Электрофоретическая подвижность массы

Одним из наиболее изученных 4 ферментов, множественность форм которого детально изучена методом гель-электрофореза, является ЛДГ, катализирующая обратимое превращение пировиноградной кислоты в молочную. Пять изоферментов ЛДГ образуются из 4 субъединиц примерно одинакового размера, но двух разных типов. Поскольку Н-протомеры несут более выраженный отрицательный заряд при pH 7,0—9,0, чем М-про-томеры, изофермент, состоящий из 4 субъединиц Н-типа (Н,), при электрофорезе будет мигрировать с наибольщей скоростью в электрическом поле к положительному электроду (аноду). С наименьщей скоростью будет продвигаться к аноду изофермент М в то время как остальные изоферменты будут занимать промежуточные позиции. Следует подчеркнуть, что изоферменты ЛДГ, обладая почти одинаковой ферментативной активностью, различаются некоторыми физико-химическими свойствами молекулярной массой, электрофоретической подвижностью, отнощением к ак- [c.128]

Биологические макромолекулы — белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды — находятся в растворе в виде частиц, которые по своим размерам соответствуют коллоидным частицам. Они несут определенный электрический заряд благодаря наличию групп, способных к электролитической диссоциации. Общий заряд данной частицы определяется прежде всего концентрацией Н+- ионов в среде и может изменяться при ее взаимодействии с ионами малой молекулярной массы или другими макромолекулами. Под действием электрического поля заряженные частицы перемещаются к катоду или аноду в зависимости от знака их суммарного заряда. Такое явление носит название электрофореза. Скорость движения частицы (см/с) при напряженности электрического поля 1 В/см называется электрофоретической подвижностью. Она имеет размерность ом .с- -В , а ее знак совпадает со знаком суммарного заряда. Различия в подвижности частиц служат основой для разделения смесей веществ в аналитических или препаративных целях. Определение подвижности используется также для характеристики вещества, [c.11]

Аппаратура и реактивы. Полиакриламидные гели готовят в виде стержней в стеклянных трубках или в виде пластин последний вариант более удобен при определении молекулярных масс. При электрофорезе в трубках различная электрофоретическая подвижность может быть обусловлена изменениями степени полимеризации геля, а также зависеть от длины слоя геля, условий проведения электрофореза. Техника извлечения геля из трубок разработана детально [35] показано, в частности, что извлечение гелей с концентрацией мономеров более 10% бывает затруднительным. Рекомендации по использованию аппаратуры и меры безопасности при работе с реактивами обсуждаются в разд. 1.2,1.1. [c.28]

Метод является единственным способом прямого определения абсолютной электрофоретической подвижности. Его применяют для веществ с высокой молекулярной массой, которые обладают слабой диффузией. [c.145]

Относительная электрофоретическая подвижность пептидов связана с молекулярной массой следующим соотношением [c.364]

Электрофоретическая подвижность, заряд —д Масса частицы — Д, т [c.32]

НИИ протромбина образуется активный фермент свертывания крови—тромбин . Концентрация протромбина в плазме крови 1,4—2,1 мкмоль/л. Он является гликопротеином, который содержит 11—14% углеводов, включая гексозы, гексозамины и нейраминовую кислоту. По электрофоретической подвижности протромбин относится к а,-глобулинам, имеет мол. массу 68000—70000. Размеры большой и малой осей его молекулы соответственно [c.601]

Чтобы определить относительную молекулярную массу разделенных фрагментов, одновременно проводят электрофорез маркерных макромолекул с известными молекулярными массами. Набор маркеров должен охватывать весь диапазон молекулярных масс в данной системе. Образец маркерных молекул вносят в отдельную лунку, расположенную вблизи одного из краев пластинки (или в две лунки у двух разных краев). Логарифм относительной молекулярной массы маркера линейно связан с его электрофоретической подвижностью Rf — величиной, равной отношению расстояний, пройденных маркерной молекулой и красителем (фронтом растворителя). Построив график зависимости логарифма относительных молекулярных масс маркеров от Кр можно найти относительную молекулярную массу каждого компонента образца. Относительная мол. масса белков измеряется в Дальтонах, двухцепочечных нуклеиновых кислот — в числе пар нуклеотидов, одноцепочечных — в числе нуклеотидов. [c.54]

Молекулы полиэлектролита могуг иметь заряд, который в пределах туннеля не скомпенсирован зарядом противоионов, если радиус туннеля меньше дебаевско-го радиуса экранирования Гд. В таком случае при действии электрического поля макромолекулы полиэлектролита приобретут направленное движение к противоположно заряженному электроду. Это движение, как и движение коллоидных частиц, называется электрофорезом. Электрофорез макромолекул полиэлектролита внутри каналов неподвижной полимерной сетки (геля) называется гель-электрофорезом и является важнейшим методом разделения полиэлектролитов на фракции по их молекулярным массам. Он используется для выделения нужных фракций белков, при медицинской диагностике, идентификации личности по составу ДНК и т. д. Возможности гель-электрофореза основаны на том, что электрофоретическая подвижность макромолекул зависит от их размера, т. е. от молярной массы, контурной длины или числа элементарных звеньев в цепи. Это принципиально отличает гель-электрофорез от обычного электрофореза, поскольку скорость последнего не зависит существенным образом от размера частиц или размера К заряженных клубков (при К гд) в разбавленном растворе. Причины различия в том, что макромолекулы двигаются по извилистым туннелям в матрице геля и поэтому результирующая движущая сила электрофореза действует только на концы молекулярной цепи, тогда как сила сопротивления — на всю цепь. Поэтому чем длиннее цепь, тем меньше ее подвижность. [c.744]

Из предыдущего рассмотрения ясно, что точного уравнения, связывающего электрофоретическую подвижность с молекулярными параметрами, не имеется. В пределах приближения, вытекающего из игнорирования всех членов, кроме первого, в правой части феноменологического уравнения [уравнение (24-4)], и не отличающегося от того, которое было сделано при анализе данных по седиментации и диффузии высокомолекулярных электролитов в солевых растворах, могут быть сделаны два определенных утверждения. а) Подвижность и всегда прямопропорциональна заряду 2-макроиона. б) Подвижность всегда обратно пропорциональна коэффициенту трения, как показывают уравнения (24-6), (24-7) и (24-8), которые все применимы только к сферическим ионам (поскольку в знаменателе стоит выражение бяг] ). Это делает электрофорез могучим средством полуколичественного анализа, которое имеет огромное значение в химии белков. Многие приложения такого подхода являются по своей природе аналитическими и выпадают из плана настоящей книги, но другие, дающие полезную информацию относительно молекулярных свойств, будут здесь кратко описаны. Обсуждение ограничено данными по растворимым белкам, потому что основная масса работ в этой области выполнена на белках. (Пример электрофореза синтетического полиэлектролита будет приведен в разделе 27.) [c.479]

Тип Молекулярная масса го, W Электрофоретическая подвижность, 105 сиЗ. В-1, с-1 Молярное поглощение, 10-4 М-1-см-1 Парциальный удельный объем, мл-1 1 Изоэлектрическая точка Литература [c.564]

В случае РНК, обладающих жесткой вторичной структурой (содержащих одно- и двухцепочечные участки), электрофоретическая подвижность в геле зависит не только от размеров их молекул, но и от их состава и нуклеотидной последовательности. Этот эффект может быть использован в практических целях, особенно при попытке разделить одинаковые по размерам, но различающиеся по нуклеотидному составу виды РНК. В этом случае можно варьировать содержание денатурирующего агента в геле либо даже вообще исключить денатурирующие факторы. С другой стороны, чтобы с помощью гель-электрофореза определить молекулярную массу РНК, необходимо предварительно разрушить ее вторичную структуру. [c.178]

Одно из серьезных ограничений гель-электрофореза как метода выделения специфических фрагментов ДНК заключается в том, что молекулы, имеющие примерно одинаковую массу, но различную нуклеотидную последовательность, обладают, как правило, одинаковой электрофоретической подвижностью. Один из возможных подходов к решению этой проблемы основан на использовании предложенного в работе Фишера и Лермана [115] метода двумерного гель-электрофореза фрагментов ДНК. Сначала смесь фрагментов ДНК разделяют в соответствии с их размерами с помощью обычного гель-электрофореза, а затем в перпендикулярном направлении проводят электрофорез в 4%-ном полиакриламидном геле в градиенте концентрации формамида (от 4 до 30%) и мочевины (от 0,7 до 5,25 М). Разделение проводят при повышенной температуре. В этой методике использован эффект резкого уменьшения электрофоретической подвижности в результате денатурации или плавления части нативной молекулы ДНК. В ходе электрофореза во втором направлении фрагменты ДНК подвергаются воздействию все более жестких денатурирующих условий, и плавление части молекулы двухцепочечной ДНК сопровождается скачкообразным изменением ее подвижности. Связь между подвижностью фрагментов ДНК и их нуклеотидной последовательностью носит сложный характер и до сих пор окончательно не выяснена [115], [c.185]

Значение Рт (электрофоретической подвижности) для рибонуклеиновой кислоты с низкой молекулярной массой [76] и рибосомной рибонуклеиновой кислоты [c.274]

Для шести изопероксидаз растений дурмана была определена молекулярная масса, рассчитанная по относительной электрофоретической подвижности изоэнзимов пероксидазы для семи различных концентраций геля, и построен график зависимости концентрации геля — 100- (log / [c.68]

Вебер и Осборн, [1379] обнаружили, что при электрофорезе в 10%-ном полиакриламидном геле, содержащем 0,1% ДСН, для белков с мол. массой 10 000—70 000 существует линейная зависимость между логарифмом молекулярной массы и электрофоретической подвижностью белков. Для белков с мол. массой порядка 50000—200000 эта зависимость выражается кривой, имеющей слегка гиперболическую форму. Другие авторы [325] [c.219]

Если белки свяжут менее 1,4 г ДСН на 1 г белка, то они не будут иметь формы жесткого стержня и их подвижность в гелях с ДСН будет зависеть не только от молекулярной массы [1138]. Более того, так как белки образуют очень непрочные комплексы с ДСН, между свободными и связанными молекулами детергента происходит быстрый обмен [1170], и электрофоретическая подвижность комплекса становится независимой от концентрации ДСН лишь в том случае, если последняя составляет около 0,1% [664]. Таким образом, ДСН должен обязательно присутствовать в геле, и обычно его используют в концентрации 0,1%. [c.221]

Хотя в составе нуклеиновых кислот имеется некоторое количество основных групп, эти соединения нельзя подвергать электрофорезу в виде катионов, так как при низких значениях pH высокомолекулярные нуклеиновые кислоты нерастворимы в воде. В нейтральной и щелочной средах молекулы нуклеиновых кислот заряжены отрицательно, поскольку их заряд определяется диссоциацией фосфатных групп. Оливера и др. [940] обнаружили, что в этом диапазоне значений pH электрофоретическая подвижность РНК и денатурированной ДНК в свободном растворе не зависит от их молекулярной массы. Такая закономерность объясняется постоянством отношения заряда молекулы к ее массе и указывает на то, что нуклеиновые кислоты невозможно разделить с помощью электрофореза с подвижной границей. [c.368]

Олигонуклеотиды можно разделять путем электрофореза в гелях, содержащих мочевину, при pH 3,5 [296, 1074, 1075]. В этих условиях на электрофоретическую подвижность влияет как длина цепи олигонуклеотида, так и его нуклеотидный состав. Сочетание этого метода с обычным электрофорезом улучшает разделение полинуклеотидов со сравнительно небольшими молекулярными массами. [c.379]

В частицах лиофобных золей всегда содержится компактное ядро, лишенное электрических зарядов. Напротив, в частицах белков и полиэлектролитов подобное ядро отсутствует, и они по всей своей массе несут способные к диссоциации ионогенные группы. В белках ионогенные группы имеют различную химическую природу — кислые карбоксильные, основные амино-группы и др., вследствие чего белки относятся к классу амфотерных электролитов. При крайних рн резко преобладает диссоциация групп одного знака и, например, при рН-2 белковая молекула несет лишь положительные заряды. Однако тот же заряд при кислых рн можно представить, по Бьерруму и Линдер-штрем-Лангу, обусловленным не диссоциацией солеобразных аминогрупп, а адсорбцией Н+-ионов из раствора и подавлением диссоциации СОО -групп на белковой молекуле. При любом предположении белковая молекула при данном pH несет точно определенное число зарядов, а компенсирующие ионы располагаются в растворе с определенной плотностью распределения, что, соответственно, измеряется при помощи кривых титрования и электрофоретической подвижности (см. ниже). [c.105]

Электрофорез в присутствии ДДС-Na (додесилсульфата натрия) позволяет определять молекулярную массу каждого из выделенных белковых компонентов путем сравнения его электрофоретической подвижности с подвижностью белков уже известной молекулярной массы. Фактически ДДС-Na диссоциирует белковые смеси, разрывая все межмолекулярные взаимодействия. Таким образом получают совокупность мономеров, перемещение которых можно сравнивать с перемещением компонентов в смеси уже известных белков, помещенных в те же условия. [c.88]

В процессе изучения нуклеиновых кислот методом электрофореза выяснилось, что на их электрофоретическую подвижность сильно влияет конформация. Фишер и Дингман [384] отметили, что подвижность полинуклеотидов при электрофорезе зависит не только от их размеров, но также от температуры и напряжения, при которых проводится разделение. Они обнаружили также, что поведение одноцепочечных и двухцепочечных молекул нуклеиновых кислот при электрофорезе сильно различается. В то время как для одноцепочечных РНК значение Кт на графиках Фергюсона является функцией молекулярной массы, для двухцепочечных молекул эта величина очень мало зависит от молекулярной массы. Авторы пришли к выводу, что двухцепочечные молекулы мигрируют в геле концом вперед, т. е. в таком положении, при котором лобовое сопротивление невелико. Аналогичные результаты были получены и в другой работе [533] (рис. 124). Недавно Лишанская и Мазовицкий [c.390]

Метод капиллярного электрофореза постоянно совершенствуется. Предложены методы разделения нейтральных молекул, ионов с одинаковой электрофоретической подвижностью. Для этого используют взаимодействия разделяемых компонентов с псевдонеподвижной мицеллярной фазой в буферном электролите (мицеллярная электрокинетическая хроматография). Для повышения чувствительности определения используют дфугие способы де-текпфования флуоресцентное, электрохимическое, масс-спекгрометрическое. [c.255]

Молекула БСА образована из одной полипептидной цепи с ас-симетрией, соответствующей элипсоиду, диаметром 40 и длиной 120 А. Молекулярная масса этого белка составляет 66 700 дальтон [305]. Изоэлектрическая точка его находится в интервале 4,3—4,8 и зависит от метода ее определения [306]. Всего альбумин имеет 180 титруемых зарядов на молекулу, которые определяют его большую электрофоретическую подвижность и степень растворимости [307]. [c.231]

Электрофоретические свойства белка должны изменяться вследствие изменений формы и размеров молекулы, а также вследствие потери заряженных групп при дезаминировании и, возможно, при декарбоксил ировании. Разрыв полипептидной цепи может привести к образованию новых карбоксильных и аминогрупп. Однако природа концевых групп, образующихся при облучении, еще не установлена. Показано, что даже таких малых доз, как 100 р, уже достаточно, чтобы вызвать изменения электрофоретической подвижности [76]. Каррол с сотрудниками [63] не нашли доказательств изменения в отношении заряд — масса в облученном сывороточном альбумине. Гузман [c.228]

Размытость максимума на фо-реграмме указывает на то, что подвижная фракция представляет собой смесь анионов веществ, близких но электрофоретической подвижности, которая определяется химическим строением частиц и отношением заряда к массе [16]. [c.278]

В этом методе электрофореза используется электрофоретическое перемещение макромолекул в среде с градиентом плотности пор геля. Конечный результат — разделение смеси на отдельные компоненты в соответствии с размерами молекул, при этом электрофоретическая подвижность не играет существенной роли. Необходимым условием такого разделения является наличие у исследуемых соединений зарядов одного типа и отличной от нуля электрофоретической подвижности в применяемой среде. Движение веществ от старта постепенно тормозится вследствие уменьшения пор геля, и с увеличением расстояния от старта подвижность макромолекул постепенно уменьшается. При больших молекулярных массах нодвил ность уменьшается почти до нуля. Ограничение подвижности, вызываемое гелем, приводит к фокусированию зон. Для того чтобы подвижность снижалась до нуля, наряду с градиентом концентрации акриламида необходимо наличие градиента степени сшивки геля. Поэтому в новых типах гелей имеется градиент концентраций и полиакриламида, и бисакриламида. На этих гелях можно разде- [c.299]

Электрофоретическая подвижность двухцепочечных ДНК в полиакриламидном или агарозном геле пропорциональна логарифму их молекулярной массы [107]. По вышеизложенным причинам это соотношение справедливо лишь в случае фрагментов со сравнительно низкой молекулярной массой. Для электрофореза обычно используют трис-буфер с низкой ионной силой, доведенный до pH 7—8 путем добавления NaH2P04, борной или уксусной кислоты [107]. Выбор геля определяется размерами фрагментов, которые необходимо разделить. Электрофоретическое разделение фрагментов, содержащих менее 400 пар нуклеотидов, проводят в 2—10%-ных полиакриламидных гелях, фрагменты длиной в 400—1000 пар нуклеотидов разделяют в комбинированных полиакриламид-агарозных гелях, а более длинные фрагменты —в 0,5—1,0%-ных агарозных гелях [107]. Соединения, существенно различающиеся по молекулярной массе, можно разделить в градиенте концентрации полиакриламидного геля [106]. [c.184]

Аллисон И др. [26] показали, что некоторые аномалии в поведении белков при электрофорезе можно отнести за счет присутствия в геле ТЕМЭД, так как это соединение значительно уменьшает электрофоретическую подвижность белков с молекулярной массой ниже 20000. Указанный эффект можно устранить путем предварительного пропускания тока через гель (преэлектрофореза). [c.224]

В обычных условиях (вероналовый буфер, pH 8,6, ионная сила 0,02—0,08) подвижность преципитирующих антител у большинства видов животных практически равна нулю. В действительности, конечно, это не совсем так, поскольку антитела гетерогенны по своей электрофоретической подвижности. И тем не менее для правильного проведения электроиммуноанализа необходимо, чтобы основная масса антител оставалась неподвижной. Такое ограничение суживает пределы применимости метода, так как те антигены, которые в указанных условиях движутся к аноду не намного быстрее, чем антитела, будут давать несимметричные пики, а следовательно, данный метод непригоден для точного определения их количества. [c.251]

При нейтральных и щелочных значениях pH в полинуклеотидах отношение заряда молекулы к ее массе является постоянной величиной [1085, 1087]. Поэтому полинуклеотиды нельзя фракционировать на основе различий в их зарядах [940]. Введение в практику электрофореза поддерживающих сред, обладающих свойствами молекулярного сита, позволяет проводить фракционирование полинуклеотидов в зависимости от размеров их молекул. В ряде работ [778, 857, 1085] было показано, что электрофоретическая подвижность нуклеиновых кислот в полиакриламидном геле обратно пропорциональна их коэффициентам седиментации. Аналогичные данные были получены и при электрофорезе в агаровом геле [498]. Левицки и Сински [762] установили, что электрофоретическая подвижность полинуклеотидов линейно зависит от логарифма коэффициента седиментации (в единицах Сведберга). Поскольку коэффициент седиментации пропорционален квадратному корню из средней молекулярной массы нуклеиновых кислот, должна существовать обратная зависимость между относительной подвижностью и логарифмом молекулярной массы. Этот вывод был подтвержден экспериментальным путем [123, 778, 984, 1099]. [c.390]

Рис. 124. Зависимость электрофоретической подвижности ДНК в агарозном геле от молекулярной массы [533, 534]. Л, Сравнение подвижности одноцепочечных (оц-ДНК) и двухцепочечных (дц-ДНК) в 0,67о-ном геле. Точки для двухцепочечных ДНК показывают положение маркерного красителя, соответствующее половине молекулярной массы ДНК. Были использованы двухцепочечные ДНК следующих фагов Т5 ( ), Р1 ( ), (А) и ЯЬгЬб ( ), Источником одноцепочечных ДНК служили фаги Р1 (О), Хс, (Л), (V) и

Это чуть ниже температуры плавления самой легкоплавкой области во фрагменте ДНК- Двухцепочечная молекула ДНК входит в гель и продвигается в нем со скоростью, пропорциональной ее молекулярной массе. Как только фрагмент достигает участка геля, в котором температура камеры и концентрация денатурирующих веществ создают условия для плавления первой, самой легкоплавкой области (домена), он как бы разветвляется одна часть его остается двухцепочечной, а другая переходит в одноцепочечную форму. Такая разветвленная структура застревает в порах геля, в результате чего ее подвижность снижается. Снижение электрофоретической подвижности молекулы коррелирует с соотношением длин денатурированного и двухцепочечного участков чем длиннее самый легкоплавкий домен, тем сильнее снижается подвижность. Участок геля, в котором молекула ДНК начинает терять скорость, соответствует самым легкоплавким доменам. Если концентрации денатурирующих веществ подобраны правильно, то два фрагмента ДНК, различающиеся лишь одной нуклеотидной заменой и имеющие неодинаковые значения Гт, начнут снижать скорость в различных участках геля, и к концу прохождения через него их легко будет разделить. Ранее считалось, что отделить мутировавшие фрагменты от фрагмента ДНК дикого типа за счет разной степени снижения их подвижности в ДГГЭ можно лишь в том случае, если замены произошли в области с самым низким значением Гт. Однако анализ большого числа образцов ДНК, а также последующие теоретические выкладки показали, что в большинстве случаев метод ДГГЭ дает возможность обнаружить нуклеотидные замены во всех областях плавления, за исключением самых термостабильных [18, 19]. Замены в областях с самой высокой температурой плавления обычно не обнаруживаются, так как по окончании плавления последнего домена ДНК полностью денатурирует, а это приводит к нарушению корреляции между конформацией молекулы и скоростью ее продвижения. Важно помнить, что успех при проведении ДГГЭ с целью разделения мутировавшего фрагмента и фрагмента ДНК дикого типа определяется структурой фрагмента. Она должна быть разветвленной, причем мутации должны приходиться на области, подвергшиеся плавлению. Для увеличения разрешающей способности метода к исследуемому фрагменту ДНК пришивали последовательность с более высокой температурой плавления ДНК, так называемый ОС-зажим . При этом все области плавления фрагмента, включая самую тугоплавкую, становились доступными для анализа [18, 19]. Эти опыты проводили с препаратами ДНК, клонированными в плаз-мидном векторе, содержащем ОС-зажим . Чтобы избежать стадии клонирования, фрагменты с зажимами можно получить в полимеразной цепной реакции (см. разд. 2.3). [c.131]

Подвижность при нулевой концентрации геля должна отвечать истинной электрофоретической подвижности ДСН-белковых комплексов, на которой не сказываются никакие взаимодействия с гелем. Упрощенной теории электрофореза, кратко изложенной выше, достаточно, чтобы мы могли понять, почему и(0) — величина постоянная. Если в ДСН-белковых комплексах весовое содержание ДСН сохраняется на постоянном уровне и можно пренебречь зарадом самого белка, то суммарный заряд Z комплекса прямо пропорционален молекулярной массе и тем самым длине / комплекса, так как последний имеет форму стержня. Коэффициент трения также приблизительно пропорционален массе молекулы это видно из формулы / = бтгг/y pF. Для стержнеобразной молекулы объем гидратированной формы прямо пропорционален ее длине. Фактор формы F можно оценить с помощью уравнения (10.19а) для вытянутых эллипсоидов. При очень больших значениях f In (a/b). Ho отношение осей в случае стержня просто пропорционально [c.304]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология