Протеолитическая модификация

Молекула белка, стабилизированная дисульфидными связями, устойчива к действию денатурирующих агентов и протеолитических ферментов. Поэтому при наличии в исследуемом белке дисульфидных связей необходимыми этапами работы являются их восстановление и последующая модификация или окисление с образованием стабильных производных цистеина. Число дисульфидных связей в белке определяется по разности суммарного содержания остатков цистеина и количества свободных сульфгидрильных групп. [c.75]

Модификация ферментов может приводить к существенным изменениям их эффективности и специфичности. Это часто позволяет составить представление о роли тех или иных участков молекулы фермента в проявлении им каталитических свойств. Можно различать три типа модификаций 1) протеолитическая модификация, т.е. отщепление (или присоединение) определенного фрагмента полипептидной цепи 2) химическая модификация - введение в белок чужеродных фрагментов и группировок и 3) направленный мутагенез - замена одних остатков аминокислот на другие. Последний тип модификаций стал возможен в последнее время в связи с развитием техники рекомбинантных молекул и, несомненно, имеет большое будущее в отношении исследований связи структуры и активности ферментов. [c.195]

Протеолитическая модификация протромбина [c.508]

Активность нейтральной протеиназы проверяли при глубинном культивировании на качалке в течение 30—36 час. Для ферментации использовали среду, измененную А. А. Юлиус [25]. В культуральной жидкости проверяли pH и протеолитическую активность по методу Ансона в модификации, принятой странами — членам СЭВ. [c.146]

В последнее время интенсивно проводятся исследования посттрансляционной модификации пептидов, в ходе которой с высокой селективностью осуществляется синтез пептидной связи, предопределенный конформацией соединяемых олигопептидов. Эта модификация включает два согласованных протеолитических расщепления пептида и последующее соединение концов двух полученных фрагментов. Примером [c.54]

Таким образом, усиление протеолиза при голодании может быть обусловлено как активацией протеолитических ферментов, так и модификацией белков-субстратов, повышающей их чувствительность к действию этих ферментов. Следует отметить, что протеиназы, ответственные за деградацию нормальных клеточных [c.51]

Регуляторные ферменты после модификации химическими или физическими методами часто становятся нечувствительны к аллостерическим эффекторам, сохраняя каталитическую активность. Показана избирательная денатурация аллостерических центров при действии на ферменты ртутьсодержащих реагентов, мочевины, рентгеновских лучей, протеолитических ферментов, растворов с экстремальными значениями ионной силы или pH, при длительном хранении при О— 5 С, замораживании или нагревании. [c.107]

Для проявления в полной мере биологической активности многих рекомбинантных белков требуются посттрансляционные модификации их полипептидных цепей. Оказалось, что клетки насекомых обладают способностью производить большое число таких модификаций, включая гликозилирование, фосфорилирование, ацилирование остатками жирных кислот и амидирование. Рекомбинантные белки могут претерпевать в них адекватный протеолитический процессинг путем удаления сигнальных последовательностей аминокислот и переноситься в соответствующие клеточные компартменты. Были проведены интенсивные исследования механизмов К-гликозилирования в клетках насекомых, которые показали, что хотя оно и происходит, но не соответствует в полной мере таковому клеток млекопитающих. [c.182]

В ряде случаев ферментативная активность изменяется в результате ковалентной модификации молекулы фермента. При процессах одного типа происходит активация неактивного предшественника фермента, зимогена, в результате действия протеолитических ферментов при процессах другого типа осуществляется модификация одного фермента другим, приводящая к ковалентному присоединению к модифицируемому ферменту небольшой группы. [c.277]

Все эти модификации происходят по мере того, как белки движутся от мембраны ЭР через аппарат Гольджи к плазматической мембране клетки [33, 67, 89]. Олигосахаридные модификации происходят в ЭР и аппарате Гольджи. Ацилирование жирными кислотами идет, вероятнее всего, в ЭР, а протеолитическое превращение р62 в Е2 и ЕЗ — в пузырьках Гольджи [6] и, возможно, также в плазматической мембране. Модификации катализируются клеточными ферментами аналогичные посттрансляционные изменения претерпевают невирусные клеточные гликопротеины и секретируемые белки. Как указывалось выше, олигосахариды влияют на конформацию белка. Не исключено, что ацилирование жирными кислотами повышает стабильность белка в мембране и существенно влияет на образование участков взаимодействия между гликопротеинами и нуклеокапсидом или на расположение соответствующих липидов вокруг этих белков [73]. Протеолитическое превраще- [c.356]

В последние годы появляется все больше данных о том, что протеиназы играют важную роль в регуляции клеточного метаболизма. Кроме общего катаболизма белков эти ферменты осуществляют ограниченную протеолитическую модификацию определенных белковых молекул, активирующую или, наоборот, прекращающую их функцию, контролируют экспрессию некоторых генов, процессы спорообразования и прорастания спор, инициируют секрецию внеклеточных белков (А. Я. Стронгин, В. М. Степанов, 1979). Для выполнения регуляторных функций в клетках имеется набор высокоспецифических протеиназ, активность которых, в свою очередь, строго контролируется. [c.50]

Наиболее распространенным белком этой группы является коллаген IV типа, основной структурный белок базальных мембран. В геноме человека имеется шесть локусов, кодирующих шесть различающихся пептидных цепей, из которых строят ся трехцепочечные молекулы коллагена IV. Пептидные цепи коллагена IV не подвергаются протеолитической модификации после секреции и сохраняют концевые глобулярные домены. Чаще всего коллаген IV содержит цепи а (IV) и a2(IV) в составе гетеротримеров [al(IV)]2a2(rV). Взаимодействуя глобулярными С-концевыми доменами, молекулы образуют димеры, а при взаимодействии N-концевыми доменами — тетрамеры (рис. 18.7). Далее к этим взаимодействиям конец в конец добавляются латеральные взаимодействия трехцепочечных спиральных доменов, в том числе с образованием суперспиралей. В результате получается сетевидная трехмерная структура с гексагональными ячейками рамером 170 нм. [c.437]

Неферментные белки — факторы Villa и Va — также образуются из предшественников (факторов VIII и V) путем частичного протеолиза без такой модификации они не могут включаться в мембранные комплексы. Но тканевой фактор в протеолитической модификации не нуждается. [c.508]

После завершения процесса трансляции на рибосомах белки могут претерпевать дальнейшие модификации. Последние различаются по степени сложности от образования дисульфидных мостиков в результате окисления близко расположенных пар тиольных групп и введения в молекулу белка малых групп, таких как гидроксил,. метил, ацетил, карбоксил и фосфат, до присоединения достаточно больших олигосахаридных звеньев. Многие белки, напротив, синтезируются и хранятся в виде биологически неактивных молекул, из которых в результате ограниченной и контролируемой протеолитической деградации образуются ферменты или полииептидные гормоны, [c.543]

Помимо указанного процесса протеолитического удаления сигнального пептида, во многих белках отщепляется начальный N-концевой метионин. Оказалось, что в прокариотических клетках имеются особые ферменты, модифицирующие N-концевые остатки, в частности деформилаза, катализирующая отщепление формильной группы от N-концевого метионина, а также аминопептидазы, катализирующие отщепление не только N-koh-цевого формилметионина (или метионина у эукариот), но, возможно, и других остатков аминокислот с N-конца пептида. Аналогичному так называемому ограниченному постсинтетическому протеолизу подвергаются некоторые пробелки, или проферменты (например, трипсиноген, химотрипсиноген и др.), и предшественники гормонов (например, препроинсулин, пре- 3-липотропин и др.). В ряде случаев наблюдается и С-концевая модификация синтезированного белка. [c.532]

Как известно, участок ДНК, несущий информацию о синтезе индивидуального белка, называется геном, а участок, контролирующий синтез единственной полипептидной цепи и ответственный за него,— цистроном. Следовательно, если белок состоит из нескольких (более одного) полипептидов, то естественно предположить, что в синтезе такого белка должны участвовать несколько (более одного) цистронов. Это не всегда соответствует действительности, особенно если полипептидные цепи идентичны (например, а,- и р -цепи гемоглобина). Если, например, пептидные цепи какой-либо одной белковой молекулы являются неидентичными, то это не всегда означает, что они синтезируются как результат действия разных цистронов. Подобный белок может синтезироваться в виде единственной полипептидной цепи с последующими протеолитическими разрывами в одном или нескольких местах и отщеплением неактивных участков. Типичным примером подобной модификации является гормон инсулин, синтезирующийся в виде единого полипептида препроинсулина, который после ферментативного гидролиза превращается сначала в неактивный предшественник проинсулин, а затем в активный гормон инсулин, содержащий две разных размеров и последовательности полипептидные цепи (см. рис. 1.14). [c.532]

Во время транспорта белка в нем образуются дисульфидные связи, происходят протеолитическое расщепление и другие посттрансляцион-ные модификации, так что в некоторых случаях в среду попадает уже активный белок. Лидерный пептид обеспечивает проникновение белка через цитоплазматическую мембрану и секрецию, при этом сам он отщепляется дрожжевой эндо-протеиназой, узнающей дипептид Lys-Arg. Поз- [c.139]

Все протеолитические ферменты синтезируются в виде неактивных предшественников, называемых зимогенами или проферментами, и таким образом клетки заш ищены от контакта с активной формой фермента и автолиза. Превращение зимогена в активный фермент происходит путем необратимой ковалентной модификации зимогена за счет локалшого протеолиза, т е. разрьша одной или нескольких пептидных связей и отщепления ограниченного числа аминокислотных остатков. Это вызывает конформационные изменения в полипептиде, достаточные для формирования пространственной структуры активного центра фермента. [c.362]

Первым актом ферментативного катализа является связывание субстрата с остатком аминокислоты в каталитическом участке с образованием фермент-субстратного комплекса. Следовательно, боковая цепь этой аминокислоты обладает повышенной реакционной способностью в отношении образования такого комплекса. Так, в эстеразах, фосфорилазах и некоторых протеолитических ферментах избирательно ацилируется или фосфорилируется определенный остаток серина. Такая повышенная рег.кционная способность остатка серина может использоваться для его модификации. Однако комплекс с истинным субстратом неустойчив, он быстро распадается с образованием конечного продукта и свободного фермента. Идентификация аминокислотного остатка активного центра возможна лишь в том случае, если комплекс устойчив при последующем анализе. Для этих целей предпочтительно использовать плохие субстраты, или псевдосубстраты, образующие непродуктивный комплекс, который будет распадаться до конечного продукта с низкой скоростью. [c.367]

Каждый из этих ферментов атакует вполне определенные пептидные связи. Трипсин катализирует гидролиз пептидных связей, карбонильная группа которых принадлежит одной из основных аминокислот, обычно аргинину или лизину. Пепсин и химотрипсин предпочтительно катализируют гидролиз тех пептидных связей, в образовании которых участвуют ароматические аминокислоты, в частности триптофан, тирозин и фенилаланин. Среди протеолитических ферментов наиболее высокой специфичностью обладает трипсин поэтому именно он наиболее подходит для такого рода анализа. Ясно, однако, что при помощи только одного, пусть даже абсолютно специфичного, фермента невозможно определить полную последовательность аминокислот в полипептиде. Если, например, триптическое расщепление полипептида дало пять фрагментов (пептидов), в сумме соответствующих всей цепи, и если даже для каждого из них удалось установить аминокислотную последовательность, то это еще не все требуется узнать, в каком порядке эти пептиды располагались в нативном полипептиде. Чтобы узнать это, необходимо получить другие пептиды, которые перекрывались бы с первыми. Главное преимущество ферментативного гидролиза — специфичность реакции расщепления в отношении природы расщепляемых пептидных связей накладывает в то же время строгое ограничение на применимость этого метода. В идеале желательно было бы, например, иметь возможность расщеплять иногда те пептидные связи, которые в норме трипсином не атакуются, или, наоборот, предохранять от расщепления связи заведомо чувствительные. Недавно были предложены некоторые модификации методики, которые позволяют в какой-то мере решить эту задачу. Так, например, реакция е-аминогруппы лизина с этилтрифтортиоацетатом в слабо щелочном растворе дает блокированный по аминогруппе остаток, пептидная связь которого не атакуется трипсином [c.90]

Сразу же после приготовления смеси в ней определяли величину протеолитической активности (ПА) энзима по методу. Л нсона в модификации ВНИИсинтезбелка (метод ФОЛП). Стабильность энзимов в смесях проверяли ускоренным методо.м [14]. Для этого их выдерживали 15 дней в биологическом термостате при температуре 37° С и относительной влажности 70—80%, что соответствует полугодовому сроку Х)ранения в обычных условиях. Достоверность результатов, полученных с помощью ускоренного метода, была подтверждена опытаими на контрольных образцах тех же смесей, хранившихся в течение 6 месяцев при комнатной температуре. [c.49]

Тем не менее очевидно, что эффективное расщепление углеводов клеточной стенки способствует проникновению протеолитических и амилолитических ферментов. Как свидетельствуют анализы дробины после затирания, в ней вследствие неполного расщепления материалов клеточной стенки и модификации эндосперма остаются неэкст-рагированные крахмал и белки [74]. [c.29]

Большинство рассмотренных до сих пор модификаций белков получают в результате применения общеизвестных химических реакций, аналогичных реакциям аминокислот и пептидов. Часто реакции различных функциональных групп белков констатируют путем сравнения с известными реакциями соответствующих модельных соединений. Многие белки модифицировали путем обработки их протеолитическими ферментами, однако в сущности все эти реакции протекали в направлении гидролитического расщепления и образования продуктов распада. Даже в тех случаях, когда эти последние представляли собой высокомолекулярные соединения с сохранившейся иммунологической активностью (например, продукты разложения иммунных глобулинов папаином или пепсином), имелись доказательства уменьшения молекулярного веса. Однако в последние годы Линдерштрём-Ланг и Отте-сон [148, 149а] открыли уникальный тип белкового превращения, в результате которого образуется модификация яичного альбумина, отличающаяся от природного белка по форме кристаллов, растворимости и электрофоретической подвижности, а также по отсутствию нескольких пептидов, но имеющая почти одинаковый с ним молекулярный вес [1496, в, г]. Изучение превращения [c.331]

Конструирование определенного биологического катализатора ведется с учетом как специфичности белка, так и каталитической активности металлоорганического комплекса. Вот примеры такой модификации, проведенной для получения полусинтетических биоорганических комплексов . Миоглобин кашалота способен связывать кислород, но не обладает биокаталитической активностью. В результате объединения этой биомолекулы с тремя электрон-переносящими комплексами, содержащими рутений, которые связываются с остатками гистидина на поверхности молекул белка, образуется комплекс, способный восстанавливать кислород при одновременном окислении ряда органических субстратов, например аскорбата, со скоростью-почти такой же, как для природной аскорбатоксидазы. В принципе белки можно модифицировать и другими способами. Рассмотрим, например, папаин. Он относится к числу хорошо изученных протеолитических ферментов, для которого определена трехмерная структура. Поблизости от остатка цистеина-25 на поверхности белковой молекулы располагается протяженный желобок, в котором протекает реакция протеолиза. Этот участок может быть алкилирован производным флавина без изменения доступности участка связывания потенциальных субстратов. Такие модифицированные флавопапаины использовались для окисления Ы-алкил-1,4-дигидроникотинамидов, и каталитическая активность некоторых из этих модифицированных белков была существенно выше, чем у природных флавопротеин-ЫАОН-дегидрогеназ. Таким образом удалось создать очень эффективный полусинтетический фермент. Использование флавинов с высокоактивными, находящимися в определенном положении элек-трон-оттягивающими заместителями, возможно, позволит разработать эффективные катализаторы для восстановления никотин-амида. [c.182]

Но, конечно, нет правил без исключений. В природе встречаются белки, вообще не содержащие некоторых из приведенных на рис. 13 аминокислотных остатков, например цистеина. В пепсине, протеолитическом ферменте с молекулярной массой около 35 ООО имеются не два десятка, как этого можно было бы ожидать, а всего лишь две аминогруппы одна в-лизина и одна Л -концевая. Но недостаток одних групп на поверхности белковой молекулы компенсируется другими. В общем, количество функциональных групп в белках, доступных модифицирующим агентам, достаточно велико и, казалось бы, нет особых проблем для ковалентной иммобилизации белковой молекулы с использованием хотя бы одной из этих групп. Тем не менее проблемы существуют и не малые. Дело в том, что в процессе ковалентной иммобилизации должны участвовать только те группы молекулы белка, которые не существенны для его функции (в нашем случае — катализа). С этой позиции попытаемся выявить в белке группы-мишени, наиболее предпочтительные для целей ковалентной иммобилизации. Для этого используем следующие критерии. Во-первых, группы-мишени должны быть высокореакциоиноспо-собными, чтобы по возможности обеспечить избирательность реакции модификации, а также ее протекание в мягких неденатурирующих условиях. Во-вторых, таких групп в белке должно быть достаточно много, чтобы обеспечить широкие возможности для введения новых химических связей в белковую молекулу с регуляцией их числа и локализации и снизить таким образом вероятность модификации активных центров ферментов. Данные о сравнительной реакционной способности и относительному содержанию аминокислотных остатков приведены на рис. 13.. [c.84]

Перед протеолитическим гидролизом большинство белков lieoo-ходимо модифицировать с помощью химических методов. Модификация сводится к расплеплению дисульфидных связей и далее в случае восстановления с последующим алкилированием позволяет получить стабильные производные цистеина. В случае аминоэтилирования модифицированные остатки цистеина служат дополнительными точками для расщепления исследуе-мого белка трипсином и протеазой из А, mellea. Иногда применяют модификацию остатков аспарагиновой кислоты, что также создает дополнительные участки для гидролиза трипсином. [c.142]

АТФ-зависимая модификация белков-субстратов может осуществляться при участии белкового фактора протеолиза — уби-хитина. Этот фактор обнаружен в клетках самого разного происхождения. Предполагается, что в присутствии АТФ ковалентно связываются несколько молекул убихитина с молекулой белка-субстрата. Модифицированный белок становится чувствительным к внутриклеточным протеолитическим ферментам, которые расщепляют его до свободных аминокислот. У бихитин играет при этом каталитическую роль (А. Hershko et al., 1980). Возможно, что действие его зависит от низкомолекулярных эффекторов. [c.51]

Протеазы часто обладают также эстеразной активностью. При ацетилировании в карбоксинептидазе А всего двух тирозиновых остатков наблюдается шестикратное усиление эстеразного действия, протеолитическая же активность фактически утрачивается. Панкреатические рибонуклеазы (РИКазы) подвергали многим химическим модификациям. Интересна димеризация фермента с помощью сшивающего агента диметилсуберимидата. Нативный фермент представляет собой мономер с низкой активностью по отношению к двухцепочечной РНК, однако после сшивки гидролитическое действие фермента на двухцепочечную РНК усиливается в 78 - 440 раз. При сшивке этого фермента в присутствии ингибитора индолпропионовой кислоты у него появляется также эстеразная активность, что предположительно связано с осуществлением сшивки при необычной конформации фермента. [c.109]

Возможность придания белку соверщенно нового типа ферментативной активности путем его химической модификации была реализована лищь в немногих случаях. Стратегия модификации здесь заключается в усилении слабой каталитической активности органической молекулы путем ковалентного связывания ее с белковой цепью, чтобы использовать способность последней связывать субстрат. Один из лучших примеров этого рода-флавопапаин [23]. Папаин представляет собой протеазу растительного происхождения, которая содержит каталитически активную тиольную группу. Обработка папаина бромоизоаллоксазинами приводит к ковалентному присоединению редокс-групп к тиолу [23], как показано на рис. 8.5. Модифицированный таким образом фермент теперь не проявляет протеолитической активности, но зато проявляет оксидазную. Производное папаина, полученное алкилированием цистеинового остатка активного центра, обладает слабой способностью к окислению дитиолов [18] и дигидроникотинамидов [26, 27]. Окисление дитиолов протекает лишь несколько более быстро по сравнению с самим изоаллоксазином обычно скорость реакции возрастала в 4-17 раз при значениях равных 4-21 М с"" [18]. Анализ молекулярных [c.110]

Регуляция экспрессии геиов молеет таклее происходить и па посттрансляционной стадии, иапример при регуляции активности ферментов путем модификации их структуры (аллостериче-ский эффект с. 461) или другими способами. Некоторые ферменты содерлеатся в семенах в неактивной форме (зимогены), но при соответствующей обработке могут переходить в активную форму. Так, из семян гороха были выделены белковые гранулы, из которых после обработки протеолитическим ферментом молено получить глюкозидазу кроме того, в результате обработки фракции частиц из семян салата-латука протеолитическим ферментом трипсином сильно увеличивается активность фосфа-тазы. [c.469]

После синтеза и до того момента, когда вирусные гликопротеины начинают собираться в вирионы, происходит ряд модификаций. Во-первых, модифицируются олигосахаридные цепи, причем их модификация зависит от клетки-хозяина [46]. В белке р62 присутствуют три олигосахаридные цепи, а в белке Е1 SIN две (в белке Е1 SFV только одна олигосахаридная цепь). Эти модификации включают отщепление остатков глюкозы и маннозы и добавление галактозы, N-ацетилглюкозами-на, фукозы и сиаловых кислот [47] (рис. 21.5). Вероятно, они влияют на конформацию гликопротеинов и играют важную роль на начальных стадиях сворачивания белка. И хотя эти изменения могут облегчать транспорт через органеллы, они не необходимы для этого процесса [30], Во-вторых, происходит протеолитическое расщепление гликопротеина р62 с образованием ЕЗ и Е2. Оно осуществляется трипсиноподобной активностью, расщепляющей по связи агринин — серии. В SFV домен ЕЗ остается связанным с гликопротеиновым комплексом, тогда как в SIN он теряется [37]. В-третьих, описаны два типа аци-лирования этих белков. Один состоит в ацетилировании N-концевой аминокислоты р62 [3] второй включает присоединение остатков длинноцепочечных жирных кислот [75], вероятно, в количестве от одного до двух на Е1 и от трех до шести на [c.355]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология