Высаливание и денатурация

В основу работы по выделению и очистке белков положены такие свойства белков, как растворимость, наличие заряда, молекулярная масса. На различиях в растворимости белков основаны методы высаливания, а именно осаждение белков сульфатом аммония или хлоридом натрия. Такое осаждение представляет собой обратимую денатурацию, так как белки при добавлении воды вновь растворяются и не теряют нативных свойств. [c.24]

Высаливание и денатурация белков. [c.255]

Белки из растворов легко осаждаются солями тяжелых металлов (свинца, меди, серебра, ртути и др.), образуя с ними прочные солеобразные и комплексные соединения. В отличие от высаливания солями щелочных и щелочноземельных металлов для осаждения солями тяжелых металлов требуются небольшие концентрации последних. В случае применения уксуснокислого свинца и сернокислой меди избыток этих солей вызывает растворение обра-зовянного ими осадка. Такое растворение объясняется адсорбцией избытка ионов металла и перезарядкой белкового комплекса, вследствие чего в раствор переходит комплекс измененного белка с металлом. Благодаря тому же механизму добавление дссгаточного количества хлористого натрия вызывает рг с творение осадка ртутного соединения белка. Белковые осадки, полученные действием солей тяжелых металлов, однако, нерастворимы в первоначальном растворителе, т. е. в воде или слабых растворах солей. Таким образом, осаждение белков солями тяжелых металлов следует отнести к необратимым реакциям осаждения, связанным с денатурацией белка. [c.23]

Неорганические электролиты (ионы солей) по своему эффекту могут быть разделены на три группы а) стабилизирующие нативную структуру б) снижающие устойчивость глобул и в) смешанного действия — усиливающие денатурацию в малых и средних концентрациях и ослабляющие ее при более высоких. Как мы установили, стабилизация является результатом эффекта, подобного высаливанию, при концентрациях солей, не приводящих, однако, к осаждению белка. Высаливающие соли стабилизируют белки с различной интенсивностью, соответствующей положению соли в лиотропном ряду Гофмейстера сульфат — фосфат — цитрат — тартрат — ацетат — хлорид — роданид. Это ряд высаливания. По силе стабилизирующего действия анионы располагаются в аналогичный ряд. Ионы солей, введенные в раствор, усиливают гидрофобные связи в молекуле белка и этим упрочняют его структуру. [c.166]

Больщинство белков выделяется из водных растворов солями щелочных или щелочноземельных металлов, не подвергаясь при этом денатурации. Так как многие белки по-разному относятся к различным высаливающим средствам (солям), то таким путем часто удается их разделять. Для высаливания белков применяют хлористый натрий, сернокислый натрий, уксуснокислый натрий, уксуснокислый калий, сернокислый магний, азотнокислый кальций, сернокислый аммоний, сернокислый цинк и другие соли. Некоторые из них осаждают белки, даже будучи прибавлены к раствору в небольшом количестве, что может быть с успехом использовано для дробного выделения белков. [c.62]

Осаждение белков солями тяжелых металлов (в отличие от высаливания) происходит при небольших концентрациях солей. Белки при взаимодействии с солями тяжелых металлов (свинца, меди, серебра, ртути и др.) адсорбируют их, образуя с ними солеобразные и комплексные соединения, растворимые в избытке этих солей (за исключением солей AgNOз, НяС12), но нерастворимые в воде. Соли тяжелых металлов вызывают необратимое осаждение белков, т.е. денатурацию. Растворение осадка в избытке солей называется адсорбционной пептизацией. Данное явление происходит вследствие возникновения одноименного положительного заряда на частицах белка. [c.28]

Как показали исследования, высокомолекулярные вещества, выделенные из раствора высаливанием, после отмывки их от электролитов могут быть снова переведены в раствор (явление обратимо). Коллоиды, которые при устранении фактора, вызвавшего коагуляцию, способны переходить из состояния геля в состояние золя, носят название обратимых коллоидов. Однако высокомолекулярные вещества могут при определенных условиях осаждаться и необратимо. Такое необратимое осаждение высокополимеров, в частности белков, иод влиянием высокой температуры, цри воздействии концентрированных кислот и щелочей, дубильных веществ, лучистой энергии называется денатурацией. При денатурации происходит не только осаждение полимеров, но и изменение их химической природы. Белки при денатурации становятся нерастворимыми и в большинстве случаев утрачивают способность к набуханию. [c.383]

Однако, хотя высаливание сернокислым аммонием является примером обратимой коагуляции, не сопровождающейся денатурацией, Л е п е И] к и н показал, что если высоленный белок долго находится в осадке, он все же денатурируется и теряет растворимость. [c.325]

Осаждение белков солями щелочных металлов и магния не сопровождается денатурацией, т. е. изменением структуры молекул белка поэтому такое осаждение—высаливание—обратимо, и полученные осадки при добавлении воды снова переходят в раствор. [c.353]

После достижения полной экстракции белков, т.е. перевода белков в растворенное состояние, приступают к разделению —фракционированию смеси белков на индивидуальные белки. Для этого применяют разнообразные методы высаливание, тепловую денатурацию, осаждение органическими растворителями, хроматографию, электрофорез, распределение в двухфазных системах, кристаллизацию и др. [c.26]

Для растворенных веществ несложной структуры можно ожидать изменений в проявляемой ими тенденции удаляться из раствора или изменений коэффициентов активности под действием одновременно присутствующих в растворе веществ, влияющих на их растворимость летучесть и реакционную способность. Взаимодействия между макромолекулами в растворе, напротив, часто обратимо (и необратимо) влияют на структуру, что проявляется, например, в утрате активности при денатурации ферментов и изменениях точек плавления гелей. В равновесии кроме твердой фазы могут участвовать следующие типы частиц в растворе нативные макромолекулы, олигомерные или полимерные агрегаты, денатурированные макромолекулы. На рис. 1. 19 показаны структурные соотношения между этими типами частиц. К, е-т к пониманию наблюдаемого влияния солей и других растворенных веществ па эти равновесия состоит в том, что в каждом из состояний, изображенных на рис. 1.19, для растворителя доступны в различной степени те или иные группы молекул [253, 287, 351]. Хорошо известно, что конформации, которые макромолекулы,принимают в растворе, определяются стремлением к сближению всех гидрофобных групп между собой и к обеспечению доступа растворителя к гидрофильным группам [338]. В целом степень доступности молекулы для растворителя возрастает в ряду твердый белок < агрегированный или полимерный белок < нативный мономерный белок < денатурированный белок [287]. Однако, по-видимому, в каждом из этих случаев для растворителя оказываются доступными различные совокупности полярных и неполярных групп, причем степень доступности и состав групп зависят от природы макромолекулы. Влияние растворенных веществ на денатурацию, высаливание, деполимеризацию и т.д. можно объяснить, если учесть взаимодействия разных индивидуальных групп (заряженных, неполярных, полярных) [2871. [c.138]

В начале, по-видимому, всегда целесообразно отделить заметную часть балластных белков путем фракционной денатурации прогреванием или осаждением в слабокислой среде. Наоборот, кристаллизацию выгоднее проводить на заключительных этапах очистки. Основными операциями, выполняемыми на средних стадиях, являются фракционирование органическими растворителями, нейтральными солями, адсорбцией или хроматографическим разделением на колонках, в том числе с применением ионообменников. Очень важно, по возможности, чередовать этапы таким образом, чтобы избежать операции диализа. Так, высаливание, удобное в качестве первого этапа, требует диализа, но фракционирование спиртом позволяет его избежать. Простого прибора для быстрого диализа больших объемов жидкостей пока еще не существует можно полагать, что из всех способов очистки диализ — самый медленный и неудобный. Его легче проводить в заключительных стадиях, когда вещества уже мало и объемы невелики. Во время диализа возможны значительные потери активности фермента. С большими объемами жидкостей неудобно работать и в колонках последние лучше использовать [c.155]

Работа 9. Высаливание и денатурация яичного альбумина [c.173]

При высаливании структура белка не повреждается. После удаления соли белок вновь приобретает гидратную оболочку и растворяется. Денатурация белка — практически необратимый процесс. Белок, осажденный кипячением при изоэлектрической точке, после остывания смеси обычно не растворяется. [c.32]

У заряженных полимеров (белков) высаливание сильно зависит от pH среды. Наиболее (с наименьшим порогом концентрации) оно выражено в изоэлектрической точке (С-потенциал равен 0). При этом вышеуказанный порядок ионов имеет место для белков только в щелочной среде, а в кислой среде этот порядок становится обратным в сильно кислой среде явление высаливания оказывается даже необратимым, так как происходит денатурация белка. [c.223]

Препараты природных макромолекулярных нуклеиновых кислот получают обычно из нуклеопротеидов, экстрагируемых из тканей солевыми растворами или водой. Если эти нуклеопротеиды осторожно диализовать или подвергнуть встряхиванию с хлороформом [259], то они расщепляются на белок и полимерную нуклеиновую кислоту. Белок может быть удален путем его денатурации или при помощи высаливания хлористым натрием [260]. Молекулярный вес макромолекулы нативной тимо-нуклеиновой кислоты, по данным различных исследователей [261—264], варьирует от 820 000 до 3 700 000. Длина нитевидной [c.260]

Избыток детергента может мешать фракционированию. Например, высаливание сульфатом аммония приводит к появлению на поверхности раствора слоя тритона Х-100, в котором часто содержатся нужные белки. Однако эффективного разделения при этом не происходит. Можно провести колоночную хроматографию или отделить белки с помощью гель-фильтрации (разд. 5.1), но не исключено, что мицеллы детергента будут двигаться в той же зоне, что и белок, и, следовательно, окажутся в одной фракции. Ионообменная хроматография успешно осуществляется в присутствии неионных детергентов (разд. 4.2 и 4.3). Действительно, тритон Х-100 в концентрации до 1% оказывает незначительное влияние на ионообменные свойства нормальных водорастворимых белков. Но солюбилизированные белки мембран могут находиться только в составе детергентных мицелл, что существенно влияет на процесс ионного обмена. Если исследуемый белок удается адсорбировать на ионообменнике, то избыток детергента свободно проходит через колонку. Это позволяет элюировать свободный (относительно) от детергента белок. С другой стороны, если полное удаление детергента приводит к денатурации белка, то, чтобы предотвратить это, в буфер вносят небольшое количество детергента (<0,1 7о). Собранная фракция будет, конечно, тоже содержать некоторое количество детергента. Тем не менее, так как обычно из смеси белков выделяют какой-то определенный фермент, присутствие в конечном препарате незначительной концентрации чистого детергента, не загрязненного жирами, не принесет большого вреда. Методы удаления избытка детергентов были недавно суммированы в обзоре [23]. [c.55]

К первому типу относятся такие явления, как 1) чрезмерное осмотическое обезвоживание клеток, в результате которого уве-ллчивается концентрация внутриклеточных веществ, приводящая к высаливанию и необратимой денатурации растворимых белков или к повреждению мембранных структур из-за потери обеспечивающей их нормальное состояние доли воды 2) разрушение клетки за счет контакта с омывающей кристаллы льда средсгй., концентрация растворенных веществ в которой из-за превраще -ния части растворителя в лед непрерывно увеличивается вплоть до эвтектической области 3) резкое изменение кислотности иг ионной силы растворов вне и внутри клеток в процессе замораживания 4) повреждение клеточной мембраны вследствие до<-стижения клеткой минимального объема. [c.57]

Из имеющихся в настоящее время данных, однако, можно заключить, что воздействие на заряженные группы в общем мало существенно при рассмотрении влияния концентрированных солей на денатурацию и осаждение белков в нейтральной области pH. Абсолютная растворимость белка, такого, как карбоксигемоглобин, зависит от pH, поскольку белок имеет минимальную растворимость, когда его общий заряд близок к нулю. Однако влияние концентрированных растворов солей на его растворимость, мерой которой является величина /с.,, характеризующая высаливание, по-видимому, не зависит от pH и заряда белка [26]. Это показано на рис. 8, где приведены данные по влиянию фосфата на растворимость карбоксигемоглобина. [c.293]

Групповое разделение белков. Высаливание — разделение белков на фракции по их растворимости. Принцип метода заключается в дегидратации белков (обычно с помощью сернокислого аммония) при pH, близком к Р1. Различные белки выпадают в осадок при разных концентрациях соли. Это грубый метод разделения на группы. Например, глобулины выпадают в осадок при полунасыщении, а альбумины — при полном насыщении (НН4)2804. Избирательная денатурация — это выпадение в осадок при нагревании раствора до 50 °С или при подкислении среды до pH 5,0. Если выделяемый белок устойчив к нагреванию и изменению pH, то часть ненужных белков можно удалить таким простым способом. Органические растворители при низких температурах используются для щадящего группового разделения белков. По методу Кона белки плазмы крови фракционируют спиртом при температуре 3—5 °С альбумины — спирт 40%, pH 4,8, при 1-5 °С р, у-глобулины — спирт 25%, pH 6,9, при 1-5 °С а-глобулины — спирт 18%, pH 5,2, при 1-5 °С фибриноген — спирт 8%, pH 7,2, при 1-3 °С а2-глобулин — спирт 40 , pH 5,8, при 1—3 °С. Диализ — освобождение белковых растворов от низкомолекулярных соединений (например, от сернокислого аммония (NH4)2S04). Белки не проходят через полупроницаемую мембрану, а низкомолекулярные вещества проходят, что и позволяет очистить раствор белков от низкомолекулярных примесей. Получаем группу (смесь) белков, обладающих близкими физико-химически-ми свойствами. [c.50]

При обратимом осаждении макромолекулы бе-чка в основном не подвергаются глубокой денатурации, а осадки могут быть снова растворены в первоначальном растворителе (например, воде). Обратимое осаждение вызывается дейстгзием нейтральных солей аммония, ни лоч-ных и н елочноземачьных металлов (высаливание), спирта, ацетона, эфира и незсоторых других органических растворителей. [c.19]

Технология максимально очищенных препаратов сложнее технологии других фитопрепаратов, поскольку из полученных вытяжек необходимо удалить балластные вещества, не затронув при этом терапевтически ценных компонентов. Для удаления балластных веществ наряду с методами, характерными для очистки других фитопрепаратов (спиртоочистка, денатурация), применяются своеобразные, типичные только для производства максимально очищенных препаратов методы. К ним относятся 1) фракционированное осаждение, достигаемое сменой растворителя, высаливанием, осаждением балластных веществ солями тяжелых металлов 2) жидкостная экстракция, в основе которой лежит переход вещества из одной жидкости в другую, не смешивающуюся с первой 3) сорбция — поглощение вещества на поверхности какого-либо сорбента. [c.409]

При выделении ферментов и других белков часто пользуются высаливанием при помощи сульфатов. Для дальнейшей очистки от солей раствор белка подвергают длительному диализу, что иногда приводит к денатурации. Очень удобным методом отделения белков от солей является фильтрация через декстрановый гель. [c.132]

Белки могут образовать с липидами растворимые и нерастворимые комплексы. К первому типу принадлежат липопротеины крови и других жидкостей организма животных. Плазма крови, несмотря на то, что она представляет собой прозрачную жидкость, содержит 0,5—0,7% нерастворимых липидов. Значительная часть этих липидов не может быть извлечена из плазмы обычно применяющимся для этой цели эфиром или другими неполярными растворителями. Машбёф рассматривает это как доказательство того, что указанная часть липидов находится в соединении с белками, образуя комплексы, которые он назвал синапсами [3]. Эти липопротеиновые комплексы осаждаются при обычном высаливании сернокислым аммонием [4]. Некоторое количество липидов можно обнаружить также во фракциях белков, полученных электрофоретическим путем [5]. Комплексы липопротеинов расщепляются при комнатной температуре этиловым спиртом и ацетоном, причем большая часть липидов, отцепившихся от комплекса после обработки спиртом, может быть извлечена эфиром. Для того чтобы избежать денатурации белков, рекомендуется производить расщепление комплекса липопротеинов спиртом и эфиром при низких температурах [6] или путем повторного замораживания и оттаивания этих комплексов в присутствии эфира 7]. [c.228]

Выше было уже упомянуто об образовании слабо растворимых солей (например, хлоридов и сульфатов) белковых катионов з кислой по отношению к изоэлектрической точке области [195, 202] и об использовании этого явления, например, для выделёнйя кристаллического сульфата альбумина плазмы [106]. Было получено также несколько кристаллических солей лизоцима [204]. Белковые соли, содержащие тяжелые комплексные анионы, например воль-фрамат-, фосфовольфрамат-, трихлорацетат- или метафосфатионы, а также соли, содержащие катионы тяжелых металлов — цинка, меди или ртути, — известны уже давно и применялись для освобождения раствора от белков перед некоторыми анализами [10, 78]. Предполагалось, что эти реагенты при их применений действуют на белки сильно денатурирующим образом. Вслед з-а кристаллизацией цинковой соли инсулина [205, 206] и метафос-фата яичного альбумина [207] недавно последовало приготовление серии кристаллических производных инсулина [208] и сывороточных альбуминов человека [209, 210]. Последние были получены в присутствии ионов, концентрация которых была недостаточна для высаливания (если не добавлять в количестве 5—30% органического растворителя и во избежание денатурации не вести процесс при низких температурах). В этих условиях многие из указанных солей менее растворимы, чем свободный белок или соли с такими катионами, как натрий или калий, и, следовательно, могут найти применение при выделении белков [51] (4). Были получены также кристаллические додецилсульфатпроизводные Р-лактоглобулина [211]. [c.51]

Примером обратимой коагуляции может служить высаливание — коагуляция белков под влиянием электролитов. Например, если к водному раствору белка прибавить раствор сернокислого аммония достаточной концентрации, белок выпадает из раствора в форме хлопьев, то есть коагулирует. Но по устранении причины, вызвавшей коагуляцию, в данном случае по удалении раствора, содержащего сернокислый аммоний, промытый осадок снова растворяется в дестиллированной воде — белок возвращается в свое первоначальное состояние здесь коагуляция не. сопровождается денат> рацией. Следовательно, денатурация представляет собой процесс необратимой коагуляции обратимую же коагуляцию можно рассматривать, как чисто коллоидохимический процесс. [c.325]

Из органических растворителей для фракционирования белков широко применяют метиловый и этиловый спирты (во избежание денатурации белка процесс ведут при температуре около 5° С). В этих случаях также предварительно строят разностные диаграммы. На рис. 8 приведены данные о концентрациях этилового спирта при осаждении разных фракций белков сыворотки крови человека. Этот метод нашел широкое применение при выработке заменителей крови, так как позволяет извлекать из нее необходимые ингредиенты и длительно сохранять их. При фракционировании белков иногда сочетают высаливание и осаждение спиртом, применяя спиртосолевые растворы. [c.27]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология