Требования к антигену

Среди -различных требований, предъявляемых к современному биохимическому анализу, самым важным является специфичность, т. е. способность детектировать данное вещество в сложных многокомпонентных средах, таких, как сыворотка крови, сок растений или ферментационная среда. Наибольшей специфичностью обладают иммунохимические методы, основанные на реакции антител с антигеном, образующие друг с другом прочные комплексы. Возможность получения высокоспецифичных антител к широкому кругу различных веществ в сочетании с чувствительными методами регистрации образовавшихся комплексов обусловливают широкое практическое использование методов иммунохимического анализа в различных областях медицины, ветеринарии, растениеводства, охраны окружающей среды, контроля биотехнологических процессов, научных исследованиях. [c.99]

Конкурентные методы анализа используют для различных антигенов, но чаще всего для определения гаптенов. Они отличаются простотой постановки реакции, но имеют ряд ограничений. Во-первых, в конкурентных методах предъявляются высокие требования к стандартизации количества связанных и добавленных реагентов. Во-вторых, чувствительность этих методов определяется в основном константой связывания антител. [c.118]

Другая особенность ИФА, с которой сталкивается начинающий разработчик этого метода, является кажущаяся простота изготовления реагентов и выбора оптимальных условий его проведения. Так как метод высоко чувствителен, а измерения носят количественный характер, то исключительно высокие требования предъявляются к качеству реагентов, которые во многих случаях исследователь готовит самостоятельно. В настоящее время накоплен большой опыт в создании реагентов для ИФА, известны критерии, которым они должны удовлетворять, чтобы достичь необходимой чувствительности, изучены основные закономерности реакции антиген— антитело в растворе и на твердой фазе, что позволяет целенаправленно оптимизировать условия проведения анализа. [c.3]

Основной проблемой, стоящей особенно остро при введении ферментной метки в низкомолекулярные соединения, является доступность антигенных детерминант в образовавшемся конъюгате для взаимодействия с антителами. При использовании меченых гаптенов необходимо, чтобы связь маркера с ним осуществлялась через ту же функциональную группу, которая модифицировалась для синтеза конъюгата белок — гаптен для целей иммунизации и получения антител. Это накладывает дополнительные требования на выбор фермента-маркера. Кроме того, разделение конъюгата гаптен — фермент от несвязавшегося фермента, примесь которого может оказывать негативное влияние на результаты анализа, крайне затруднительно. Другим существенным условием получения меченых гаптенов является доступность очищенного антигена в значи-гельном количестве, что осуществимо далеко не всегда. [c.100]

Таким образом, для максимального приближения калибровочной зависимости к -кривой титрования концентрация центров связывания должна быть меньше констант диссоциации комплексов антител с определяемым и меченым антигенами, а степень заполнения антител меченым антигеном должна быть крайне низкой. Последнее положение логически" понятно, так как влияние меченого антигена на связывание определяемого антигена должно быть пренебрежимо мало. Однако реально это требование трудно выполнимо из-за сложности достоверной регистрации изменения концентрации метки в комплексе с антителами при варьировании концентрации определяемого антигена. Если считать достаточно малыми такие значения параметров, при которых нижний предел детекции антигена увеличивается вдвое по отношению к минимальному и составляет 2/Я, то рассмотренные выше условия следует записать в виде [c.230]

Вторая иммунохимическая стадия анализа включает взаимодействие меченых антивидовых антител со специфическим комплексом антиген — антитело, сформированном на носителе. Основные требования к этой реакции аналогичны рассмотренной ранее второй стадии сэндвич -метода анализа. Очевидно, что оптимальными являются условия, обеспечивающие линейную пропорциональность между концентрациями специфических антител в комплексе (которая изменяется от нуля до значения концентрации иммобилизованного антигена) и связавшихся с ними меченых антивидовых антител при минимальном фоновом сигнале. [c.254]

К сожалению, метод определения групп крови с помощью реакции антиген — антитело исключает возможность выполнения требования 4 методологической программы, потому что обнаружение локуса, определяющего данное вещество группы крови, целиком зависит от существования у него какого-то отличия от других таких веществ. Всего обнаружено 33 гена, кодирующих группы крови, потому что был известен по крайней мере один вариант для каждого гена. А сколько существует генов, для которых не обнаружено вариантов Поскольку выявление той или иной группы крови зависит от изменчивости антигенов в пределах данной группы, мы этого знать не можем. И вновь мы убеждаемся, что методологическая программа предъявляет слишком строгие требования. [c.108]

Это наиболее старая и хорошо изученная группа ФАП с собственной активностью. К ней относятся противошоковые кровезаменители ( плазмозаменители по зарубежной номенклатуре) и кровезаменители дезинтоксикационного действия. Противошоковые кровезаменители предназначены для поддержания необходимого объема циркулирующей крови и ее осмотического давления в течение времени, достаточного для физиологического восстановления кровопотери (обычно 1—2 сут). После этого полимер должен быть полностью выведен из организма. Разовая доза таких ФАП весьма велика — до 100 г, поэтому требования к отсутствию токсичности и антигенности полимеров, используемых как кровезаменители, очень высоки. [c.12]

Ключевым фактором успешного развития СВО-приборов для иммуноанализа является иммобилизация одного из компонентов иммунохимической пары на поверхности ЭВО. Методика иммобилизации должна не только удовлетворять таким требованиям, как воспроизводимость, захват большого количества белка, сохранение иммунохимической активности и устойчивости, но и не вызывать химических или физических изменений на поверхности, которые могли бы приводить к нежелательным оптическим эффектам (например, рассеянию света). Поскольку в большинстве работ по данному вопросу использовали кварц или стекло, мы ограничимся обсуждением только этих материалов. Кроме того, в дальнейшем мы будем рассматривать только иммобилизацию белков. На поверхностях ЭВО можно иммобилизовать и многие антигены небелковой природы. Для этого используют химические реакции, пригодные лишь для определенных соединений, поэтому здесь мы их также не будем обсуждать. Отметим, однако, один из подходов к решению данной проблемы, состоящей в том, что на ЭВО наносят белок (например, бычий сывороточный альбумин), с которым затем связывают его небелковый антиген [24]. [c.528]

Третье требование, предъявляемое к вакцинам, — стандартность. Все ампулы соответствующей серии должны содержать одинаковое количество вакцины и обладать одинаковой или очень близкой антигенностью и иммуногенностью. [c.577]

Применение ионитов в других областях биологии дает некоторые йерспективы использования их в промышленности для улучшения процессов или качества продукта. С помощью ионитов удается осадить коллоидные. примеси из растворов бактериальных антигенов и токсоидов. Таким способом с изменением ионной силы или pH растворов при деионизации или реакциях ионного обмена очищены антиген стафилококка и тетанус или токсоид дифтерии [681. Для замещения высоких концентраций сульфата аммония физиологическими концентрациями. хлорида натрия при изготовлении антитоксина дифтерии использовалась комбинация диализа и ионообмена со смесью ионитов в натриевой и хлоридной формах [17]. С помощью ионитов определены требования к содержанию ионов металлов для роста бактерий [c.622]

Иммунометрическне. Вторая группа методов — иммунометрические, основана на принципе сэндвич -анализа. Особенность этих методов заключается в том, что на твердой фазе иммобилизован избыток антител, с которыми проводят инкубацию антигена. После удаления несвязавшихся компонентов в систему добавляют избыток меченых антител, которые взаимодействуют с антигеном. Очевидно, этот метод применим только к поливалентным антигенам (рис. 24, а). Чувствительность и точность иммунометри-ческих методов принципиально существенно выше конкурентных, так как используя избыток антител на твердой фазе, можно адсорбировать из раствора сколь угодно малое количество антигена, а затем избытком меченых антител определить его содержание. Кроме того, в этом случае гораздо менее строгие требования к количеству добавляемых компонентов. Чувствительность иммунометрических методов в большей степени зависит от нижнего предела детекции маркера. Однако на практике предельной чувствительности достигнуть трудно в силу того, что при большом избытке первичных и вторичных антител наблюдается значительная иеспецифическая сорбция, которая фактически и лимитирует чувствительность этих методов. Использование моноклональных антител в иммунометрическом анализе очень эффективно, так как, сорбируя на твердой фазе антитела одной специфичности, а проявляя связавшийся с ними антиген мечеными антителами другой специфичности, удается не только повысить избирательность детекции антигена, но и сократить время анализа (рис. 24,6). [c.118]

Микромодификации описанного выше метода [873] были разработаны с целью экономии анткгсыворотки и времени, а также для того, чтобы сделать его более пригодным для использования в повседневной практи-ке. Эти микромодификации вполне удовлетворяют указанным требованиям и лишь немного уступают в точности исходному макроварианту. Правда, число антигенов, выявляемых и количественно определяемых микрометодом на одной пластинке, вероятно, меньше их истинного числа. [c.258]

При наличии всех перечисленных требований к антигену его потенциальная способность к инициации иммунного ответа может остаться нереализованной, если иммунизируемый организм по тем или иным причинам неспособен воспринять чужеродную информацию. Одно из требований к отвечающему организму — это наличие соответствующих генов иммунного ответа (1г-генов). Полиморфизм по 1г-генам определяет неоднозначность ответа различных индивидуумов к одному и тому же антигену. Следует также заметить, что развитие той или иной силы иммунного ответа зависит как от дозы антигена, так и от способа его введения. Низкая доза сильного иммуногена не является гарантом полноценного иммунного ответа даже у тех индивидуумов, которые обладают соответствующим 1г-геном. Способ введения антигена также является ограничивающим фактором для проявления иммуногенности. Так, например, некоторые бактериальные антигены при непосредственном попадании в желудочно-кишечный тракт не способны преодолеть кислотность желудочного сока как естественного барьера. В то же самое время эти же бактерии, введенные непосредственно в кровь, проявляют сильную иммунногенность. Проявление иммуногенных свойств антигена может быть блокировано также врожденным или приобретенным патологическим состоянием самой иммунной системы. Иммунодефищп по тем или иным факторам специфической защиты будет препятствовать проявлению специфических свойств полноценных антигенов. [c.49]

Наибольшее распространение в гетерогенном ИФА среди ферментов, удовлетворяющих перечисленным выше требованиям, получили пероксидаза хрена (КФ 1.11.1.7), щелочная фосфатаза (КФ 3.1.3.1) и р- )-галактозидаза (КФ 3.2.1.23). Все три фермента определяются на уровне пикомолярных концентраций. Наиболее доступной является пероксидаза. Она содержит легко окисляемые перйодатом углеводные остатки, через которые может осуществляться связывание фермента, с антителами или антигенами. В состав субстратной системы для измерения активности пероксидазы фотометрическим способом входят хромогены, дающие при окислении перекисью окрашенные соединения. При работе с большинством из них следует учитывать их канцерогенные и мутагенные свойства и соблюдать осторожность. Каталитическая активность глюкозооксидазы регистрируется с теми же хромогенами, что и пероксидазы, однако чувствительность ее определения по сравнению с пероксидазой несколько ниже. Основным достоинством фермента является полное отсутствие его в плазме крови, что дает возможность использования фермента в гомогенных методах ИФА. [c.64]

Однако чувствительность одностадийной схемы ниже чем двухстадийной, а контакт фермента с анализируемой средой может неблагоприятно отражаться на результатах анализа. Данная схема налагает также дополнительные требования на соотношение концентраций меченых и иммобилизованных антител с целью исключения их конкуренции за связывание с ограниченным числом антигенных детерминант на молекуле антигена. В этой связи целесообразным является использование в-анализе моноклональных антител, специфичных к различным антигенным детерминантам на мдлекуле антигена. Следует подчеркнуть, что данный метод анализа не может быть отнесен к конкурентному типу, так как формирование комплекса антигена с мечеными иди иммобилизованными антителами не [c.88]

Антисыворотки, полученные даже от одного животного, значительно различаются по своей способности связывать антиген. Для сравнительной характеристики и оценки качества антисывороток проводят их тестирование, которое позволяет решить следуюш,ие две важные задачи во-первых, произвести отбор цменно тех сывороток, которые по своим свойствам (специфичности, аффинности, авидности и концентрации присут-ствуюш,их в них специфических антител) удовлетворяют требованиям иммунохимического. анализа во-вторых, осуш,ествить стандартизацию антисывороток при их промышленном. производстве для иммуноферментных наборов. [c.157]

Для высокочувствительных методов ИФА необходимы конъюгаты белок—фермент, в которых белок сохраняет иммунологическую активность и не происходит инактивация фермента. Таким, требованиям наилучшим образом отвечает конъюгат белок — фермент состава 1 1. При увеличении числа молекул фермента сушественно уменьшается иммунологическая активность белка, так как при этом возрастают стерические препятствия для протекания иммунной реакции и увеличивается вероятность того, что фермент окажется связанным с активным центром антитела или антигенной детерминантой антигена. В то же время при уменьшении числа молекул фермента, связанных, с белком, значительно понижается ферментативная активность по сравнению с ростом неспецнфических взаимодействий конъюгата. [c.182]

Основные требования к любой методике иммуноанализа зависят от целей анализа. Так, концентрация определяемого вещества в пробе диктует необходимые чувствительность и диапазон определяемых концентраций. Например, для определения лекарственных препаратов очень высокая чувствительность обычно не нужна, тогда как при определении вирусных и опухолевых антигенов желательна такая чувствительность, какую ни один метод в настоящее время не обеспечивает. Следовательно, при предъявлении требований к конкретной) методике альтернативных методов иммуноанализа необходимо г1режде всего детально рассмотреть соответствующую аналитическую задачу. [c.150]

Основные требования к альтернативным методам иммуноаналиэа. Для минимизации влияния на реакцию антиген-антитело желательно, чтобы метка представляла собой небольшую [c.150]

Следующий этап в истории создания чувствительных методов иммунологического анализа связан с открытием Фарром в 1958 г. [13] и Яллоу и Берсоном в 1960 г. [14] технологии мечения антигенов, антител и небольших пептидных гормонов радиоизотопами. Радиоиммунологический анализ позволил определять чрезвычайно малые концентрации (вплоть до пмоль/л) таких молекул, как инсулин, и выдвинул новые специальные требования к технологии получения антисывороток. Для иммунизации животных стали использоваться конъюгаты гаптенов (гормонов) с молекулами-носителями. Именно этим способом удалось получить антитела с такой степенью специфичности и аффинности, какая раньше никогда не требовалась. [c.13]

Согласно традиционным представлениям, антиген — это молекула, способная вызвать специфический иммунный ответ, который имеет три формы продукцию антител, развитие реакций клеточного иммунитета или состояния толерантности. В более широком смысле антигенами обозначают и смеси молекул, целые микроорганизмы или клетки, используемые в качестве иммунизирующего агента или полидетерминантной мишени для связывания антител в иммунологических тестах. Соответственно эритроциты можно рассматривать ка-к антиген в агглютинирующих тестах. Для того чтобы различать молекулы, индуцирующие образование антител (либо развитие реакций клеточного иммунитета), и молекулы, служащие мишенями для связывания антител, условно используют термин иммуноген для первых и антиген для вторых. Это помогает разделению представлений об иммуногенности и антигенных свойствах молекул, проявляющихся в связывании антител. Для того чтобы быть иммуногенной, молекула должна обладать определенной структурной сложностью (иммуногенностью). Природные иммуногены обычно представляют собой макромолекулы белков или углеводов, либо же их комбинации (в состав которых могут входить и липиды, которые сами по себе, однако, не являются иммуногенными). Мол. масса таких мак-юмолекул превышает 1000 и обычно составляет более 5000. Зысокоиммуногенные молекулы — это те, мол. масса которых обычно превышает 100 000. Иммуногенностью могут обладать и синтетические полипептиды их сополимеры, если они отвечают указанным требованиям. Меньшие по размеру структуры, такие как замещенные ароматические группы, стероиды и пептиды, могут индуцировать специфический иммунный ответ в том случае, если их ковалентно связывают с молекулами-носителями большей мол. массы такие группы проявляют себя как гаптены на сконструированном подобным образом иммуногене. Иммуногенность зависит и от степени родства (или чужеродности) данной молекулы по отношению к иммунизированному виду животного. В данном контексте иммуногенность определяется иммунной системой реципиента. Близ- [c.18]

Для разных целей требуются сыворотки с различными свойствами, поэтому нельзя разработать единый способ иммунизации животных, который бы гарантировал получение продукта, идеально удовлетворяющего всем требованиям. Тем не менее существуют определенные принципы получения антител, которые могут быть приняты за основные правила . Идеальные антисыворотки получают в определенной степени методом проб и ошибок, поскольку каждый иммуноген отличается от других и процесс образования антител у каждого животного имеет свои особенности. Необходимые свойства антисыворотки — это высокий титр в сочетании с высокой средней авид-ностью, а также специфичность. Первые (на которые оказывают влияние различные адъюванты) зависят от достижения баланса между неограниченной стимуляцией антиген-чувстви-тельных клеток в лимфоидных тканях животных при условии персистирования иммуногена, с одной стороны, и от конкуренции между клетками за лимитированное количество антигена таким образом, чтобы отвечали лишь клетки с наибольшей аффинностью,— с другой. Специфичность же критически зависит от чистоты иммувогена, поскольку даже небольшие примеси могут вызвать непропорционально сильное антителообразование. [c.33]

После прохождения экстракта колонку промывают буферным раствором до тех пор, пока поглощение буфера при 280 нм на выходе из колонки не сравняется с поглощением буфера на входе. Основное требование к буферу для отмывания состоит в том, что он не должен элюировать антиген. Однако в ряде случаев целесообразно вести от.мывание в условиях частичной десорбции связанного белка. Например, при очистке антигенов клеточной поверхности авторы сначала промывают колонку трис-буфером с добавлением 0,5% дезоксихолата, а затем точно таким же буфером, содержащим еще и 0,15 М Na l (последний раствор готовят непосредственно перед использованием, поскольку дезоксихолат, оставленный на ночь при 4°С в присутствии Na l, образует гель). Чтобы избавиться от примесей в конечном очищенном препарате, можно использовать для отмывания колонки буферные растворы с более сильными диссоциирующими свойствами. [c.177]

Антиген для реакции Вассермана должен удовлетворять следующим требованиям 1) не вызывать гемолиза эритроци- [c.297]

Негативный контроль должен характеризовать уровень флуоресценции исследуемой пробы в отсутствие специфического взаимодействия реагента с клетками. Такая неспецифическая флуоресценция может возникать как из-за аутофлуоресценции , т. е. флуоресценции самих компонентов клетки, так и вследствие неспецифического связывания реагента. Идеальной контрольной пробой является проба, обработанная таким же способом, как и в опыте, но с использованием реагента, которому каким-то образом придана негативная специфичность. При примененип метода прямого окрашивания хорошим контролем является проба, в которой клетки обрабатывали реагентом, приготовленным на основе антител того же изотипа и содержащим то же количество конъюгированного флуорохрома, что и реагент, используемый в опыте, но обладающим другой специфичностью. Для контроля специфичности окрашивания исследуемых клеток реагентом против одного аллеля маркерного антигена можно обработать этим же реагентом клеточную популяцию мыши, конгенную по другому аллелю этого же антигенного маркера (если такая конгенная линия существует). При использовании непрямого метода к постановке идеальных контро- лей предъявляются такие же требования плюс дополнительный контроль второго (меченного флуорохромом) реагента. [c.352]

Культура непримированных лимфоидных клеток, а priori способных отвечать на антиген, представляется наиболее подходящим инструментом для детального изучения индукции и регуляции гуморального иммунного ответа. Теоретически в такой системе in vitro необходимо использовать культуральную среду точно известного состава и полностью контролировать популяцию культивируемых клеток. Однако на практике в настоящее время не существует систем, которые удовлетворяли бы этим требованиям. [c.337]

ВХОДИТ несколько молекул моновалентных антител, неизбежно ограничивает чувствительность определения до значений, характерных для конкурентных методов. Это обусловлено невозможностью отделения полностью свободных антител от би- или поливалентных антител, у которых хотя бы один из центров связывания остался свободным —и те, и другие будут связываться с сорбентом. В то же время в ряде случаев требования к чувствительности определения антигена таковы, что их вполне удается удовлетворить с использованием немономерных конъюгатов [фермент — моновалентные антитела], особенно при наличии антител с высоким сродством к антигену. В качестве примера можно отметить разработку на основе ИААК чувствительного (нижний предел обнаружения 0,2 нМ) и очень точного (коэффициент вариации меньше 3%) автоматизированного метода определения дигоксина (Leflar et al., 1984). В этом случае для детектирования использовали немономерный конъюгат типа [F(ab )s — р-галактозидаза]. [c.247]

Получение антител с селективным сродством к клеткам-ми-шеням представляет собой серьезную проблему. Развитие гиб-ридомной техники позволяет получать в необходимых количествах антитела к определенным макромолекулам или гаптенам на носителях. Однако выбор высоко специфических антигенов клеток-мишеней достаточно сложен. Антитела к ним должны быть моноспецифичны и проявлять минимальные перекрестные взаимодействия с другими антигенами, доступными для ФАП в ходе его транспорта к органу-мишени. Выполнить это требование трудно. Поэтому, а также по причинам, указанным выше (экранирование иммуноглобулинов полимером, возможная антигенность антител на полимере и т. д.), иммунологическое распознавание, по-видимому, не может стать универсальным средством для целевого транспорта ФАП. [c.53]

Другая причина, вызывающая сложности при создани полных ФАП в соответствии с моделью, описанной в гл. 2 заключается в том, что требования к иммуноглобулину, присое диненному к полимеру-носителю наряду с цитотоксическим группами, противоречивы. С одной стороны, связанные с поли мером антитела должны сохранять способность узнавать сво1 антиген, т. е. иммунологическую активность, а с другой,— онр не должны быть иммуногенны, т. е. не должны вызывать образования антител к ним самим. Пути преодоления этих сложностей пока недостаточно ясны. [c.116]

В свете упомянутых перспектив возникает естественный е прос о токсичности полимерных носителей и об их судьбе организме. Сразу же отметим, что применение описанных вьц липких полиэлектролитов и построенных с их участием искз ственных антигенов не встретит затруднений при иммунизац животных с целью получения соответствующих антисыворот и антител. Проблема иммунизации человека искусственны антигенами нового типа также представляется разрешим( Отсутствие жестких структурно-химических требований к i лимерным носителям для достижения основного иммуноло ческого эффекта позволяет вести широкий поиск с целью уме) шения их побочных эффектов. [c.218]

По чувствительности и селективности амперометрическое детектирование вполне оответствует требованиям иммуноанализа. Этот вопрос обсуждается в опубликован-юм недавно обзоре [34], Прямое электрохимическое определение антитела обычно возможно, поэтому к антителу или антигену (гаптену) пришивают электрохимически ктивную метку. Чаще, однако, в иммуноферментном анализе находят активность )ермента, определяя концентрацию в растворе электроактивного продукта катализи- уемой ферментом реакции. Поскольку в расчете на один моль фермента может случаться за разумное время по меньшей мере моль продукта, имеет место [c.145]

Недавно нами предложен общий механизм ассоциации и диссоциации комплексов типа антитело—антиген или фермент — ингибитор, учитывающий динамические свойства белка и его взаимодействие с водой. В случае иммуноглобулинов считается, что активный центр и другие неполярные полости IgG между вариабельными и константными доменами РаЬ-фрагментов, между субъединицами IgG и между доменами Рс-фрагментов могут скачкообразно переходить из открытого состояния в закрытое и, наоборот, с вытеснением или сорбцией определенного количества воды. Соответствующие изменения свойств воды рассматриваются как переход, близкий к фазовому первого рода (т. е. без изменения свободной энергии, но со скачкообразным изменением энтальпии, энтропии и теплоемкости). Тем самым предполагаются высокая степень упорядоченности молекул воды в открытых белковых полостях и строгие требования к геометрии и свойствам полостей в таком состоянии. Разница в свободных энергиях воды, находящейся в открытой полости в неупорядоченном и квазикристаллическом состоянии, названа кластерфильным взаимодействием (Кяйвяряйнен, 1975а, б). [c.36]

Основным недостатком инактивированных вакцин является то, что они уступают аттенуированным живым вирусам в эффективности индукции Т-клеточного иммунитета. Кроме того, для эффективной индукции гуморального иммунитета необходимо вводить относительно большие дозы инактивированной вакцины с определенной периодичностью, что может приводить с течением времени к аллергизации организма. При инактивации вируса часть антигенов может полностью или частично разрушаться, что также снижает качество вакцины. Следует отметить, что при препаративной наработке патогенных вирусов, предназначенных для получения инактивированных вакцин, предъявляются повышенные требования к обеспечению безопасности как самого персонала, так и окружающей среды, т. е. необходимы дорогостоящие специально оборудованные помещения. [c.434]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология