поверхностью (плотностью центров сорбции) и пористостью носителя. Процесс адсорбции ферментов на нерастворимых носителях отличается крайней простотой и достигается при контакте водного раствора фермента с носителем (статистическим способом, при перемешивании, динамическим способом с использованием колонок). С этой целью раствор фермента смешивают со свежим осадком, например, гидроксида титана, и высушивают в мягких условиях. Активность фермента при таком варианте иммобилизации сохраняется практически на 100%, а удельная концентрация белка достигает 64 мг на 1 г носителя. [c.88]

Когда примеси, вызвавшие образование неспецифических антител, легче очистить, чем исследуемый антиген, то другой способ избавиться от неспецифических антител фракции IgG иммунной сыворотки состоит в иммобилизации на носителе этих очищенных примесей. Тогда первая элюированная фракция содержит все белки раствора IgG (включая и нужные антитела), за исключением неспецифических антител, если хроматография проводится в условиях ненасыщения. В этом случае отсутствует проблема десорбции. [c.109]

Поверхностная иммобилизация может вызывать изменение конфигурации белка и в связи с этим изменение кинетики иммунного анализа. [c.574]

Эту хроматографию можно применять во всех случаях, когда белки или пептиды содержат сульфгидрильные группы, чтобы их изолировать, разделить, иммобилизовать, если это, например, ферменты. Она пригодна также для иммобилизации или выделения полинуклеотидов, содержащих ртуть. [c.84]

Кроме очистки стоков от загрязняющих веществ, немаловажное значение имеет извлечение ценных компонентов из растворов. Сорбционное концентрирование широко применяется в аналитической химии белков, так как позволяет избирательно выделять эти вещества из биологических сложных систем. Изучена адсорбция бычьего сывороточного альбумина (БСА) на незаряженной и поляризованной поверхности исходного и модифицированного гидроксидом титана углеродного волокна. Подобраны оптимальные условия иммобилизации белков на тонкослойных сорбентах. Показано, что для тонкослойных покрытий гидроксидом титана степень обратимости адсорбции белка зависит от текстуры исходной матриш.1. Изменение заряда повфхности волокна оказывает значительное влияние на адсорбируемость БСА модифицированным сорбентом, что обусловлено различными поверхностными свойствами исходного и титансодержащего волокна. Подобраны условия электродесорбции БСА с поверхности волокнистых материалов. [c.208]

Белки оводненных органов растений (листья и клубни). Экстрагирование растительных белков из клубней не требует перевода в растворимое состояние, а лишь разделения жидкой и твердой фаз. Это разделение, однако, трудно реализовать ввиду того, что жидкие фазы оказываются иммобилизованными в клетках вегетативных органов. Их иммобилизация является результатом, с [c.430]

Хроматографический сорбент с АГП был получен на основе силикагеля с размером пор 300 А, на котором белок был иммобилизован путем изменения его функциональных групп и последующего сшивания, осуществляемого таким образом, чтобы образовавшиеся агрегаты были достаточно большими и могли удерживаться в порах. АГП содержит пять углеводных фрагментов, на долю которых приходится 45% его молекулярной массы. Окислением перйодатом натрия первичные спиртовые группы этих углеводных фрагментов превращаются в альдегидные. Закрепление модифицированного белка на силикагеле проводится путем повышения pH буферного раствора, что вызывает его сшивание через образование оснований Шиффа. Для получения гидролитически устойчивых связей последние восстанавливаются до иминогрупп с помощью циан-борогидрида натрия [94]. Процесс иммобилизации показан на схе- [c.137]

В приведенных ниже примерах аффинную хроматографию на ДНК, иммобилизованной на целлюлозе путем высушивания или с дополнительной пришивкой УФ-облучением, использовали для очистки ДНК-узнающих белков. При этом не предпринималось Гникаких усилий по отбору для иммобилизации каких-либо определенных участков ДНК белки сами находили в гетерогенной популяции молекул ДНК участки своего биоспецифического связывания. [c.424]

Иммобилизация включает любое ограничение свободного движения молекул белков фермента или их фрагментов в пространстве. Это открывает огромные возможности использования в медицине в качестве лекарственных средств (в терапии и в диагностике) целого класса биоорганических катализаторов с заданными свойствами и временем высвобождения [29, 30, 31]. [c.206]

На практике иммобилизация часто осуществляется одновременно иеск. способами. Так, при фиксации ферментов ковалентными связями между их молекулами н матрицей обычно возникают также нековалентные взаимодействия. Известны способы предварит, хим, модификации молекул фермента низкомол, в-вамн или р-римыми полимерами, имеющими заряженные группировки, что изменяет у таких модифицир. белков электростатич. заряд молекулы и позволяет достаточно прочно сорбировать их на ионообменных смолах. При всех типах иммобилизации матрица, взаимодействуя с ферментом, может инактивировать последний или создавать пространств, затруднения для доступа субстрата к активному центру. При ковалентном связывании фермента для предотвращения отрицат, влияния матрицы между ией и молекулой фермента вводят разобщающую цепь атомов-спейсер (наз. также вставкой или ножкой ). Кроме того, часто стремятся использовать для иммобилизации гидрофильные матрицы, создающие вблизи фермента более естеств, микроокружение. [c.215]

При иммобилизации ферментов в макропористых кремнеземах (размеры пор должны значительно превышать размеры фермента) нйдо обеспечить, во-первых, химическую связь с поверхностью кремнезема и, во-вторых, достаточную подвижность фермента в среде, чтобы обеспечить доступ субстрата к каталитически активному центру фермента. Поэтому прививка фермента к поверхности должна быть произведена через достаточно длинную конформаци-онно подвижную цепь. Для соединения такой цепи с ферментом можно использовать аминогруппы полипептидных цепей белка. Поэтому к поверхности кремнезема следует привить модификатор, также содержащий концевые аминогруппы, а затем аминогруппы модификатора поверхности и фермента сшить друг с другом. Для [c.108]

В рассмотренных датчиках антигены образуют комплексы с антителами, иммобилизованными на электроде. Ключевым фактором при этом является иммобилизация одного из компонентов в полимерную пленку, гель или на поверхности электрода. Методика иммобилизации должна обеспечивать не только сохранение имму-нохимической активности белка, но и не вызывать химических или физических изменений поверхности электрода, которые могут привести к нежелательным эффектам. В этом плане большую привлекательность имеет ковалентная пришивка молекул белка с помощью сшивающих реагентов. Для получения устойчивого слоя антител необходимо, чтобы их число было минимальным, иначе может произойти связывание антител между собой. [c.507]

Иммобилизация ферментов на носителях, обладающих аминогруппами. Первичные аминогруппы носителя, связанные с ароматическим кольцом, предварительно превращают в соли диазо-ния, которые затем подвергают разнообразным реакциям сочетания. В реакции сочетания вступают фенольные, имидазольные, аминные, гуанидиновые, тиольные группы белков. Так, в щелочной среде фенольные радикалы тирозина образуют прочные азосоединения, в составе которых белок связан с носрггелями [c.92]

Во всех методах сложно осуществить присоединение белка к поверхности преобразователя, поскольку оно не должно затрагивать активный участок. Если модифицированную поверхность использовать непосредственно без метки или медиатора, нужно предотвратить все иеспецифические взаимодействия, поскольку прямые измерения без метки, включающие обычно контроль изменения массы или показателя преломления на поверхности, не могут различить специфические или неспецифические взаимодействия. При иммобилизэл ции поверхности с плотной упаковкой неспецифическое связывание не происходит, тем не менее, иммобилизация часто бывает неэффективной для о а-зования комплекса антитело-антиген из-за стерических препятствий. Наоборот, упаковка с большими промежутками обычно допускает неспецифические взаимоде твия с расположенной ниже поверхностью, и, таким образом, можио з егистрировать значительные ошибочные сигналы. [c.525]

Для твердофазной иммобилизации более всего подзюдят стеклянные шарики. IgG адсорбируется либо на стеклянную, либо на пластиковую поверхность, так что это метод пассивной иммобилизации, оптимальный при тейтральюм pH. Высокую загрузку белка получают при таких размерах частиц, которые обеспечивают адсорбцию 10-15% белка из раствора. Используют также ковалентное присоединение, но это обычно требует большей подготовки иммобилизованного слоя (химия связьшгшия подобна изображенной на рис 7.8-7 в 7.8-8). Потребность в этом определяется приложением в дальнейшей обработкой иммобилизованного IgG. [c.578]

Принцип, положенный в основу методов RIA [91, 117], аналогичен принципу методов ELISA эти методы в основном различаются тем, что для мечения вместо ферментов применяются радиоактивные элементы (главным образом йод) [49]. Широко используемый вариант этого метода не предусматривает иммобилизацию одного из реагентов реакция проходит в растворимой фазе, поэтому очень важным дополнительным этапом является отделение меченых реагентов, участвующих в иммунокомплексах, от тех, которые не участвуют. Если антиген представляет собой белок, обычно проводят разделение иммунокомплекса, осаждая его антителами к иммуноглобулинам кролика (если специфические антитела к белку индуцированы у кролика) [49]. [c.108]

В качестве последнего примера белков, связывающих малые молекулы, уместно рассмотреть лектины. Эти белки, чаще всего встречающиеся в растениях (но не только в них), связывают производные углеводов со значительной степенью стереоспецифичности. Впервые лектины привлекли внимание исследователей своей способностью агглютинировать эритроциты посредством связывания гликопротеинов мембран. Некоторые лектины специфичны к индивидуальным групповым веществам крови. Интерес к ним увеличился после того, как было обнаружено, что некоторые из лек-тинов агглютинируют преимущественно злокачественные клетки. Посредством иммобилизации на нерастворимом носителе типа агарозы лектины могут быть использованы для очистки гликопротеинов методом афинной хроматографии. Наиболее изученным лек-тином является конкавалин А для этого белка определены аминокислотная последовательность из 238 остатков и трехмерная структура. Конформация конкавалина А весьма примечательна. Семь участков его единственной полипептидной цепи формируют антипараллельную складчатую структуру, а шесть последующих участков образуют другую антипараллельную структуру, перпендикулярную первой. Ион Mn + координирован с двумя молекулами воды и боковыми радикалами Н18-24, 01и-8, Азр-Ш и Азр-14, образуя октаэдр. Ион Са +, расположенный на расстоянии 0,5 нм от Мп +, делит с ним два последних лиганда, а также связан с карбонильным кислородом Туг-12, боковым радикалом Айп-14 и двумя молекулами воды и также образует октаэдрическую конфигурацию. Остатки глюкозы и маннозы связываются в глубоком кармане размером 0,6 X 0,75 X 1,8 нм, образованным, как это ни удивительно, гидрофобными остатками. [c.562]

Метод спектроскопии ЯМР был использован [37] для изучения взаимодействия между белком гликофорином из мембран эритроцитов и дипальмитоилфосфатидилхолином, меченным изотопом по метнльным группам холиновой головки. При температурах ниже температуры фазового перехода фосфолипидов в спектре ЯМР наблюдались два сигнала узкий и широкий. Узкий пик был отнесен к холиновой головке, которая, как полагают, более подвижна в непосредственной близости к белку этот вывод не исключает возможности иммобилизации алкильных цепей таких пограничных липидов и. гледпвятельно, может не противоречить результатам, полученным при изучении поведения пограничных липидов в цитохромоксидазе и кальцийзависимой АТР-азе. [c.125]

На основании анализа литературных и экспериментальных данных о стрз стуре НК, взаимодействии каучуковой части НК с белком МИТХТ предложен принципиально новый способ улучшения свойств изопренового синтетического каучука путем создания в его массе структур, аналогичных НК, за счет введения частиц с необходимым уровнем дисперсности и физического взаимодействия с эластомерной матрицей. Суть предложенного способа заключается в иммобилизации гидрофобных белков на макромолекулах методом обращенных мицелл с использованием в качестве ПАВ фосфолипидов. Получены образцы модифицированные лецитином, белкозином, кератином, белково-липидными комплексами (БЛК) разных штаммов. [c.31]

Природный токсин стрихнин (рис. 9.21) оказался полезным пнструментом для выделения и биохимической характеристики глицинового рецептора. Его [Ш] производное имеет сродство, достаточно высокое для того, чтобы его можно было использовать в тестах связывания рецепторного белка (7 0=11,3 нМ), а иммобилизация стрихнина на аффинной колонке позволила Бецу и сотр. очистить рецептор, солюбилизированный тритоном, Б 1000 раз за одну стадию. Более того, будучи фоточувствитель-ным соединением, стрихнин оказался и без химической модификации удобной фотоаффинной меткой. УФ-облучение комплекса стрихнина и рецептора приводит к ковалентному мечению только одного полипептида (М 48 ООО). [c.295]

Одним из эффективных способов стабилизации ферментов является их иммобилизация, т. е. перевод в водонерастворимое состояние путем связывания с носителем или модифицирование водорастворимыми полимерами с полным или частичным со фанением ферментами каталитической активности. Разработаны физические и химические способы иммобилизации ферментов. К физическим способам иммобилизации относятся адсорбция на нерастворимых носителях включение в пбры геля или полимера тфостранственное отделение фермента от остального объема реакционной системы полупроницаемой перегородкой (мембраной). Химическая иммобилизация осуществляется за счет создания ковалентных связей между белком и носителем с участием сшивающих агентов (например, глутарового альдегида). [c.111]