Элюирование аффинными лигандами

Как указывалось в гл. 2 (рис. 2.1), специфически сорбированный выделяемый фермент может быть освобожден из комплекса с пришитым аффинным лигандом либо при помощи раствора конкурентного ингибитора (биоспецифическое элюирование), либо при изменении среды. Последний метод является более общим как правило, меняют pH или ионную силу раствора. Хотя влияния таких изменений могут иметь сложный характер, Грейвс и Ву [3], выводя закономерности для освобождения фермента с аффинного [c.26]

Другим наиболее часто применяемым методом освобождения фермента из его комплекса со связанным лигандом является элюирование фермента раствором конкурентного ингибитора. При этом основное требование состоит в сохранении значения Кь в ходе процесса элюирования. Уравнения (3.1) и (3.2), описывающие равновесие между ферментом и связанным аффинным лигандом, необходимо дополнить [c.30]

Разновидность количественной аффинной хроматографии — фронтальный анализ [10] он основан на понятии плотности о аффинного лиганда на единицу длины колонки с агарозой. Если / — общая длина колонки с агарозой, а Li — общее количество им мобилизованного лиганда в сорбенте, то о = - г/ - Если аффинный сорбент характеризуется слабым сродством, то раствор фермента в концентрации [ 0] наносится на колонку непрерывно, а для элюирования фермента с колонки необходим объем V. Можно написать следующее уравнение [c.51]

ВЫСОКОЙ концентрацией аффинного лиганда является слишком сильное взаимодействие с выделяемым вешеством, что затрудняет его элюирование. Так, например, тщательный контроль концентрации лиганда имеет решающее значение для выделения глюкокиназы на агарозе со связанной N-(6-аминогексил)-2-амино-2-дез-оксн-D-глюкопиранозой [14] (рис. 5.6). [c.81]

ЭЛЮИРОВАНИЕ КОНКУРЕНТНЫМИ АФФИННЫМИ ЛИГАНДАМИ [c.92]

В методе аффинного элюирования наиболее часто используемыми полимерами являются ионообменники. Если сорбируемая молекула связывается с помощью групп, расположенных в связывающем участке фермента, то любой ионообменник может рассматриваться в качестве аффинного полимера, содержащего Oi6-щие лиганды . Когда образуется комплекс белка со свободным аффинным лигандом, заряженные группы в его связывающих центрах становятся защищенными от взаимодействия с ионообменником. Это защита может быть обусловлена стерическими факторами или, в наиболее благоприятных ситуациях, нейтрализацией противоположными зарядами на аффинном лиганде. Если различия в доступности заряженных групп в ферменте и в комплексе фермент — аффинный лиганд значительны, то фермент [c.160]

Когда сорбированное вещество освобождается от специфического сорбента, следует помнить о влиянии гетерогенности иммобилизованного аффинного лиганда [1]. На рис. 10.10 приведены результаты выделения химотрипсина и трипсина из гомогенатов поджелудочной железы мыши на различных препаратах сефарозы с присоединенным соевым ингибитором трипсина. Если допустить, что различия в условиях элюирования отражают различия в биологической активности, картина элюирования может использоваться для характеристики молекулы. Применимость сорбента, таким образом, зависит от функциональной гомогенности иммобилизованного аффинного лиганда. [c.272]

Условия проведения аффинной хроматографии зависят от природы соединения, которое нужно выделить. Однако существует ряд общих требований, касающихся свойств нерастворимого носителя, выбора типа аффинного лиганда, его связывания с носителем, условий адсорбции и элюирования. [c.7]

Условия адсорбции и элюирования выделяемого соединения зависят от его специфических свойств. Если нужно выделить небольшое количество белка из неочищенной смеси с помощью аффинного лиганда, обладающего высоким сродством, то иногда сочетают обработку в стационарных условиях с элюированием после переноса сорбента в колонку [16]. Если же соединение, которое необходимо выделить, обладает незначительным сродством к специфическому адсорбенту, оно очень часто элюируется из колонки даже без смены буферного раствора. В этом случае получают разбавленный раствор этого соединения. При выделении высокомолекулярных соединений скорость потока жидкости, проходящего через колонку, должна быть достаточно низкой. На адсорбционное равновесие влияет не только число [c.12]

Аффинная хроматография (хроматография по сродству). Основана аффинная хроматография на принципе избирательного взаимодействия белков (или других макромолекул) с закрепленными (иммобилизованными) на носителе специфическими веществами-лигандами, которыми могут быть субстраты или коферменты (когда выделяют какой-либо фермент), антигены (или антитела), гормоны или рецепторы и т. д. Благодаря высокой специфичности белков к иммобилизованному лиганду, связанному с носителем (которым заполняют хроматографическую колонку), присоединяется только один какой-либо белок из смеси. Снятие с колонки этого белка осуществляют элюированием буферными смесями с измененным pH или [c.29]

Особый вид аффинной хроматографии включает использование гидрофобных взаимодействий между доступными гидрофобными центрами белка и гидрофобными лигандами на носителе [31—34]. В этом случае десорбция происходит при уменьшении ионной силы и увеличении pH или при элюировании растворами этиленгликоля и детергентов. [c.110]

В последние годы все более широкое применение в химии углеводов находит важный и относительно новый метод, известный под названием аффинной хроматографии. Этот метод включает использование носителей с лигандами, имеющими значительное сродство к молекулам с определенной стереохимией. Лиганд, который в данном случае представляет собой лектин (гемагглютинирующий гликопротеин), ковалентно присоединяется к нерастворимой матрице, обычно агарозной или полиакриламидной природы. При хроматографии полисахариды или гликопротеины, содержащие группировки, связывающиеся с лектином, удерживаются на подобного рода носителях и таким образом отделяются от других компонентов, которые быстро проходят через колонку. Связанные с носителем соединения далее можно десорбировать путем элюирования колонки раствором низкомолекулярного углевода, содержащего группировку, специфически связывающуюся с лектином. Тот же эффект достигается при изменении pH или ионной силы элюента с тем, чтобы разрушить образовавшийся ранее комплекс адсорбированного соединения с иммобилизованным лектином. [c.34]

Для оценки эффективности аффинной хроматографии су щественное значение имеет выход исследуемого белка на каждой стадии элюирования. В связи с этим все полученные фракции сохраняют до окончания эксперимента. Выход исследуемого белка может варьировать в широком диапазоне. Добавление белка-носителя приводит к увеличению выхода биологически активного материала, но может также повлиять на степень очистки, При вымывании лиганда с сорбента наблюдается уменьшение выхода сорбированного белка или кажущегося выхода выделяемого биологически активного материала. Степень отщепления лиганда оценивают по содержанию лиганда во фракциях, полученных при промывке сорбента до нанесения образца [8], или по отщеплению радиоактивной метки при использовании радиоактивно меченных лигандов. [c.186]

Элюирование из колонки в аффинной хроматографии может вызываться каким-либо растворимым аффиантом, образующим более прочное соединение с выделяемым веществом, чем привитые аффинные лиганды, изменением ионной силы раствора или температуры. В наиболее общем случае элюирование достигается путем изменения pH раствора, приводящего к подавлению диссоциации функциональных групп, ответственных за образование химической связи между сорбатом и сорбентом. Учитывая селективность сорбции, разделение в аффинной хроматографии часто реализуется по простейшей схеме динамической сорбции 1юглощение целевого биологически активного вещества на колонке с удалением в фильтрат несорбируе-мых примесей и его последующее элюирование в виде единственного хроматографического пика. Подобная схема оказывается наиболее удобной при решении препаративных задач. [c.201]

Объем элюирования макромолекулярного вещества прямо пропорционален концентрации аффинного лиганда, связанного с нерастворимым носителем, если концентрация растворимого аффинного лиганда постоянна. Кроме того, он обратно пропорционален концентрации растворимого аффинанта, если концентрация иммобилизованного аффинанта постоянна. Эти зависимости выражаются уравнением [c.45]

МНг-сфероне проводилась в оптимальных условиях, взятых из данных, приведенных на рис. 3.1. Для элюирования использовались растворы антилпзина в различных концентрациях. Концентрация иммобилизованного аффинного лиганда [L], определенная исходя из эффективной емкости колонки, составила 2,6-10 моль/л. Свободный объем V-m, найденный с помощью декстрана 2000, равен 2,1 мл. Константа диссоциации комплекса химотрипсина с [c.50]

Другим примером влияния концентрации аффинного лиганда является аффинная хроматография смеси лактатдегидрогеназы и сывороточного альбумина на N -(6-аминогексил)-5 -АМР — сефарозе [8]. При высоких концентрациях лиганда (1,5 мкмоль 5 -АМР в 1 мл) для элюирования с )ермента необходимо введение NADH ( удар ). При низких концентрациях (0,125 мкмоль 5 -АМР в 1 мл) десорбция фермента достигается просто градиентом концентрации (от О до 1 моль/л) хлорида калия. Дальнейшее уменьшение количества прикрепленного лиганда (0,025 мкмоль 5 -АМР в 1 мл) приводит к прогрессивному увеличению доли лактатдегидрогеназы, элюируемой исходным уравновешивающим буфером даже перед наложением линейного градиента солей. В то же время [c.75]

Геометрия колонок, концентрация и общее содержание аффинного лиганда — вот три основных параметра, которые определяют и связываемость, и емкость носителя. Для систем с высокой аффинностью высота колонки с аффинным сорбентом, содержащим высокие концентрации лиганда, мало влияет связываемость зависит от концентрации аффинанта, а не от высоты колонки. Это имеет практическое значение колонки, содержащие высокие концентрации лиганда, можно использовать для концентрирования разбавленных растворов ферментов. Кроме того, в системах с высокой аффинностью, в которых элюирование адсорбированных макромолекул без денатурации затруднено, разбавление аффинного сорбента немодифицированным гелем или уменьшение концентрации лиганда может способствовать элюированию в более мягких условиях. В некоторых случаях, конечно, фермент различает только концентрацию лиганда в гранулах модифицированного геля, которая, однако, не меняется при разбавлении. В таких случаях трудности элюирования остаются даже после разбавления геля [11]. Для взаимодействий систем с низкой аффинностью очень важна геометрия колонки. Для разделения специфически адсорбированных белков от неадсорбированных наиболее выгодно использовать длинные колонки, а не короткие. [c.80]

Бесконкурентное действие. Если устойчивость тройного комплекса ЕЫ выше, чем двойного Е1, то присутствие свободного ингибитора I уменьшает долю фермента в подвижной фазе и повышает связываемость фермента. Если тройной комплекс ЕЫ менее устойчив, чем двойной ЕЬ, увеличение концентрации свободного аффинного лиганда приведет к элюированию фермента. [c.92]

Таким образом, многие факторы влияют на взаимодействие иммобилизованного лиганда с комплементарной молекулой. Как биоспецифическая, так и небиоспецифическая сорбция основана по сути дела на тех же электростатических и гидрофобных взаимодействиях и их комбинации. Вклад небиоспецифических взаимодействий можно лучше оценить, сопоставляя константы диссоциации комплекса выделяемой макромолекулы с иммобилизованным аффинным лигандом и с тем же лигандом в растворе, используемом для элюирования (гл. 4). Такая характеристика аффинной системы весьма необходима, особенно если аффинная [c.101]

Как это детально показано в разд. 6.3, антитела проявляют высокое сродство соответствующим антигенам и наоборот. Трудности их освобождения из комплексов 0бусл0 Влены именно этим сильным взаимодействием. Использования сильных хаотропных элюентов в иммуноаффинной хроматографии можно избежать путем химической модификации иммобилизованных аффинных лигандов [39]. Например, элюирование антиглюкагоновых антител из колонки с иммобилизованным глюкагоном может быть осуществлено в мягких условиях, если частично нарушить пространственную комплементарность к связывающему участку антитела путем избирательной модификации гормона, например реакцией с 2-окси-5-нитробензилбромидом, тетранитрометаном или перекисью водорода. [c.107]

Другим методом аффинной хроматографии, использующим образование специфического комплекса макромолекулы выделяемого вещества с аффинным лигандом, является биоспецифическое элюирование с неспецифических сорбентов этот метод известен как аффинное элюирование и в некоторых случаях как специфическое элюирование субстратом [54]. В основе метода лежит неспецифичеакое связывание, например, слмеси ферментов полимером, который несет на себе функциональные группы, взаимодействующие с ферментами. Требуемый фермент затем специфически элюируют растворол субстрата, ингибитора или какого-либо другого аффинного лиганда. [c.160]

Наряду с различиями в зарядах фермента и фермент-субстрат-ного комплекса на эффективность элюирования влияют также сила связи между ферментом и ионообменником и сродство фермента к аффинному лиганду. Имеют место взаихмозависимые равновесия фермента Е, связанного с ионообменником 1Е [уравнение (7.1)], н фермента, связанного с лигандом Е в растворе [уравнение (7.2)] [c.161]

Для сорбции лучше всего образец выделяемого вещества растворять непосредственно в буфере, из которого будет производиться сорбция, и, если необходимо, проводить замену состава солей, присутствующих в образце, с помощью диализа или гель-фильтрации. Если вещество, образующее в данных условиях прочный комплекс с иммобилизованным аффинным лигандом, выделяют колоночной хроматографией, то объем образца, вводимого в колонку, может быть любым. Однако, если выделяют аффинной хроматографией вещество с низким сродством к связанному аффинному лиганду, объем наносимого образца не должен превышать 5% удерживаемого объема, для того чтобы предотвратить элюирование выделяемого вещества неадсорбированным материалом. Если выделяют вещество с низким сродством к связанному аффинному лиганду, его элюирование с колонки происходит часто даже без замены буфера. В этом случае выделяемое вещество получают в разбавленном растворе. Для иллюстрации сказанного можно сопоставить хроматографию химотрипсина на сефарозе с присоединенным метиловым эфиром е-аминокапронил-О-триптофана с хроматографией этого же вещества на сефарозе с непосредственно связанным метиловым эфиром О-триитофаиа (рис. 5.4) [8]. Для элюирования химотриисина с нерастворимого носителя, на котором ингибитор укреплен через е-аминокапроновую кислоту в качестве прострапственной группы, необходимо изменение pH, при этом фракция химотрипсина элюируется в виде острого пика. Если ингибитор присоединен непосредственно к нерастворимому носителю, его пространственная доступность понижена, и химотрипсин только замедляет свое движение через колонку. Фермент элюируется в значительно большем объеме, при том же pH, в непосредственной близости к неактивному материалу. [c.264]

Против уравнений, выведенных Данном и Чейкеном [6], Николь и др. [12] высказали возражения. Данн и Чейкен [7] ограничились случаями, когда [Е]//Сь мало, т. е. используется очень низкая концентрация фермента. Другое ограничение касается взаимодействий со слишком низкими Кь- Например, если константа связывания равна 10 моль/л, то рассчитанная константа скорости диссоциации комплекса ЕЬ должна быть очень мала ( 0,042 С ) [7]. Следовательно, элюирование белка должно зависеть от кинетических факторов и не может быть проведено за реальное время опыта. Добавление растворимого лиганда к раствору элюента не должно оказывать влияния на элюирование белка, поскольку диссоциация — мономолекулярный процесс. Такими кинетическими эффектами объясняются наблюдаемые иногда неудачи при элюировании некоторых ферментов с аффинных сорбентов буферными растворами, содержащими сильные ингибиторы. В некоторых случаях белковый ник настолько уширяется, что его нельзя обнаружить. Метод пригоден главным образом для случаев, когда доступны сорбенты, содержащие лиганды со средней силой связывания. В таких случаях система полностью обратима в пределах времени проведения хроматографического опыта. [c.49]

Для упорядоченного механизма иммобилизация лиганда А подвержена обычным ограничениям аффинной хроматографии. Б этом случае иммобилизация лиганда В не приводит к конкурентному сорбенту для комплементарной молекулы исключение составляют случаи, когда лиганд А присутствует в рабочем буферном растворе, в котором наносят фермент на колонку. Таким образом, присутствие лиганда А является необходимым для связывания сорбентом ферментов, поскольку лиганд В связывает двойной комплекс лиганд А — фермент. Это позволяет ввести в хроматографию предварительный отбор — из бирательное связывание, последующее элюирование достигается удалением лиганда А из рабочего буферного раствора. [c.110]

Для выделения различных мембранных структур используется и аффинная хроматография. Принцип этого метода заключается в способности выделяемого вещества специфически связываться с лигандом, пришитым к нерастворимому носителю, при пропускании раствора через матрицу. В качестве последней применяют сефарозы (агарозные гели), активируемые путем связывания различных лигандов кофакторов, ингибиторов, субстратов мембранных белков-ферментов, лектинов в случае выделения гликопротеинов гормонов, бромциана, конканавалина А — соответственно при получении мембран, антител или целых клеток, Элюирование исследуемого вещества осуществляют в условиях диссоциации комплекса лиганд — вещество и сохранения нативной структуры выделяемого соединения. [c.221]

Химическая деградация. Имеются сведения о том, что химическая связь между носителем и пространственной группой или лигандом гидролизуется под действием аминов, например в присутствии триссодержащих буферов. Аффинный сорбент может также разрушаться в кислой среде при элюировании прочно сорбированных белков. [c.183]

Предлагаемое вниманию советского читателя руководство вышло в серии книг, посвященных актуальным методам современной биохимии и родственных областей естествознания. В нем собраны подробные экспериментальные методики, охватывающие практически все аспекты аффинной хроматографии получение, характеристика и применение твердых носителей, активация твердых носителей, иммобилизация на них лигандов различной природы, адсорбция и элюирование, анализ биоспе-цифических адсорбентов, использование аффинной хроматографии в препаративном масштабе и в условиях высокоэффективной хроматографии, количественная характеристика молекулярных взаимодействий, выделение клеток и другие. Хотя как практическое руководство данная книга призвана помочь исследователю прежде всего в экспериментальной работе, каждой главе предпослано небольшое теоретическое вступление. Особую ценность книге придает участие в ее написании ведущих специалистов по аффинной хроматографии из многих стран. [c.5]

Смотреть страницы где упоминается термин Элюирование аффинными лигандами: [c.18] [c.45] [c.49] [c.51] [c.106] [c.116] [c.151] [c.161] [c.164] [c.164] [c.177] [c.260] [c.265] [c.8] [c.182] [c.444] [c.93] [c.101] [c.101] [c.221]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология